La separación inmunomagnética de Sca1 depósitos de grasa específica<sup&gt; alta</sup&gt; Células Madre derivadas de tejido adiposo (ASC)

Resumen

Presentamos las técnicas necesarias para aislar la fracción vascular estromal (FSV) de los depósitos de tejido adiposo inguinal (subcutáneo) y perigonadal (visceral) de ratón para evaluar su expresión génica y actividad colagenolítica. Este método incluye el enriquecimiento de células madre derivadas de alto tejido adiposo (ASC) Sca1 mediante separación celular inmunomagnética.

Resumen

El aislamiento de células madre derivadas del tejido adiposo (ASCs) es un método importante en el campo de la biología del tejido adiposo, la adipogénesis y la remodelación de la matriz extracelular (MEC). In vivo, el entorno rico en ECM, que consiste en colágenos fibrilares, proporciona un soporte estructural a los tejidos adiposos durante la progresión y regresión de la obesidad. La remodelación fisiológica de la MEC mediada por metaloproteinasas de matriz (MMPs) desempeña un papel importante en la regulación del tamaño y la función del tejido adiposo^1,2. La pérdida de la remodelación fisiológica de la MEC colagenolítica puede conducir a una acumulación excesiva de colágeno (fibrosis tisular), infiltración de macrófagos y, en última instancia, una pérdida de la homeostasis metabólica, incluida la resistencia a la insulina^3,4. Cuando se observa un cambio fenotípico del tejido adiposo en modelos de ratón con genes dirigidos, el aislamiento de las ASC primarias de los depósitos de grasa para estudios in vitro es un enfoque eficaz para definir el papel del gen específico en la regulación de la función de las ASC. A continuación, definimos una separación inmunomagnética de ASCs^altas de Sca1.

Introducción

Antígeno de células 1 (Sca1, o Ly6A / E) del tallo fue identificado por primera vez como un marcador de superficie celular expresada por hematopoyéticas y mesenquimales células ^5,6. La fracción vascular del estroma (SVF) de tejido adiposo obtenido de los depósitos de grasa del ratón es una población heterogénea de células que comprenden de fibroblastos, macrófagos, células endoteliales vasculares, células neuronales y células progenitoras de los adipocitos ^7. Las células progenitoras de los adipocitos o células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) son células no cargadas de lípidos que residen en la matriz extracelular rica en colágeno periva....

Protocolo

Declaración de Ética: La Universidad de Michigan, el Comité de Uso y Cuidado de los Animales (UCUCA) ha aprobado todos los métodos y protocolos, de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Instituto para la Investigación de Animales de Laboratorio, Consejo Superior de Investigaciones Científicas). Los ratones se mantienen en un vivero Universidad de Michigan y se les da acceso libre a comida y agua y se mantuvieron en un ciclo de 12 horas de oscuridad / luz.

1. Preparativos

1. Preparar medios de cultivo primario con DMEM, 10% de FBS, 1 x P / S / G, y 1x antibióticos / antimicóticos. Esto se utiliza....

Resultados

El enriquecimiento de ^altos ASC Sca1 de diferentes almohadillas de grasa.

Las células del estroma vascular aisladas de la grasa SQ pantalla similar a fibroblastos, estiran la forma celular, independientemente del nivel de expresión Sca1 (Figura 1A). Células de ^baja Sca1 ^alta y Sca1 Por otro lado, VIS (derivados de eWAT) demuestran clara diferencia en su forma de la célula. Como.......

Discusión

En este documento se demuestra el aislamiento y separación de células inmunomagnética de ASC murinos de diferentes almohadillas de grasa y su uso para experimentos in vitro. El método presentado es eficaz para el aislamiento rápido de gran número de ASC Sca1-positivo, que es ventajoso con respecto a los técnicamente complejo y costoso aislamiento FACS mediada de ASC ^9,14. A diferencia de FACS, separación celular inmunomagnética no permite el uso de antígeno múltiple para la identificación de una pobl.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tipo 3 Colagenasa	Worthington Bioquímica	LS004182	Digestión tisular
DMEM	Gibco	11965-092	Medio de cultivo con alto contenido de glucosa
Pluma/Estreptococo/Glutamina (100x)	Gibco	10378-016	Antibiótico
anti-anti (100x)	Gibco	15240-062	Antifúngico
FBS	Gibco	16000-044
PBS (1x, pH 7.4)	Gibco	10010-023
Tripsina (0.05%)	Gibco	25300-054
Filtro de células	BD Bioscience	352360	100-μ Filtro de células m
Placas de 60 mm	BD Falcon	353004
Tijeras	FST	14001-12
Tijeras	FST	14091-11	Punta fina y curvada
Pinzas grandes	FST	11000-12
Pinzas finas	Cualquier proveedor
Agujas 25G 5/8"	BD	305122
Agujas 22G 1.5"	BD	305159
tubos cónicos de 15 ml	BD Falcon	352097
tubos cónicos de 50 ml	BD Falcon	352098
Columnas de separación MACS	Miltenyi Biotec	130-042-201
Kit de microesferas Anti-Sca1 (FITC)	Miltenyi Biotec	130-092-529	FITC-anti-Sca1 1º Ab y microesferas anti-FITC 2º Ab
AutoMACS tampón de ejecución	Miltenyi Biotec	130-091-221
Separador MiniMACS	Miltenyi Biotec	130-042-102
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Almohadillas chux azules	Fisher	276-12424
Almohadillas absorbentes	Fisher	19-165-621
Tablero de espuma de poliestireno			Uso de tubos de 50 ml
70% etanol
Isoflurano	Cualquier proveedor
Rata IgG2a Alexa Fluor 647	Invitrogen	R2a21
Rata IgG2a anti-ratón Sca1 Alexa Fluor 647	Invitrogen	MSCA21
Rata IgG2a R-PE	Invitrogen	R2a04
Rata IgG2a anti-ratón F4/80 R-PE	Invitrogen	MF48004
Tubo de fondo redondo	BD Falcon	352058
HBSS (– Ca, – Mg)	Gibco	14175-095
HBSS (+Ca, +Mg)	Gibco	14025-092	Para solución de colagenasa
Colágeno tipo I (2,7 mg/ml en ácido acético de 37 mm	Preparar en casa12
10x MEM	Gibco	11430-030
1 M HEPES	Gibco	15630-080
0.34 N NaOH	Preparar en casa
Cubreobjetos	Corning	2870-22
Alexa Fluor 594 ácido carboxílico, éster de succinimidilo, isómeros mixtos	Invitrogen	A-20004
0.89 M NaHCO3	Gibco	25080-094