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DOI:

10.3791/53907

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6 de abril de 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Optometry and Vision Science, University of Waterloo, 2Medella Health

En este artículo

Resumen

Los modelos actuales in vitro para la evaluación de las lentes de contacto (CLS) y otras aplicaciones relacionadas con el ojo son muy limitadas. La plataforma ocular presentado simula fisiológica flujo lagrimal, volumen de lágrimas, la exposición al aire y el desgaste mecánico. Este sistema es muy versátil y se puede aplicar a diversos análisis in vitro con CLS.

Resumen

Actualmente, las evaluaciones in vitro de lentes de contacto (CL) para la administración de fármacos se realizan normalmente en viales de gran volumen,1-6 que no logran imitar los volúmenes fisiológicos de las lágrimas. 7 El modelo tradicional también carece del componente de flujo lagrimal natural y del reflejo de parpadeo, ambos factores definitorios del entorno ocular. En este estudio se describe el desarrollo de un modelo novedoso, que consiste en un diseño único de 2 piezas, globo ocular y pieza palpebral, capaz de imitar el volumen fisiológico de la lágrima. Los modelos se crean a partir de moldes impresos en 3D (moldes de politetrafluoroetileno o teflón), que se pueden utilizar para generar modelos de ojos a partir de diversos polímeros, como el polidimetilsiloxano (PDMS) y el agar. Otras modificaciones en las piezas oculares, como la integración de una córnea humana o animal explantada o una construcción corneal humana, permitirán estudios oculares in vitro más complejos. Una bomba de jeringa microfluídica comercial está integrada con la plataforma para emular la secreción fisiológica de lágrimas. La exposición al aire y el desgaste mecánico se logran mediante dos actuadores mecánicos, uno de los cuales mueve la pieza del párpado lateralmente y el otro mueve el ocular circularmente. El modelo se ha utilizado para evaluar las CL para la administración de fármacos y la deposición de componentes lagrimales en las CL.

Introducción

Dos importantes áreas de interés dentro de la arena de lentes de contacto (CL) incluyen malestar y el desarrollo de nuevas aplicaciones CL. Elucidar los mecanismos subyacentes CL malestar es un tema que ha eludido el campo durante décadas. 8 El desarrollo de la novela, CL funcionales, tales como dispositivos de liberación de fármacos 1,3,9 y biosensores, 10-12 es un área de creciente interés, con los mercados potenciales sustanciales. En ambas circunstancias, un sofisticado modelo in vitro podría proporcionar información relevante para ayudar en la selección de materiales de lentes o características de diseño apropiado durante la fase de desarrollo. Por desgracia, la corriente en modelos in vitro para la evaluación de las NFT y otras aplicaciones relacionadas con el ojo son relativamente crudo y poco sofisticado. Tradicionalmente, se llevan a cabo en los estudios in vitro que evalúan CL deposición de la película lagrimal o la administración de fármacos en viales de volumen estáticas, grandes que contienen un volumen de fluido fijo, que GREAtly excede cantidades fisiológicas. Además, este modelo simple no tiene la componente de flujo de lágrima natural y el reflejo del parpadeo, ambos de los cuales son la definición de factores del entorno ocular.

El desarrollo de un "modelo" sofisticado, fisiológicamente relevante ojo requerirá un enfoque multidisciplinar y requieren sustancial en la validación in vivo. Por estas razones, el marco fundamental para nuestro modelo de ojo in vitro es altamente versátil, de tal manera que el modelo puede ser mejorado continuamente a través de las actualizaciones futuras y modulaciones. Hasta la fecha, el modelo es capaz de simular el volumen de lágrimas, el flujo de lágrimas, desgaste mecánico y la exposición al aire. El objetivo es crear un modelo in vitro que proporcionará resultados significativos, que es predictivo y conexión a in vivo y ex vivo observaciones.

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Protocolo

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo y cumpliendo con todas las directrices pertinentes señalados por la Universidad de Waterloo comité de ética de la investigación con animales. Los ojos bovinos son donados generosamente de un matadero local.

1. Modelo de ojos

  1. Diseño y producción de moldes 13
    1. Diseño de los modelos de ojo de acuerdo con las dimensiones fisiológicas promedio de los ojos humanos adultos. 13
    2. Deje un espacio de 250 m entre el globo ocular y el párpado las piezas del modelo de ojo. Diseñar los moldes respectivos utilizando el software de diseño (CAD) asistido por ordenador.
    3. Crear nuevo archivo o archivo .cad .sldprt con AutoCAD o SolidWorks. Crear modelos 3D del globo ocular / párpado humano. Crear moldes de los modelos y guardar los moldes como archivos .stl.
    4. Importar archivos .stl en el software de la impresora 3D (por ejemplo, para makeware replicator2). Especificar parámetros de la impresión (ubicación, poca densidad, escala, orientación, suavidad, etc. ) 13.
    5. Guarde el archivo como archivo de código G para las impresoras 3D para leer. Seleccionar materiales tales como PLA (ácido poliláctico), ABS (acrilonitrilo butadieno estireno), PC (policarbonato), o una combinación de los mismos, para imprimir los moldes 13.
    6. Instalar filamento deseada del material de elección. Importe el archivo de código G en la impresora 3D para leer. Imprimir el molde.
      NOTA: Como alternativa, producir los moldes de los ojos utilizando un numérico por computadora (CNC) de la máquina controlada, si se desea una superficie más lisa en el modelo de ojo. Para la producción de moldes CNC, los materiales para moldes ya no se limitan a los plásticos térmicos, sino que se extienden a metal, cerámica, y polímeros químicamente resistentes tal como politetrafluoroetileno.
    7. Abra la interfaz de software CNC que está conectado a un taladro de corte. La construcción de moldes en 3D de acuerdo con la parte frontal, superior, lateral y vistas en perspectiva de los moldes modelo globo ocular / párpado construidos previamente en la interfaz del software de control. Seleccione los parámetros adecuados para lamecanizado (tamaño de la broca, material de sustrato, el espesor del material) y proceder a cortar el molde.
  2. Síntesis de Oculares Uso de PDMS
    1. Usando una jeringa, mida 10 ml de volumen de PDMS base (polidimetilsiloxano) y llenarlo en un tubo de centrífuga de 15-50 ml. Añadir 10% w / v de la solución de elastómero en peso total de PDMS. Usando una varilla de agitación, mezclar bien las soluciones.
    2. Se vierte la solución de PDMS en los moldes del globo ocular y el párpado. Permitir que el PDMS se asienten a TA S / N (o por lo menos durante 12 horas) para iniciar la polimerización y para permitir que las burbujas se disuelven fuera del polímero.
      NOTA: Asegúrese de que no hay burbujas que quedan en el PDMS que podrían aumentar o ampliar.
    3. Posteriormente, colocar los moldes en un horno de 75 ° C (167 ° F) durante 1 hora, o 150 ° C (302 ° F) durante 5 min. Para un gel suave, permiten el PDMS se sientan a temperatura ambiente durante al menos 48 horas para polimerizar por completo.
    4. Poner las muestras en un congelador durante unos minutos; esto va a reducir el tamaño de PDMS y simplificarla eliminación de las muestras de los moldes. Extraer los oculares de los moldes utilizando una espátula fina.
    5. Para la entrega de la solución en el espacio entre el globo ocular y el párpado piezas, conectar un tubo de politetrafluoroetileno 1/16 "x 1/8" con un conector de tubo acoplador igual pierna 1/16 "y adjuntarlo a la pieza del párpado en el agujero de la tubería .
  3. Síntesis del globo del ojo de pieza utilizando agarosa
    NOTA: La pieza globo ocular se puede sintetizar utilizando otros polímeros tales como agarosa. El siguiente procedimiento también puede ser modificado para producir piezas de ojo de una variedad de tipos de agar, tales como PDA (patata dextrosa agar) o SDA (Sabouraud dextrosa agar).
    1. Para producir un gel 2% (2 g / 100 ml), medida 2 g de agarosa y se mezcla con 100 ml de agua ultrapura. Se lleva la solución a ebullición (100 ºC) tal que la agarosa se disuelva completamente. Deje que la solución se enfríe durante 5 min.
    2. Verter la solución en el molde globo ocular y permita que la solución se enfríe durante 30 min a TA. Retire las piezas del globo ocular con una espátula. Almacenar el agar globo ocular en un -20 ° C congelador para su uso posterior. Para los estudios de microbiología, esterilizar los moldes globo del ojo por tratamiento en autoclave y / o UV-irradiación.
  4. La incorporación de bovino Córnea en PDMS del globo del ojo
    NOTA:. Este protocolo ha sido adaptado de Parekh et al 14
    1. Realizar la disección y la incorporación de las córneas de bovino en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. Adquirir los ojos y diseccionar ellos en el mismo día.
    2. Girar la campana de flujo por 10 min antes de su uso y desinfectar con alcohol etanol 70%. Asegúrese de que todos los materiales e instrumentos son estériles en autoclave a 273 ° F / 133 ° C durante 45 minutos, y se posicionan no menos de 4 pulgadas de la campana de flujo de entrada.
    3. Sumergir el ojo bovina en un vaso de precipitados que contiene una solución de povidona yodada diluida para 2 min. Enjuague el ojo en un vaso de precipitados que contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4. Utilizando unas pinzas colocan suavemente el ojo en una placa de Petri de vidrio, la cara de la córnea hacia arriba.
    4. Eliminar el exceso de músculo y tejido graso por el corte en los puntos de fijación escleral con tijeras de disección extremo romo. Desechar el exceso de tejido en un vaso estéril designada por los residuos animales.
    5. El uso de micro-tijeras, retirar la conjuntiva del ojo. Envolver el ojo con una gasa estéril, manteniendo una distancia de al menos 1 cm desde el limbo.
    6. El uso de un escalpelo, incisión de la esclerótica de aproximadamente 2 mm de la región de limbo y superficialmente con el fin de evitar la penetración de la coroides subyacente y el cuerpo vítreo. Extienda cuidadosamente la incisión de 360 ​​° con un bisturí o unas tijeras de disección sin deformar la córnea de su curvatura natural.
    7. Con unas pinzas finas, eliminar la córnea del ojo. Con unas pinzas, retire con cuidado cualquier tejido uveal adherirse córnea y enjuague con PBS.
    8. Almacenar la córnea a 31ºC en un recipiente estéril con la culturamedio (tal como el medio 199) que contiene 3% de suero bovino fetal para mantener la humedad del tejido y la nutrición celular.
    9. Antes de la experimentación, descansar la córnea extirpada en el globo ocular PDMS, y la abrazadera de las dos piezas juntas con un clip especializada.

2. Blink-plataforma

  1. Diseño y Producción de la Blink-plataforma
    NOTA: El parpadeo de la plataforma se compone de tres partes funcionales: modelo de ojo (descrito en el apartado 1), sistema de engranajes, y el sistema electrónico.
    1. Diseño y fabricación de la plataforma usando un abrir y cerrar de CAD y la impresión en 3D, de forma similar a la descrita en el modelo de ojo (sección 1.1). Diseñar el sistema de engranajes de tal manera que se traduce simple rotación de los motores en los movimientos laterales y de rotación de los oculares. 15
    2. Usando el piñón y el mecanismo de engranaje, traducir el movimiento de rotación de un motor paso a paso en el movimiento lateral de un piñón, que está conectado a las piezas de los párpados.
    3. Utilizando elsistema de engranaje conjugado, amplificar un movimiento de rotación de un motor paso a paso en tres (o más) movimientos de rotación de tres piezas diferentes del globo ocular.
    4. Alinear los dos sistemas de engranajes, uno para el párpado y uno para globo ocular, de modo que la distancia entre los dos son constantes. Montar el sistema electrónico con un microcontrolador, el blindaje del motor, y dos motores.
      NOTA: Utiliza dos motores paso a paso para proporcionar los motores de rotación, lo que se traduce por el sistema de engranajes en un movimiento intermitente.
    5. Conectar los dos motores paso a paso con un sistema que consiste en un protector del motor de apilado en el microcontrolador. Conectar y configurar los componentes electrónicos para trabajar con productos de software de código abierto.
    6. Programar el sistema para controlar los parámetros del motor tales como disparos por minuto (RPM), el número de rondas hacia adelante, hacia atrás número de rondas, y el estilo de girar.
      NOTA: Consulte el "archivo de código Arduino" suplementaria para los detalles.
    7. Descargar el software del sistema de la mafabrican- página web.
    8. Instalar el software y abrirlo. Escribir el código para el control de motores paso a paso en la configuración deseada. Conectar el sistema con una fuente para alimentar el sistema electrónico, de modo que los motores se mueven en la forma deseada tal como se define por el investigador.
      NOTA: Consulte el "archivo de código Arduino" complementario.
  2. Asamblea con la microfluídica (solución de lágrimas artificiales)
    1. Tome el globo ocular sintetizado y piezas del párpado y el deslizamiento en sus correspondientes clip-ons para el ojo-modelo. Conectar el tubo que se une con una jeringa y se coloca en la bomba de microfluidos con la pieza de párpados (sección 1.2.5). Prueba de funcionamiento de la plataforma y comprobar si hay movimiento constante.
    2. El primer tubo y comprobar si hay un flujo constante de solución de lágrimas artificiales (ATS). La receta para el ATS se ha informado anteriormente. 16
    3. mover manualmente las partes del ojo-modelo juntos en un nivel plano, de manera que el globo ocular y el ojotapa están en contacto. Ajuste el caudal de la bomba de microfluidos a los valores deseados. Fijar las tasas de flujo fisiológico de 1-1,5 l / min. 17
    4. Arrancar la bomba y los actuadores para comenzar el experimento. Para los experimentos de liberación de fármacos, colocar la lente de contacto que contiene el fármaco en la pieza globo ocular.
    5. Deje que el flujo de fluido a través de goteo en una placa de 12 pocillos. En los intervalos de tiempo de ajuste deseado, cuantificar la concentración de analito o fármaco usando métodos de detección comunes, tales como espectroscopía de UV-Vis o fluorescencia. 1,4,18
    6. Para los estudios que evalúan la deposición de componentes de la lágrima en lentes de contacto, coloque la lente de contacto en la pieza "a ojo". Recoger el fluido de flujo a través, que puede ser desechado.
    7. Después de los intervalos de tiempo deseados, retirar la lente de contacto de la pieza de globo ocular y preparar la lente para su posterior análisis como la microscopía confocal.

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Resultados

Los moldes ojo sintetizados obtenidos a partir de la tienda de la máquina y de la impresión 3-D se muestran en la Figura 1. Estos moldes se pueden utilizar con una variedad de polímeros, tales como PDMS y agarosa, para producir los oculares con las propiedades deseadas. El conjunto de señas de la plataforma de modelo de ojo con una bomba de jeringa de microfluidos se muestra en la Figura 2. La plataforma simula el desgaste mecánico a través de la rotació...

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Discusión

Hay tres pasos críticos dentro del protocolo que requieren una atención especial: diseño y producción de moldes (sección 1.1), conjunto de plataforma (sección 2.2.1-2.2.3), y el seguimiento de la ejecución experimental (sección 2.2.4-2.2.7 ). En términos del diseño y la producción de moldes (sección 1.1), la pieza de globo ocular debe ser diseñado de acuerdo con las dimensiones de una córnea humana. Sin embargo, se puede requerir múltiples prototipos del molde antes de una pieza globo ocular puede ser creado que se ajus...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean reconocer nuestra fuente de financiación CRSNG 20/20 Red para el Desarrollo de Materiales Avanzados oftálmicos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Arduino Uno R3 (Atmega328 - ensamblado)Placa Adafruit50
MotorAdafruit324Motor y escudo del motor
Acoplador de pierna igual 1.6mm 1/16"VWRCA11009-28050 piezas de conector de tubo
Tubo PT/SIL 1/16"x1/8"VWR16211-316Caja de 50 pies
PDMSDow CorningSylgard 184 Encapsulación de
Agarosa, tipo 1-A, baja EEOSigma-AldrichA0169-25G
PHD UltraTMHarvard Apparatus703006Bomba microfluídica
Córnea bovinaCargill, Guelph/ON
SoldidworksDassault SystèmesSoftware
Impresión 3DUniversidad de Waterloo - Centro de impresión 3D
Herramientas de disecciónHerramientas de ciencia fina Herramientasgenerales de disección
Medio 199Sigma-AldrichMedio de cultivo Almacenamiento para córnea
Suero fetal bovinoThermo FisherAñadir al medio de cultivo, 3% de volumen total
paso a paso células solares

Referencias

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