Artículo de método

Un Tejido Combinada 3D Diseñado

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DOI:

10.3791/53885

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6 de abril de 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM), University Hospital Wuerzburg, 2Department of Cardiothoracic Surgery, University Hospital Wuerzburg, 3Department of Bioinformatics, University Wuerzburg, 4Translational Center Wuerzburg, Fraunhofer Institute Interfacial Engineering and Biotechnology IGB

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Presentamos un modelo tridimensional (3D) de cáncer de pulmón basado en un andamiaje biológico de colágeno para estudiar la sensibilidad hacia las terapias dirigidas al cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Demostramos diferentes técnicas de lectura para determinar el índice de proliferación, la apoptosis y el estado de transición epitelio-mesenquimal (EMT). Los datos recopilados se integran en un modelo in silico para la predicción de la sensibilidad a los fármacos.

Resumen

En el presente estudio, se combinaron un modelo de tumor in vitro 3D de pulmón con una en el modelo de silico para optimizar las predicciones de la respuesta al fármaco basado en un fondo mutacional específico. El modelo se genera en un andamio porcino descelularizado que reproduce las características específicas de tejido con respecto a composición de la matriz extracelular y la arquitectura que incluye la membrana basal. Se estandarizó un protocolo que permite la generación de tejido tumoral artificial dentro de los 14 días incluyendo tres días de tratamiento con fármacos. Nuestro artículo proporciona varias descripciones detalladas de 3D ​​técnicas de detección de lectura como la determinación del índice de proliferación Ki67 de tinción, la apoptosis de los sobrenadantes por M30-ELISA y la evaluación de transición epitelial a mesenquimal (EMT), que son herramientas útiles para evaluar la eficacia de compuestos terapéuticos. Hemos podido demostrar comparación con el cultivo 2D una reducción de la proliferación tumoral en nuestro modelo 3D que es related a la situación clínica. A pesar de esta proliferación inferior, el modelo predijo EGFR respuestas de drogas -targeted correctamente de acuerdo con el estado de biomarcadores, como se muestra por comparación de las líneas celulares de carcinoma de pulmón HCC827 (EGFR -mutated, KRAS de tipo salvaje) y A549 (EGFR de tipo salvaje, KRAS - mutado) tratados con gefitinib el inhibidor de la tirosina quinasa (TKI). Para investigar las respuestas de drogas de las células tumorales más avanzados, se indujo EMT por tratamiento a largo plazo con TGF-beta-1 según la evaluación de la vimentina / tinción de inmunofluorescencia pan-citoqueratina. Un flujo-biorreactor fue empleado para ajustar la cultura a las condiciones fisiológicas, lo que mejoró la generación de tejido. Además, se muestra la integración de las respuestas de drogas tras el tratamiento con gefitinib o TGF-beta-1 estimulación - la apoptosis, el índice de proliferación y EMT - en un booleano en el modelo in silico. Además, explicamos cómo las respuestas de drogas de las células tumorales con un fondo de mutación específica y recuentoerstrategies contra la resistencia se pueden predecir. Estamos seguros de que nuestro enfoque en 3D vitro sobre todo con su expansión in silico proporciona un valor adicional para las pruebas de drogas preclínica en condiciones más realistas que en el cultivo de células 2D.

Introducción

La industria farmacéutica se enfrenta a altas tasas de deserción de hasta el 95% en el campo del tratamiento del cáncer en la fase clínica causando enormes costos 1-5. Una razón de este déficit es el hecho de que en la actualidad eficacia de potenciales nuevos compuestos se evaluó en pruebas de detección a gran escala en cultivos de células 2D de líneas celulares de cáncer o en modelos animales. Los modelos animales tienen una complejidad mayor, pero hay diferencias cruciales entre ratones y hombres 6,7. En la última década, los modelos de cáncer en 3D usando diferentes enfoques que se han generado para cerrar la brecha entre la cultura 2D de líneas celulares de cáncer y un complejo de 6,8,9 tumoral in vivo. El impacto de entorno 3D sobre la diferenciación celular y también en la señalización se ha demostrado en varios estudios hace años (por ejemplo., Por Mina Bissell) 10,11. Hoy en día, muchos modelos de cultivo de células en 3D están disponibles, tales como cultivos de esferoides, hidrogeles o chips de microfluidos 12-16. A pesar de que Tsmodelos e mejorar la complejidad en comparación con los sistemas de cultivo 2D convencionales, que en su mayoría carecen de un microambiente del tejido que se sabe que tiene efectos de soporte tumorales y también afecta a la eficacia del fármaco.

Para solucionar este problema, hemos generado un modelo de tumor en 3D basado en un andamio biológico llamado SISmuc (intestino delgado-submucosa + mucosa) que se deriva de un yeyuno porcino descelularizado. De este modo, la arquitectura del tejido y los componentes importantes de la ECM tales como diferentes colágenos, así como la estructura de la membrana basal se conservan 17. Esta característica única es crucial para la generación de modelo de tumor de carcinomas que surgen de epitelio y comprenden alrededor del 80% de los tumores sólidos. Por otra parte, la tasa de proliferación en nuestro modelo de tumor de tejido modificado se reduce en comparación con las tasas artificialmente altos alcanzados en la cultura 2D. Como la proliferación es un parámetro importante en la evaluación de la eficacia del fármaco, las pruebas de drogas está habilitada en nuestro modelo en más similarescondiciones a los tumores in vivo 17.

Con el fin de evaluar el potencial de nuestro modelo para predecir la eficacia del fármaco biomarcador dependiente correctamente, los datos aquí presentes para dos líneas celulares de cáncer de pulmón diferentes que difieren en su estado de EGFR -biomarker. Este estado mutacional ha comenzado a ser determinado de forma rutinaria en pacientes con NSCLC. Tratamientos dirigidos con TKIs como el EGFR gefitinib -inhibidor contra tumores que llevan una activación de demostración mutación de EGFR resultados superiores en comparación con aquellos con quimioterapia basada en platino 18-21.

Hemos establecido varias técnicas de lectura que son relevantes para la evaluación de la eficacia del compuesto. Además, después de TGF-beta-1 estimulación estamos en condiciones de investigar las acciones de compuestos en las células tumorales que se inició el proceso de EMT, que se cree que es un paso importante en la transformación maligna 22,23 y que está conectado a resistan drogasce 24.

El modelo de tumor 3D permiten monitorear las respuestas de células específicas de tratamientos dirigidos a, quimioterapia o combinaciones de fármacos con buenos contrastes. Para mejorar y acelerar el fármaco de selección y para encontrar resistencia, esto se complementa con una simulación en silico. Sobre la base de algunos experimentos, la respuesta del tumor puede ser predicho in silico con respecto al resultado de una amplia gama de fármacos y sus combinaciones.

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Protocolo

1. bidimensional (2D) de Cultivos Celulares

  1. Comercialmente obtener línea de células tumorales HCC827 (DSMZ). Cultura de la línea celular de adenocarcinoma de pulmón HCC827 (EGFR mutado, KRAS de tipo salvaje) en medio RPMI-1640 suplementado con 20% de FCS. Cambiar el medio cada 2 - 3 días. Dividir las células dos veces a la semana. Utilizar las células hasta que se alcanza el paso 20.
  2. Comercialmente obtener A549 línea celular tumoral (DSMZ). Cultura del carcinoma de pulmón línea celular A549 (EGFR de tipo salvaje, KRAS mutado) en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FCS. Realice la cultura como se ha indicado anteriormente. Utilizar las células hasta que se alcanza el paso 20.
  3. Prueba de las células de forma regular (cada 4 - 6 semanas) para contaminaciones tales como contaminaciones micoplasma.
  4. El cultivo de células A549 o HCC827 en cubreobjetos de vidrio
    1. Coloca 1 cubreobjetos de vidrio estéril en cada pocillo de una placa de 24 pocillos utilizando una pinza.
    2. Seed 50.000 células tumorales de las dos líneas celulares en un volumen de 500 l en los pocillos conlos cubreobjetos de vidrio, respectivamente.
    3. Cultivar las células hasta que alcanzan una confluencia del 70% bajo condiciones de cultivo estándar (37 ° C; 5% de CO 2). Durante este tiempo, se aspira el medio de edad con una pipeta Pasteur y añadir 500 l de medio fresco cada 2 - 3 días de cultivo.

2. Generación de Sistemas de ensayo del tumor en un colágeno Andamios Biológica

  1. Estáticas condiciones de cultivo
    1. Generar el descelularizado del intestino delgado-submucosa + mucosa (SISmuc) y fijarlo entre dos anillos de metal, los llamados coronas de células, tal como se describe en una publicación anterior 25.
    2. Seed 100.000 células de cualquiera de las células A549 HCC827 o en un volumen total de 500 l en el lado de los antiguos lumen del intestino fija en coronas celulares.
    3. Permitir que las células tumorales que se adhieran durante 2 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. Añadir 1 ml de medio dentro de la célula y la corona 1 ml externos.
    4. Cultura del tumormodelo bajo condiciones estáticas a 37 ° C, 5% de CO2 en la incubadora durante 14 días. Cambiar medio de cultivo cada 2 - 3 días. Por lo tanto, aspirar el medio utilizando una pipeta Pasteur y pipeta de 1 ml fresco RPMI con la cantidad apropiada de FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) en el interior de la corona de células y 1,5 ml del mismo medio exterior.
  2. Condiciones de cultivo dinámicos
    1. Configurar el sistema de prueba de tumor con la matriz descelularizado el interior de las coronas de células y la siembra de células como se describe en el apartado 2.1.1 a 2.1.3.
    2. Cultura del modelo de tumor en condiciones estáticas 37 ° C, 5% de CO2 en la incubadora durante 3 días.
    3. Montar el biorreactor en autoclave e insertar la cabeza de serie SISmuc según lo publicado previamente 25.
    4. Pipetear 45 ml de RPMI con la cantidad apropiada de FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) en el matraz y conectar el dispositivo de muestreo sin aguja para el sistema de tubos entre el biorreactor y elmatraz de medio.
    5. Coloque el biorreactor en la incubadora, conectarlo a la bomba y la cultura el modelo de tumor durante 14 días adicionales con un constante flujo medio (3 ml / min) a 37 ° C, 5% de CO 2.
    6. Cambiar todo el medio de cultivo después de 7 días. Para ello, mover el biorreactor de la incubadora bajo una campana de flujo laminar. Aspirar el medio en el matraz de medios de comunicación usando una pipeta Pasteur. Levante el biorreactor mientras se aspira para deshacerse del medio en el sistema de tubos. Pipetear 45 ml de medio fresco en el matraz. Coloque el biorreactor de nuevo en la incubadora y conectarlo a la bomba.

3. Tratamiento de la modelo de tumor estática con Gefitinib

  1. Cultura el modelo de tumor tal como se describe en la sección 2.1.
  2. En el día 11 de la cultura, preparar RPMI / FCS con gefitinib 1 M (2,5 ml por cada corona celular). Aspirar el medio de edad de los pozos utilizando una pipeta Pasteur y se añade 1 ml de RPMI preparado / FCS / gefitinib dentro tque corona celular y 1,5 ml del mismo medio exterior.
    NOTA: La solución de la gefitinib descongelado se puede almacenar a 4 ° C durante una semana.
  3. Cambiar el medio el día 13 como se describe en el epígrafe 3.2.

4. Estimulación de el modelo de tumor estática con TGF-beta-1 para EMT inducción

  1. Cultura el modelo de tumor tal como se describe en la sección 2.1.
  2. Al día 3 de cultivo, preparar RPMI / FCS con 2 ng / ml de TGF-beta-1 con el portador (2,5 ml para cada corona celular). Aspirar el medio viejo de los pocillos utilizando una pipeta Pasteur y añadir 1 ml de preparado RPMI / FCS / TGF-beta-1 dentro de la corona de células y 1,5 ml del mismo medio exterior. Cambio de medio suplementado con TGF-beta-1 cada 2 - 3 días hasta 14 días, como se describe en 4.2.

5. Leer-outs

  1. La toma de muestras para las mediciones de ELISA
    1. Tomar muestras de los sobrenadantes de estática (sección 2.1) y (sección 2.2) cultura dinámica duranteel tratamiento con gefitinib (sección 3) en los días 11-14 de la cultura, como se indica en la figura 2. Además, tomar una muestra antes del tratamiento (T0).
    2. Bajo condiciones de cultivo estáticas, tomar 100 muestra l desde el interior de la corona de la célula. Bajo condiciones de cultivo dinámicos, el tornillo de la jeringuilla en el dispositivo de muestreo y tomar 1 ml de medio del sistema de biorreactor. Almacenar todos los sobrenadantes recogidos a -80 ° C hasta que se realice la prueba ELISA.
  2. M30-ELISA para la apoptosis La cuantificación
    1. Para cuantificar la apoptosis en los sobrenadantes de realizar el ensayo de muerte celular de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Permitir que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente antes de realizar el ensayo.
    2. Vórtex todos los reactivos. Disolver la pastilla de lavado en agua desionizada fresca 500 ml. Diluir Conjugado HRP con 9,2 ml de tampón de dilución de conjugado y mezclar. Pipeta de 25 l de patrón o muestra por pocillo.
    3. Añadir 75 l de la diluido HRP conjusolución de puerta por pocillo. Cubrir la placa e incubar en un agitador durante 4 horas a temperatura ambiente. Se lava la placa de forma manual, 5 veces con 250 l de solución de lavado preparada.
    4. Añadir 200 l de 3,3 ', 5,5'-sustrato tetrametilbenzidina (TMB) a cada pocillo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 min. Añadir 50 l de solución de parada a cada pocillo. Agitar la microplaca durante 10 seg y dejar la microplaca durante 5 min antes de leer la absorbancia. Determinar la absorbancia a 450 nm en un lector de microplacas. Se calcula la curva estándar y las concentraciones en las muestras usando un programa adecuado para el manejo de datos de tipo ELISA como origen.
  3. La tinción de la muestra
    1. La fijación, inclusión en parafina y sección de la preparación del modelo 3D
      1. Fijar la SISmuc sembrado con 2,5 ml de paraformaldehído al 4% (PFA) por la corona de células durante 2 horas y incrustarlo en parafina
      2. Preparar 3 micras secciones de tejido para tinción como se publicó anteriormente25.
    2. La fijación de las células cultivadas en condiciones de cultivo 2D
      1. Cuando se alcanza el 70% de confluencia, lavar las células cultivadas en cubreobjetos de vidrio en placas de 24 pocillos una vez con PBS y fijarlas con 500 l 4% PFA / pocillo durante 10 minutos.
      2. Eliminar PFA y almacenar los cubreobjetos de vidrio en la placa de pocillos cubierta con PBS a 4 ° C hasta que se realiza la tinción.
    3. H & E tinción
      1. Tinción de las secciones rehidratadas con hematoxilina / eosina como una tinción visión general de acuerdo con protocolos estándar.
    4. La tinción de inmunofluorescencia del modelo 3D
      1. Para la tinción de inmunofluorescencia, realizar una recuperación de antígeno mediante la colocación de los portaobjetos desparafinados y rehidratados en una cocina de vapor con tampón citrato precalentado (pH 6,0) durante 20 min.
        NOTA: Véase la tabla de materiales y equipos para la preparación de de tampón de citrato.
      2. La transferencia de las diapositivaspara el tampón de lavado (tampón M PBS 0,5 + 0,5% Tween), las secciones de círculo con un lápiz PAP para minimizar el volumen requerido para soluciones de tinción y colocar los portaobjetos en una cámara de humedad.
      3. Bloquear las secciones de tejido con 5% de suero de la especie del huésped de los anticuerpos secundarios utilizados en la subsección 5.3.4.6 de 20 min a TA.
      4. Eliminar el suero de bloqueo golpeando suavemente los portaobjetos con un pañuelo de papel y aplicar el anticuerpo primario a las secciones cercadas en una dilución de acuerdo con las instrucciones del fabricante (de conejo anti Ki67 1: 100, de conejo anti vimentina 1: 100, de ratón anti pan-citoqueratina 1 : 100). Incubar O / N a 4 ° C. Para doble tinción, se deben utilizar anticuerpos primarios de diferentes especies huésped.
      5. lavar con cuidado el anticuerpo no unido con tampón de lavado tres veces durante 5 min.
      6. Para la detección de fijaciones específicas de antígeno-anticuerpo, se aplican anticuerpos secundarios en la dilución 1: 400 a las secciones y se incuba a RT durante 1 hr.
      7. Lavar la UnBanticuerpo ound con tampón de lavado tres veces durante 5 min.
      8. Montar las diapositivas con un medio acuoso que contiene DAPI a contratinción núcleos y deje que se sequen O / N.
    5. La tinción de inmunofluorescencia de las células cultivadas en 2D
      1. Retirar PBS y cubrir los cubreobjetos de vidrio se siembra con 0,2% de Triton-X100 en PBS durante 5 min para la permeabilización. Lavar los cubreobjetos de vidrio con tampón de lavado (tampón M PBS 0,5 + 0,5% Tween) durante 5 min.
      2. Realice los pasos 5.3.4.3 a 5.3.4.7. Ejecutar todos los pasos en la placa de pocillos en una plataforma oscilante y eliminar los reactivos invirtiendo la placa.
      3. Para el montaje, detectar una gota de medio acuoso que contiene DAPI para contrateñir los núcleos sobre un portaobjetos de vidrio sin recubrimiento y transferir la hoja de la cubierta a la misma con las células que se enfrenta el medio de montaje con unas pinzas. Deje que se seque antes de exponer.
  4. Determinación del índice de proliferación
    1. realizar inmunofluorescenciatinción Ki67 en contra de acuerdo con la sección 5.3.4. o 5.3 5.
    2. Tomar imágenes fluorescentes de las secciones de tejido o células cultivadas 2D con un microscopio invertido. Utilizar diferentes filtros para la toma de imágenes de tinciones DAPI y de coloraciones Ki67. Para la cuantificación, usar 10 imágenes de secciones 3D o 5 imágenes de 2D culturas (20 aumentos) de cada condición de las partes que no se solapan de la muestra.
    3. Determinar el número de núcleos y el número de núcleos positivos para Ki67 en 2D
      1. Contar Ki67 positivos núcleos utilizando manualmente el contador de células plug-in del software Fiji 26. Por lo tanto, abrir la imagen y haga clic en "Plugins" → "Analizar" → "Cell Counter". Pulse el botón "Inicializar" y seleccione un tipo de contador. Haga clic en cada núcleo Ki67 positivo. El número de clics se muestra junto al tipo de contador seleccionado.
      2. Para el recuento de células automática del número total de núcleos crear una macro utilizando Fiji 27,28. adjUST la macro para cada línea celular y tinción. Siguiendo, ver un ejemplo de cómo crear una macro.
        1. Iniciar la grabadora de macros. Abra una imagen DAPI y convertirlo a formato de 8 bits haciendo clic en "Imagen" → "Tipo" → "8 bits". Haga clic en "Mejora el contraste", establecer "saturado" como "1" y "normalizar".
        2. Ajuste "máscara de enfoque" para enfocar la imagen. Use un 'radio' de "1" y una "máscara" de "0,60". Haga clic en "umbral de auto", elegir el método de "RenyiEntropy" con "objetos blancos sobre fondo negro 'a binarise la imagen.
        3. Haga clic en "Plugins" → "BioVoxxel" → "características irregulares de las cuencas hidrográficas" con un radio erosión de "5" para separar las células. Haga clic en "Analizar" → "Analizar Partículas" y establecer el "tamaño" a "0,02-Infinito".
          NOTA: El número de partículas / células esse muestra en la tabla de resumen como recuentos.
        4. Haga clic en "Crear" para guardar la macro para el análisis de nuevas imágenes.
    4. Determinar el número de núcleos y el número de núcleos positivos para Ki67 en 3D manualmente como se describe en el apartado 5.4.3.1.
    5. Calcular el índice de proliferación media (PI) de acuerdo con la siguiente fórmula:
      figure-protocol-1
      n = número de imágenes (3D: 10, 2D: 5)

6. En silico Generación Modelo de tumor y Simulación de la Terapia Anti-EGFR en células HCC827

  1. Red de Nueva Generación usando un software de análisis de red
    1. Utilizar diferentes bases de datos conocidos para generar la red tumor basado en las de lectura de parámetros experimentales importantes y el fondo de mutaciones de la línea celular HCC827.
    2. Abra el software de análisis de red 21 para visualizar elred.
      1. Haga clic en "Archivo" → "Nuevo" → "modelos tipo JoVE_tumor '→ haga clic en" OK "para generar una nueva red. Haga clic en "Plaza Primer Norte" → "OK" para visualizar el receptor en una membrana doble. Haga clic en "Protein genérico" para visualizar nodos (= proteínas) como rectángulos → tipo "EGFR" → haga clic en "OK"; repetir esto para cada nodo en la red.
      2. Etiquetar los nodos de la red: Haga clic derecho → "cambio de color y la forma ..." → seleccione para los nodos EGFR y (EGF-EGFR) código de color "255,0,0" (color rojo); Para los nodos de c-MET y código de color (c-MET) "0,255,0" (color verde); para el código de color gefitinib "255,255,0" (color amarillo); para el código de color de PI3K-INH "204204204" (de color gris claro); para el código de color de MEK-INH "102102102" (de color gris oscuro); para todos los demás nodos de la red de seleccionar el código de color4; 255,255,255 "(de color blanco).
      3. Haga clic en "fenotipo" para visualizar los parámetros de lectura que la hexágonos → tipo "proliferación" → haga clic en "Aceptar" → → Haga clic derecho en "Cambio de color y de la forma ..." → seleccione el código de color "255204204" (salmón color); repetir este parámetro para la apoptosis → elige color de código (color violeta) "255,51,204".
      4. Visualizar bordes (= interacciones): Haga clic en "estado de transición" para las activaciones (flechas), Haga clic en "Inhibición" de inhibiciones (flechas romas); repetir esta operación para cada interacción en la red.
    3. Haga clic en "Archivo" → "Guardar como ..." → Tipo 'JoVE_tumor models.xml' → haga clic en "Guardar" para guardar la red de señalización generado como .xml formato.
  2. Simulación in silico usando PLANTILLA
    NOTA: Parte del Equipo representa THe topología de la red como un sistema discreto lógica booleana (AND, OR, NOT) y lleva a cabo un análisis de estado estacionario. El análisis de estado estacionario refleja el equilibrio del sistema y de la responsabilidad sobre los estímulos de señalización (por ejemplo., La aplicación del fármaco o mutación).
    1. Software abierto ESCUADRÓN 17, Haga clic en el archivo 'JoVE_tumor models.xml' "carga de red" → subida. Haga clic en "Ejecutar el análisis":
      NOTA: A continuación, se aplica PLANTILLA función exponencial para interpolar la conectividad de red de Boole, que permite la simulación dinámica del comportamiento de la red a través del tiempo (de color curvas de actividad sigmoide).
    2. Haga clic en "Avanzado" → "perturbadoras" para escribir un protocolo de simulación. Simular la resistencia anti-EGFR: Haga clic en "Editar Protocolo"
      1. Haga clic en "perturbación" → utilizar estándar "initialState = SS-4" (estado estacionario 4) → haga clic en "Agregar" para agregar "nuevo pulso constante '→ Select parámetro "estado" → Seleccionar objetivo "FLIP" → Seleccionar el tiempo "0" → Seleccionar valor "0.4" → Haga clic en "Aceptar".
      2. Repita este: Haga clic en "Añadir" → Seleccionar el parámetro "estado" → Seleccionar objetivo "c-MET" → Seleccionar el tiempo "0" → Seleccionar valor "0.4" → Haga clic en "OK"; Haga clic en "Añadir" → "Estado" Seleccionar el parámetro → Seleccionar objetivo "gefitinib" → Seleccionar el tiempo "0" → Seleccionar el valor "1" → Haga clic en "Aceptar".
      3. Establecer un valor de estado de nodo activo (EGF-EGFR): Haga clic en "activenode" → Haga clic en "Editar" → Seleccionar estado "0.8" → Haga clic en "OK"; para todos los demás nodos: Haga clic en "Editar" → Seleccione el estado "0" → Haga clic en "Aceptar". Haga clic en "Aceptar" para guardar el protocolo.
      4. Mostrar curvas específicas: Ir al panel de "Opciones" → Seleccionar "(EGF-EGFR)", "* (EGF-EGFR)", "* MEK", "caspasas", "(c-MET)", "PI3K", "gefitinib", "apoptosis", "proliferación", "MEK-INH" y "PI3K-INH" para la representación gráfica. Haga clic en "Inicializar" → "Ejecutar" para iniciar una simulación completa de la respuesta del sistema. Haga clic en "Reset" para comenzar una nueva simulación.
    3. Simular PI3K combinado y tratamiento inhibidor de MEK: Haga clic en "Editar Protocolo"
      1. Utilizar el mismo parámetro de nodo como se describe en 6.2.2.1 - 6.2.2.3. Haga clic en "perturbación" → Haga clic en "Añadir" para añadir "nuevo pulso constante" → "Estado" Seleccionar el parámetro → Seleccionar objetivo "PI3K-INH" → Seleccionar el tiempo "0" → Seleccionar el valor "1" → Haga clic en "OK"; Haga clic en "Añadir"añadir "nuevo pulso constante" → "Estado" Seleccionar el parámetro → Seleccionar objetivo "MEK-INH" → Seleccionar el tiempo "0" → Seleccionar el valor "1" → Haga clic en "Aceptar".
      2. Haga clic en "Aceptar" para guardar el protocolo. Ir al panel de "Opciones": Utilizar la misma nodos para la representación gráfica como se describe en 6.2.2.4. Haga clic en "Inicializar" → "Ejecutar" para iniciar una simulación completa de la respuesta del sistema. Haga clic en "Reset" para terminar la simulación.

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Resultados

Sobre la base del andamio SISmuc (Figura 2A a C), se estableció un protocolo de funcionamiento estándar para la generación, la estimulación y el tratamiento de un sistema de prueba tumor 3D (Figura 2D). Este modelo permite la determinación del índice de proliferación y la cuantificación de la apoptosis utilizando M30-ELISA como se muestra en la Figura 1 y la Figura 3, respectivamente. La figura 3 muestra...

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Discusión

Hemos establecido un combinarse in vitro / in silico sistema de prueba de tumor para las predicciones de tratamiento de biomarcadores guiada. El modelo in vitro evalúa diferentes aspectos importantes de acciones compuestas tales como cambios en la proliferación de células tumorales y la apoptosis en un fondo mutacional específico que también se pueden simular in silico 17. A continuación, presentamos el protocolo estandarizado para la generación de modelos 3D del tumor y el ensayo e...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue patrocinada por el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF, BD247 subvención) del Hospital de la Universidad de Würzburg y el programa Bayern Fit (concedida a Heike Walles).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cátedra de Biorreactoresde Ingeniería de Tejidos y Medicina Regenerativa, Wü rzburg (GER)Configuración del biorreactor
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji)Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox
Cell coronasCátedra de Ingeniería de Tejidos y Medicina Regenerativa, Wü rzburg (GER)para el cultivo estático en 3D
CellDesignerhttp://www.celldesigner.org/-Este software se utilizó para dibujar la red.
Solución tampón de citrato (10x)producción propia42 g/L Ácido cítrico monohidratado, 17,6 g/L Pellets de hidróxido de sodio en agua desionizada, pH 6,0, almacenado en RT.
Solución de trabajo tampón de citratoen producciónSolución tampón de citrato al 10% en agua desmineralizada, almacenada en RT.
Ácido cítrico monohidratadoVWR, Darmstadt (GER)1002441000utilizado para el tampón de citrato
CubreobjetosVWR, Darmstadt (GER)631-1339
DAPI Fluoromount-GTMSouthernBiotech, Birmingham (EE. UU.)SBA-0100-20
Bases de datos como KEGG, HPRD y QIAGEN (Genes & Pathways)http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/-Se utilizaron diferentes bases de datos de literatura conocida para generar la topología de red.
Camiseta Luer Lug Style MujerMednet, Mü nster (GER)FTLT-1Configuración del biorreactor
Estilo de rosca Luer hembra con rosca hexagonal de 5/16" a 1/4-28 UNFMednet, Mü nster (GER)SFTLL-J1A Configuración del biorreactor
Suero de becerro fetalBio& VENDER, Feucht (GER)FCS. ADD.0500no inactivado por calor
GefitinibAbsource Diagnostics GmbH, Mü nchen (GER)S1025-100 mg100 mM solución madre con matraz DMSO
Glas (Schott, GER) provisto de conexión de manguera de vidrioWeckert, Kitzingen (GER)a medida
Histofix 4% (Paraformaldehído)Carl Roth, Karlsruhe (GER)P087.1
Acoplamiento de mangueraMednet, Mü nster (GER)CC-9 Configuración debiorreactor
Incubadora para biorreactoresCátedra de Ingeniería de Tejidos y Medicina Regenerativa, Wü rzburg (GER)Configuración del biorreactor
M30 CytoDeathTM ELISAPeviva, Bromma (SWE)10900
Anillo de bloqueo integral Luer machoMednet, Mü nster (GER)MTLL230-J1A Configuración delbiorreactor
Cámara de humedadhecha
Anti Pan-Citoqueratinade ratón Sigma-Aldrich, Múnich (GER)   C2562-2MLClon C-11 + PCK-26 + CY-90 + KS-1A3 +M20+A53-B/A2, utilizado 1/100 para inmunofluorescencia
Válvula Swabable sin Aguja Hembra LuerMednet, Mü nster (GER)NVFMLLPCConfiguración de biorreactor, para muestreo, esterilizada con rayos gamma
Junta tórica MVQ 10 rojo 37 x 3 mmArcus Dichtelemente, Seevetal (GER)21444Junta tórica grande, Configuración del biorreactor
tórica MVQ 70 rojo 27 x 2,5 mmArcus Dichtelemente, Seevetal (GER)19170Junta tórica pequeña, Configuración del biorreactor
Pluma PAPDako, Hamburgo (GER)S002
ParafinaCarl Roth, Karlsruhe (GER)6642.6
Bomba peristálticaIsmatec, Wertheim-Mondfeld (GER)Configuración del biorreactor
Salina tamponada con fosfatoSigma-Aldrich, Múnich (GER)   D8537-6x500ml
Casete de tubo de bombaIsmatec, Wertheim (GER)IS 3710Configuración del biorreactor
Rabbit anti Ki67Abcam, Cambridge (UK)ab16667Clon SP6, utilizado para 1/100 para IF
Rabbit anti VimentinAbcam, Cambridge (UK)ab92547utilizado 1/100 para IF
RPMI-1640 mediumLife technologies, Darmstadt (GER)61870-044cálido en 37 ° C baño de agua antes de usar
Tubo de siliconaCarl Roth GmbH, Karlsruhe (GER)HC66.1Configuración del biorreactor
Hidróxido de sodioSigma-Aldrich, Mü nchen (GER)30620-1KG-Rutilizado para el tampón de citrato
SQUADhttp://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm-Estesoftware se utilizó para realizar las simulaciones semicuantitativas.
Filtro de aire estéril, tamaño de poro 0,2 y micro; mSartorius Stedium Biotech, Gö ttlingen (GER)16596-HYK Configuración delbiorreactor
Jeringa Luer Lok 5 mlBD Biosciences, Heidelberg (GER)309649para la toma de muestras de biorreactor
Placas de prueba de cultivo de tejidos: 6-,          TPP Techno Plastic Products AG de 12, 24 y 96 pocillos, Trasadingen (GER)92006, 92012, 92024, 92048 
Factor de crecimiento transformante-beta 1 (TGF-β 1) con portadorCell Signaling, Frankfurt (GER)8915LCsolución madre en tampón de citrato estéril pH 3.0
Triton X-100Sigma-Aldrich, Mü nchen (GER)X100-1L
Tween-20Sigma-Aldrich, Mü nchen (GER)P7949-500mlpara el tampón de lavado de la tinción inmunofluorescente
propia hecho a medida Junta

Referencias

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