Introduction
סרטן הריאות הוא הגורם המוביל למוות מסרטן ברחבי העולם 1. מחקר לתוך מניעה, איתור מוקדם וטיפול של סרטן ריאות הוא מתמשך מרכזי מחקר רבים ברחבי העולם 2,3. במודלים של בעלי חיים כמה לסרטן הריאות פותחו, והם הוכיחו שימושיים לחקר המנגנונים של סרטן ריאות תאים ממוצא, בקביעת הנוכחות של תאי גזע סרטני, ובבחינת אסטרטגיות טיפוליות חדשניות שונות 4. דגמים קודמים הסתמכו על התחלה של גידול נגרם מסרטן זנים רגישים של עכברים 5. התפתחות בנוקאאוט ומודלים עכבר מהונדס בהם סרטן הריאות עולה כתוצאה נגעים גנטי מניפולציות במיוחד השתפרה היכולת שלנו באופן משמעותי לשלוט אינדוקציה הגידול והיבטים לחקות כמה סרטן ריאה אנושית 4. עם זאת, אתגר גדול בשימוש במודלים של בעלי חי סרטן הריאות הוא העדר שיטה בזמן אמתבמדויק לזהות ולנטר את ההופעה ופיתוח של גידולי ריאות עכבר כדי לתעד כל שינוי מאוחר יותר בגדלים שלהם, כגון צמיחה או המשך ההקטנה שלהם בתגובת טיפולים. זה אלץ לחוקרים לנקוט כמה זמן, מאמץ, וטכניקות גוזלות משאבים לזהות את הגידולים, להעריך תוצאות הניסוי שלהם. הנוכחות של וריאציה בין עכבר טמונה בתגובת אינדוקצית גידול מחייבת שימוש של מספר רב של בעלי חיים בכל קבוצת ניסוי כדי להפחית השתנות נתונים. חוסר היכולת להעריך את צמיחת גידול או תגובה לטיפול בזמן האמת אלצה חוקרים להרדים עכברים בעיוורון בזמן נקודות מרובות פרוטוקולי ניסוי ממושכים כדי להבטיח שהם יאספו את הנתונים הנכונים, וכתוצאה מכך הבזבוז של משאבים מן הדגימות שנאספו בנקודות זמן כי הם או מוקדם מדי או מאוחר מדי.
במחקר הנוכחי, שיטה לנצל ג-מיקרו קטן-חיהטומוגרפיה omputed (מיקרו CT) סורק לאיתור ומעקב גידולי ריאה לחיות עכברים הוא הציג. השתמשנו תיאר שלנו לאחרונה Sftpc-rtTA ו Tre-FGF9-ires-egfp פעמיים מהונדס (DT) עכברים לפתח במהירות אדנוקרצינומה ריאות בעקבות אינדוקציה עם דוקסיציקלין 6,7. שימוש מייקרו-CT מאפשר לנו (בין יתר) לכלול עכברים עם מומי ריאות סוטים לפני הגיוס, לאשר פיתוח של גושים סרטניים הבריא לאחר אינדוקציה, ולבחון שינויי גושים סרטניים בתגובת טיפולים ניסיוניים. המתת חסד של עכברים קצה והערכה היסטולוגית אישרו את הדיוק של הערכה בזמן אמת שנערך עם-CT מיקרו. אנו מאמינים כי הטכניקה הזו תסלול את הדרך לביצוע ניסויים טוב מתוכנן תוך שימוש במודלים של בעלי חיים סרטן הריאות תוך חיסכון משאבים יקרי ערך, קיצור זמן תצפית והגדלת דיוק והבנה של תוצאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש של Keio University.
הערה: במחקר זה, השתמשנו Sftpc-rtTA ו Tre-FGF9-ires-egfp DT עכברים שבו אדנוקרצינומה ריאות מפתחת במהירות לאחר אינדוקציה על ידי האכלה צ'או המכיל דוקסיציקלין 6,7. עם זאת, כל נהלי ההערכה ניתן ליישם מודלים עכבריים של סרטן הריאה אחרים.
מתאר ניסוי 1.:
- לזהות את המצב של הריאות על קו הבסיס:
- לפני אינדוקציה הגידול, כאשר העכברים DT הם 8 - 12 שבועות, לבצע את הסריקה מיקרו-CT הראשון (ראו סעיפים 2 ו 3 להלן). זה ממשמש את סריקת בסיס הריאות, מאשר בהעדר הגושים להיוצר באופן נגרם על ידי transgene דולף, ולתעד בהעדר פתולוגיה ריאות קיימת לפני גיוס גידול.
- ליזום אינדוקצית גידול:
- Switch עכברי DT מ ch הרגילow כדי צ'או דוקסיציקלין לגרום גורם הגדילה פיברובלסטים (FGF) ביטוי 9 בתאי השומן וליזום התפתחות גידולים. תן צ'או דוקסיציקלין (200 עמודים לדקה) כרצונך.
- אשר את הפיתוח של גושים סרטניים ריאות עכבר:
- ביצוע סריקה מיקרו-CT לזהות התפתחות של גושים סרטניים לעומת הסריקה מראש אינדוקציה.
- הערכת תגובה לטיפול:
- כדי לבדוק את היכולת של מיקרו-CT כדי לזהות שינויים גושים סרטניים בתגובה טיפול, לנהל את קולטן FGF (FGFR) מעכב AZD4547, ואז לבצע סריקות מיקרו-CT נוספת לאחר 5 ו -10 שבועות.
- הערכת נקודת סיום:
- להרדים כל עכברי הטיפול וביקורת ורקמות תהליך להערכה היסטולוגית (ראה סעיף 6 להלן).
2. עכברי הכנות לקראת רכישת תמונת מייקרו-CT:
- הפעל את הסורק והמחשב מיקרו-CT.
- Click על תוכנה בשם "R_m CT2", ואז ללחוץ על "להתחמם".
- הסר המיטה המדגם שעליו העכבר יוצב מהאולם מיקרו-CT. עוטפים את המיטה בניילון נצמד.
- הגדר את תיבת אינדוקציה הרדמה על ידי הוספת isoflurane כדי מאדה הרדמה עד לרמה ניכרת. הגדר את קצב זרימת isoflurane ב 3 ליטר / דקה.
- פתח את בלון החמצן כדי להפעיל את זרימת החמצן לתוך תיבת האינדוקציה ולהגדיר את קצב הזרימה של 1 ליטר / דקה.
- מניחים את העכבר בתיבת הרדמה אינדוקציה אשר שהוא בהרדמה עמוקה מהיעדרם של תנועה ספונטנית ובתגובה קמצוץ העור (קמצוץ עדין של קפל קטן של העור, אשר אינו גורם נזק לרקמות או הפסקה העור).
- החל סיכה עינית למניעת יובש קרני במהלך הרדמה.
- פתח את תא מיקרו-CT ומניחים את העכבר עם הצד הגבי על המיטה מדגם. להחזיק את הראש של העכבר ולמשוך את הגוף כלפי מטה מן הגפיים התחתונים ב יורדr למתוח וליישר את הגוף באופן סימטרי.
- כבה את זרימת הרדמה אל תיבת אינדוקציה ולהדליק אותו לכיוון הצינור המתחבר לתא מיקרו-CT.
- מניח את צינור ההרדמה לתוך האף של העכבר כדי לנהל הרדמה רציפה.
- על מנת לתקן את העכבר בעמדה; לעטוף את העכבר והמיטה מדגם בניילון נצמד.
הערה: זה קריטי כדי לשמור על העכבר בהרדמה עמוקה עטוף למיטה המדגמת כי כל תנועה קלה או טוויסט של הגוף שלה במהלך הסריקה תגרום תמונות מעורפלות וקושי הפרשנות. - סגור את תא מיקרו-CT.
- התאם את מערכת מיקרו CT עד 90 קילו ו -160 מיקרו-אמפר ואת זמן הסריקה ל -4.5 דקות. הגדר את טווח התמונה 24 × 19 מ"מ ואת גודל voxel 50 × 50 × 50 מיקרומטר. השתמש במצב סינכרוני עבור פעימות לב.
- צור תיקייה חדשה במסד הנתונים "" כדי לשמור את התמונות חדשות בתיקייה זו.
- התחל את הסריקה.
- לאחר השלמת הסריקה, להזיז את העכבר לתוך כלוב ריק ולבחון אותו עד שהוא חוזר להכרה. אין לשים אותה עם עכברים אחרים עד שהוא התאושש לחלוטין מהשפעות ההרדמה.
3. ויזואליזציה תמונה טרום אינדוקציה מיקרו-CT וניתוח:
- כדי להמחיש את התמונות מיקרו-CT, להוריד את התוכנה ImageJ בחינם מאתר האינטרנט הבא: http://imagej.nih.gov/ij/ . הערה: כל קובץ נתונים מיקרו-CT הוא ערימה של כ 500 קבצי TIF (.tif). תוכנה להצגת תמונות אחרת יכולה לשמש גם.
- פתח את קבצי התמונות מיקרו-CT סדרתי לגלול את כל התמונות של כל עכבר מהצוואר אל הבטן או להיפך.
- באמצעות סריקות של עכברי-בר נאיבי, לזהות את הצפיפות של אזורים שונים ומבנים אנטומיים נורמלים בחזה המבוסס על ידע של אנטומיה עכבר (ראה איור 1 א).
- החזק את הסמן עםעכבר המחשב לגלול מעלה, החל מן הקרביים לבנבן הבטן והסרעפת, דרך החזה עד הצוואר.
- זהה את ציוני הדרך כלוב החזה הגרמי (עצם החזה מלפנים, החוליות בגב ובצלעות בצדדים).
- זהה את הלב בחלק הקדמי של החזה ואת כלי הדם הגדולים ליד הלב ובסופו של חלל החזה.
- שימו לומן קנה הנשימה (כמו עיגול כהה קטן ברמה של הצוואר והחזה העליון), אשר מתפצל ימינה הסמפונות הבכירים עזבו אז ממשיכים להסתעף לתוך הסמפונות ומצטמק. שים לב שכל הסמפונות קשורה קשר הדוק עם כלי דם שניים או שלושה (איור 1 א).
- התחל בחינת הסריקות של עכברי un-induced DT ולזהות את הנוכחות של כל חריגות.
- אל תכלול עכברים עם צללי ריאות טרם גיוס חריגים (למשל, גושים, בולות emphysematous, וכו ') מכל ניסויים נוספים. (תרשים 1C-E, G, H
אינדוקציה גידול 4.:
- כדי לגרום להתפתחות גידולים בעכברים הניסיונות הראתה סריקות ריאות נורמליות, לעבור את מזונם צ'או צ'או סדיר דוקסיציקלין המכיל (200 עמודים לדקה).
5. סריקות מעקב:
- לאחר 10 שבועות, לבצע סריקה מיקרו-CT השני של כל העכברים כדי לאשר את הפיתוח של גושים סרטניים הריאות שלהם (ראה איור 2).
- פיצול עכברים לשתי קבוצות. לנהל את AZD4547 חוסם FGFR (125 מיקרוגרם / קילו / היום באמצעות צינור קיבה במשך 6 ימים / שבוע במשך 10 שבועות) לקבוצה אחת ופלצבו לקבוצת הביקורת האחרת במשך 10 שבועות נוספים.
- בצע את השינויים בין צללי קשרים ידי ביצוע סריקה שלישית 4 - כעבור 5 שבועות.
- בסוף 10 שבועות של טיפול, לבצע סריקה רביעית.
- להרדים כל העכברים עם משאיפת CO 2 או עם זריקה intraperitoneal של 0.1 מ"ג / 200 μl של pentobarbital.
- ללזהות את השינויים הדינמיים הגושים הסרטניים לאחר אינדוקציה בתגובה לטיפול, לזהות עמדות דומות בתוך לסרוק תמונות סדרתי של אותה העכבר שונה שתיים או יותר נקודות זמן ואז לבדוק את המראה / היעלמות כל צללים נורמלים (איור 3 ).
- כדי להקל על זיהוי של אותו המישור באותו עכבר בזמן נקודות שונות, לנסות לשייך את מטוס עניינים עם מבני ציון דרך אנטומי בתוך חזה העכבר.
- להשתמש בציוני דרך כגון קנה נשימה, ההסתעפות שלה, ימין הסמפונות בכירים עזבו, אב עורקים, סרעפת, וכלי דם גדולים.
הערה: עצמות חזה, כוללים חוליות בית החזה, צלעות, ועצם החזה הן פחות שימושיות כציונים דרך מיצוב בגלל ומטה קטין נפוץ יישור גוף עכבר על המיטה המדגמת, המגדילים את האפשרות של פרשנות שגויה של עמדת הסריקה. באופן דומה, את המספר הסידורי תמונה בתוך קובץ הסריקה אינו מהימן עבור identifyinז באותה תנוחה לאורך זמן בגלל השינוי באורך גוף העכבר מ-נקודת זמן אחת לאחרת. אי או אי דיוק בזיהוי באותו מישור בנקודות זמן שונות עלול לגרום פרשנות חיובית / שלילית שגויה של הממצאים.
- להשתמש בציוני דרך כגון קנה נשימה, ההסתעפות שלה, ימין הסמפונות בכירים עזבו, אב עורקים, סרעפת, וכלי דם גדולים.
6. עכבר המתת חסד ריאות אוסף:
- להרדים עכברים עם שאיפת CO 2 או עם זריקה intraperitoneal של 0.1 מ"ג / 200 μl של pentobarbital.
- לחשוף את הקרביים בטן ידי חיתוך אורכי דרך דופן הבטן. Bleed בעכבר כדי להפחית את נפח הדם של הריאות על ידי לנתח את אבי העורקים בבטן.
- חותכים את הסרעפת עם מספריים בסדר; זו תגרום לאובדן של לחץ שלילי מחלל החזה, ובכך ממוטט את הריאות. לחשוף את הריאות והלב על ידי חיתוך והסרת חלקים של הצלעות של דופן בית החזה הקדמי. נקה את החלק הקדמי של הצוואר על ידי חיתוך בעור וברקמות רכות לחשוף את קנה הנשימהא.
- לחתוך את הלב ואת בלוטת התימוס. הכנס מלקחיים מאחורי קנה הנשימה כדי להפריד בינו לבין הוושט.
- Cannulate קנה הנשימה עם צינורית G24 ואז לאבטח אותו במקומו על ידי הידוק חוט סביב החלק המוכנס.
- לנפח ולתקן את הריאות באמצעות paraformaldehyde 4% קר כקרח (PFA) דרך צינורית לקנה הנשימה באמצעות טור 25 ס"מ. לנתק את הצינורית להדק את החוט כדי למנוע דליפת PFA ואז לחתוך את קנה הנשימה העליונה את התקשרותו אל הגרון.
- משוך את קנה הנשימה מן החוט תפר לנתח אותו מעיקול שלה, ולהמשיך כלפי מטה כדי להסירו עם ריאות en -block. הכנס אותו לתוך צינור 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של 4% PFA. השאירו את הריאות ב PFA O / N כדי להבטיח חדירה רקמה שלמה קיבעון, ואז לעבד את הרקמה לתוך בלוק פרפין תקן 8.
- חותכים בלוקים פרפין לתוך 6 אום-פרוסות עבות על microtome ואת הכתם עם hematoxylin ו eosin באמצעות טכניקות סטנדרטיות. 7. הערכה היסטולוגית:
- הפעל את המכשיר סורק שקופיות המחשב.
- הקש על תוכנת "סריקת NDP".
- בחר את מצב הסריקה "תצווה של שקופיות" לבין "מצב אוטומטי חצי" לסריקת סדרה של שקופיות.
הערה: זרוע רובוטית כי מרימה את השקופיות במהלך סריקה סדרתית רגיש מאוד חריגות על הקצוות של שקופיות זכוכית. - למשש את הקצוות של כל שקופיות הזכוכית לפני הטעינה אותם למכונית. אם יש בליטה של הזכוכית המכסה או הרכבה בינונית יבש, לנקות אותו בסכין חיתוך או אזמל.
- טען את השקופיות לתוך קלטת שקופיות. פתח את צוהר הדגימה וחלק את הקלטת למקומו "אחד";. סגור את הדלת.
- על תוכנת המחשב, לתת שמות תיאוריים קצרים על כל השקופיות בעמדה שלהם שמופיעים קלטת ולאחר מכן לחץ על הלחצן "אישור".
- בחרו במצב פרופיל: "Brightfield".
- לחץ על "התחל יצווה" כדי להתחיל את הסריקה הזמנית.
הערה: לאחר שהמכשיר כבר סיים לסרוק את כל השקופיות, התוכנה תזהה באזורים אוטומטיים עם רקמות על כל השקופיות ולהציע אותו כאזור של עניין. - במידת הצורך, להגדיר מחדש את האזור של עניין על ידי לחיצה רצופה על כפתור העכבר השמאלי מושך את הגבול באזור.
הערה: הגדרת שטחים גדולים באופן מוגזם של השקופיות כמו האזורים של הריבית יביאו מחזיק מעמד זמן רב סריקה. - לאחר מרוצים האזורים של אינטרסים על כל השקופיות, לחץ על "סרוק" כדי להתחיל לסרוק כל השקופיות.
הערה: הקבצים הסרוקים ניתן לראות דיגיטלית ברזולוציה נמוכה וגבוהה, וניתן לייצא תמונות כמו JPEGקבצים.
הערה: למרות השימוש של "סורק שקופיות" להערכה דיגיטלית היסטולוגית מתואר כאן, השימוש מיקרוסקופי רגילות ערכה היסטולוגית חזותית להערכה הוא גם אפשרי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זיהוי של עכברים עם מומי ריאות בוצע בתחילת המחקר. לפני אינדוקציה הגידול, כאשר העכברים DT היו 8 - 12 שבועות של גיל, הריאות של כל העכברים נסרקו עם-CT מיקרו. באופן מפתיע, כ 50% של עכברים הראו מומים כי הכריחו אותנו רואה אותם מתאימים להכללה במחקר שלאחר מכן. ליקויים אלה היו צללים דמויים גולים, בולות emphysematous קטנות אחד או מספר גדולים ו / או תמט ריאות אוֹנִי (איור 1 א, ג, DE, GH). לאחר מכן, אינדוקצית transgene ואת גידול FGF9 הייתה activated.Only עכברים שהראו סריקות ריאות רגילות (ללא הפרעות) היו משייטת צ'או צ'או סדיר דוקסיציקלין להשרות ביטוי FGF9 ב בתאי שומן ואת התפתחות גידולים שלאחר מכן. כדי לאשר את הפיתוח של גושים סרטניים בריאות עכבר אחרי עשרה שבועות מן ייזום אינדוקצית גידול, מעקב סריקות מייקרו-CT בוצעו. אלה חשפו את ד evelopment של גושים מרובים בגדלים משתנים בכל עכברים (איור 2, להשוות A ל- B ו ד ה). סריקות מיקרו-CT בוצעו כדי להעריך את התגובה לטיפול. עכברים אלו עולה כי כי עברו את AZD4547 FGFR מעכב במשך 10 שבועות אכן הציג היעלמות או הקטנת גודל של גושים שהיו גלויים סריקות לפני תחילת הטיפול (איור 3, להשוות מראש, שלאחר אינדוקציה-טיפולים פוסט, AC , EG ו IK). מצד שני, עכברים שליטה שלא קיבלו מעכב FGFR וניתנו פלצבו במקום לא חל שינוי, עלייה בגודל גושים והמראה של גושים חדשים (איור 3, MO); המאשר כי הירידה בגודל שנצפתה בקבוצת הטיפול הוא השפעה אמיתית של ההתערבות הטיפולית.
-together.within-page = "1"> ערכה היסטולוגית-נקודת סיום של ריאות עכבר מהרגע-בנקודות השונות אשרה את הדיוק של הממצאים זוהו עם סריקת מייקרו-CT. עכברים נאיביים לפני גיוס דוקסיציקלין: עכברים להישפט יש שריאות נקיות על סריקות מייקרו-CT הראו היסטולוגיה ריאות נורמלית. עכברים הראו חריגות על הסריקה היו שינויים היסטולוגית שונים כולל בולות גושים (איור 1 ב ', ו', ט). עכברים לאחר 10 - 12 שבועות של אינדוקציה עם דוקסיציקלין: גושי אדנוקרצינומה מרובים עם גדלי עמדות משתנים נצפו כל בעלי החיים (איור 2 ג, ו). עכברים לאחר 10 - 12 שבועות של אינדוקציה דוקסיציקלין ואחריו 10 - 12 שבועות של חוסם FGFR: גושים היו הרבה פחות מספר קטן יותר (איור 3D, H, L) לעומת נצפתה אלה אינדוקציה פוסט. עכברים לאחר 10 - 12 שבועות של אינדוקציה דוקסיציקלין ואחריו 10 - 12 שבועות של הפלצבו: גושים גדולים מרובים גלויים (איור 3P) דומה אלה לראות בנקודת הזמן שלאחר אינדוקציה.
איור 1. מיקרו-CT מזהה חריגות ריאות טרום אינדוקציה. כל העכברים נבדקו עם מיקרו-CT לפני תחילתו של אינדוקציה דוקסיציקלין. כאשר הפרעות ריאות אותרו, עכברים היו מורדמים לאישור היסטולוגית. לסרוק תמונות מייקרו-CT נציג (א) ריאה נורמלית; (ג) ריאות עם שטח atelectatic; (DE) ריאות עם בולות emphysematous וריאות (GH) עם צל קשר נורמלי. הערכה היסטולוגית אישרו את הדיוק של הממצאים מיקרו-CT: (ב) היסטולוגיה ריאות רגילה; (F) באזורים emphysematous מרובים; ואני) גושים סרטניים מרובים. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר.53904fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מיקרו-CT מזהה את פיתוח גושים סרטניים לאחר אינדוקציה עכברים. שהראה מראש אינדוקציה נקי סריקה הואכלו צ'או דוקסיציקלין במשך 10 שבועות ולאחר מכן העריכו מחדש עם מיקרו-CT, לאחר מכן הם היו מורדמים להערכה היסטולוגית. נציג תמונות הסריקה מיקרו-CT משני עכברים שונים להראות את המראה של צללים קשרי מספר 10 שבועות לאחר תחילת צ'או דוקסיציקלין. (A, D) ריאות נקיות טרום אינדוקציה, (B, E) תמונות הסריקה Same-העמדה מראה התפתחות גושים מרובים (חצים אדומים). חיצים צהובים קטנים מצביעים על ציוני דרך אנטומיים המשמשים לזיהוי באותה תנוחה בנקודות זמן שונות. (C, F) גושים לראות את הסריקה מיקרו-CT ג היוonfirmed בסעיפים היסטולוגית ריאות. סרגל קנה מידה:. 200 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. מייקרו-CT מזהים שינויי גושים סרטניים בתגובה לטיפול. עכברים הראו סריקות מראש אינדוקציה נקיות הואכל צ'או דוקסיציקלין במשך 10 שבועות, ולאחר מכן א-CT מיקרו שלאחר אינדוקציה בוצעה. לאחר מכן, הם עברו את AZD4547 מעכב FGFR במשך 10 שבועות נוספים מחדש העריכו עם מיקרו-CT (שלאחר הטיפול). עכברי מקרה נוהל פלצבו במקום מעכב FGFR להבהיר את ההשפעה בפועל של ההתערבות הטיפולית. לבסוף, העכברים היו מורדמים להערכה היסטולוגית.
נציג תמונות סריקת מייקרו-CT מארבעה עכברים שונים. (A, E, I, M) (B, F, J, N) סריקות מאותו העכברים לאחר נתפתו עם צ'או דוקסיציקלין במשך 10 שבועות.; כל הראו גושים מרובים (חצים אדומים, הסגלגל האדום מקיף שטח שהיה מוצל לחלוטין על ידי גושים). (C, G, K) סריקות מאותו העכברים לאחר טיפול 10 שבועות של נוספים עם מעכב FGFR מראה היעלמות מוחלטת או ירידה ניכרת בגודל של גושים. (O) סרוק מתוך עכבר מלאה לייצג את קבוצת הביקורת כי היה מנוהל פלצבו במקום FGFR מעכב מראה גידול הגודל ומספר 'גושים סרטניים. חיצים צהובים קטנים מצביעים על ציוני דרך אנטומיים המשמשים לזיהוי באותה תנוחה בנקודות זמן שונות. (D, H, L) סעיפים היסטולוגית אישר מהירידה הניכרת בגודל גולה ומספר (השווה איור 2 C ו- F). (P) מציג את preseNCE גושים מרובים גידול כאשר היה מנוהל פלצבו. סרגל קנה מידה:. 200 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת מייקרו-CT המבוסס המתואר כאן לזיהוי בזמן האמת של מומי ריאות והניטור של התפתחות גושים סרטניים ואת התגובה לטיפול בבעלי חי סרטן הריאות תאפשרנה למדענים שמנהלי ניסויים הקשורים לסרטן ריאות לתכנן יותר ניסויים מדויקים ויעילים תוך חיסכון בזמן ומשאבים. השתמשנו בעבר MRI לאותה מטרה 6. הבהירות של הסריקה סף לצורך זיהוי של גושים ריאות עם MRI היו נחותים מאלו עם סריקות מיקרו-CT המתוארים במחקר זה 6.
מחקרים קודמים כי השתמשו במודלי עכברי אדנוקרצינומה ריאות דומים (עם רקע גנטי שונה ושיטות אינדוקצית גידול), בוודאי היו מספר חסרונות כי ניתן היה למנוע או משופרים השתמשו הוא סריקת מייקרו-CT 9,10. לא היה להם אמצעי לזהות חריגות ריאות מראש אינדוקציה או גושים, ובכך מסכן את הבלבולהתוצאות שלהם על ידי הכללת בעלי חיים ראויים. הם גם לא היו אמצעים כדי לאשר את התפתחותם של גידולים לאחר אינדוקציה או לאחר הפצת תאים סרטניים לעכברים wild-type (להשרות גידולים משניים), אז הם היו צריכים לחכות 4-8 חודשים ואז בעיוורון להרדים את העכברים לזיהוי היסטולוגית גידולים. כאשר המודלים האלה שימשו כדי להעריך את הפוטנציאל הטיפולי של תרופה, החוקרים נאלצו להקצות מספר קבוצות כדי להיות מורדמים ברצף כרונולוגי כדי לזהות את השפעת הטיפולים על גושים סרטניים עם היסטולוגיה כדי להיות מסוגל לזהות את נקודת הזמן של אפקט מקסימלי 11.
מגבלה אחת של השיטה שלנו, לעומת זאת, הוא המראה של צללים מעורפלים כי לטשטש את זיהוי של גושים בתוך הריאות כאשר חומרים זרים מוזרקים intratracheally 7 (מידע לא מוצג). עכברי החלק נראים לפתח תגובה דלקתית ממושכת לחומר המוזרק והצל של Reacti זהעל ובצקת ביניים מצורפת רעולה פן הגושים הקיימים. במקרים כאלה, אפשר להעמיד לדין MRI כחלופה.
לאחרונה, שיטות הדמיה אחרות הוכנסו להעריך פתולוגיות שונות בבעלי חיים קטנים; כמו פליטת אור הדמיה 12 ו טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) סריקה 13. למיטב ידיעתנו, מערכות הדמיה אלה לא היו בשימוש עדיין להעריך גידולי ריאה במודלים עכברים אז השוואה של יעילות איתור ובהירות תמונה עם חיה MRI קטן ותמונות מיקרו-CT טרם ניתן. הזמינות והעלות של המכונות האלה הם גורם מגביל השימוש הנרחב שלהם.
זיהינו ליקויי ריאות כ 50% של עכברים בבית ההקרנה טרום האינדוקציה ובהתאם עכברים אלה לא נכללו ניסויים נוספים. שכיחות גבוהה של הפרעות עשויה להיות תוצאה של transgene FGF9 "הדולף" אצל בעלי חיים מסוימים וכתוצאה מכך התפתח של גולת גידולזה עוד לפני שהם המושרה 14. ואכן, כמחצית מן החיות נשללות כאשר בדקו היסטולוגית הראתה הנוכחות של גושים קטנים מרובים. גם אלה יכולים להיגרם על ידי השפעה סוטה של transgene הוכנס על גני השכנה בגנום העכבר 14. ההתפתחות מעין אלה של ליקויים הם בהחלט לא ספציפית Sftpc-rtTA ו Tre-FGF9-ires-egfp פעמים מהונדסים עכברים ובכך דגמי סרטן הריאה אחרים עלולים להיות סובלים במצבים דומים. שכיחות גבוהה זו של מדגיש נורמליות העוד-יותר את החשיבות של הקרנת טרום הכללת עכברים באמצעות-CT מיקרו. עכברי סוג הבר נאיביים לא הראו כל צללים נורמלים על מייקרו-CT (איור 1 א).
לסיכום, תיארנו שיטה המנצלת מכונה קטנה חיה מיקרו-CT לגילוי וניטור מדויק של התפתחות גושים סרטניים בתוך הריאות של מודל העכבר אדנוקרצינומה. על ידילהשתמש בו כדי לעקוב אחר שינויי גושים לאורך זמן, ניתן לאסוף נתונים מדויקים יותר, ובעלות ומהלך זמן יעיל זמן יכולים להיות מותאמת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי גרנט ב- Aid מן JSPs KAKENHI עבור AEH (גרנט מספר 25,461,196) ו TB (במדבר גרנט 23,390,218 ו 15H04833) ו National Institutes of HL111190 לבריאות מענק (DMO). המחברים מבקשים להודות מיוקי ימאמוטו על מאמציה לסייע עם גנוטיפ חיה והכנת סעיפים היסטולוגית. אנו מודים משאבי המחקר המשותפים, בית הספר לרפואה, Keio University לתמיכה ריאגנטים טכניות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| micro-X-ray–computed tomography | Rigaku | R_mCT2 | |
| NanoZoomer RS Digital Pathology System | Hamamatsu | RS C10730 | |
| NDP.view2 Viewing software | Hamamatsu | U12388-01 | http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html |
| Isoflurane Vaporizer - Funnel-Fill | VETEQUIP | 911103 | |
| Induction chamber, 2 L W9.5 × D23 × H9.5 | VETEQUIP | 941444 | |
| Isoflurane | Mylan | ES2303-01 | |
| AZD 4547 | LC Labratories | A-1088 | |
| Pentobarbital | Kyoritsu | SOM02-YA1312 | |
| G24 cannula | Terumo | SP-FS2419 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 163-20145 | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Doxycycline | SLC Japan/PMI Nutrition International | 5TP7 | |
| ImageJ software | National Institute of health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Puralube vet ointment (Occular lubricant) | Dechra | NDC 17033-211-38 |
References
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int. J. Cancer. 136, 359-386 (2015).
- Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. Am. J. Transl. Res. 15, 114-118 (2014).
- Chen, Z., Fillmore, C. M., Hammerman, P. S., Kim, C. F., Wong, K. K. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Nat. Rev. Cancer. 14, 535-546 (2014).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Mol. Oncol. 7, 165-177 (2013).
- Malkinson, A. M. The genetic basis of susceptibility to lung tumors in mice. Toxicology. 54, 241-271 (1989).
- Yin, Y., Betsuyaku, T., Garbow, J. R., Miao, J., Govindan, R., Ornitz, D. M. Rapid induction of lung adenocarcinoma by fibroblast growth factor 9 signaling through FGF receptor 3. Cancer Res. 73, 5730-5741 (2013).
- Arai, D., et al. Characterization of the cell of origin and propagation potential of the fibroblast growth factor 9-induced mouse model of lung adenocarcinoma. J. Pathol. 235, 593-605 (2015).
- Paraffin processing of tissue. , Available from: http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2012).
- Curtis, S. J., et al. Primary tumor genotype is an important determinant in identification of lung cancer propagating cells. Cell Stem Cell. 7, 127-133 (2010).
- Lau, A. N., et al. Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis. EMBO J. 33, 468-481 (2014).
- Santos, A. M., Jung, J., Aziz, N., Kissil, J. L., Puré, E. Targeting fibroblast activation protein inhibits tumor stromagenesis and growth in mice. J Clin Invest. 119, 3613-3625 (2009).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive Bioluminescence Imaging in Small Animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
- Yao, R., Lecomte, R., Crawford, E. S. Small-Animal PET: What Is It, and Why Do We Need It. J Nucl Med Technol. 40, 157-165 (2012).
- Haruyama, N., Cho, A., Kulkarni, A. B. Overview: Engineering transgenic constructs and mice. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19, Unit 19.10 (2009).
