Artículo de método

In Vitro El desmontaje de virus de influenza A cápsides por centrifugación en gradiente

DOI:

10.3791/53909

⸱

27 de marzo de 2016

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1Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 2Department of Biochemistry, University of Zurich, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

En este artículo

Resumen

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El desmontaje de los núcleos del virus de la influenza A durante la entrada del virus en las células huésped es un proceso de varios pasos. Describimos un método in vitro para analizar las primeras etapas del desenmascaramiento viral. En este enfoque, la centrifugación en gradiente de velocidad se utiliza para diseccionar bioquímicamente los pasos que inician el desrecubrimiento en condiciones definidas.

Resumen

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Los procesos moleculares desencadenados por ácido controlan de cerca la entrada celular de muchos virus que entran a través del sistema endocítico. En el caso del virus de la gripe A (IAV), la fusión del virus con la membrana endosomal, así como el posterior desmontaje de la cápside viral, llamado desrecubrimiento, se rige por las condiciones iónicas dentro de las vesículas endocíticas. Los primeros pasos en el ciclo de vida del virus son difíciles de estudiar porque no se puede acceder directamente a los endosomas experimentalmente, lo que crea la necesidad de un enfoque in vitro. En este trabajo describimos un método basado en la centrifugación en gradiente de velocidad de viriones purificados a través de un gradiente de glicerol de dos capas, que permite analizar el núcleo de IAV y su estabilidad. El gradiente contiene un detergente no iónico (NP-40) en su capa inferior para eliminar la membrana viral por solubilización a medida que el virus se sedimenta hacia el fondo. A pH neutro, los núcleos virales se granulan como estructuras estables. Los componentes principales del núcleo, la proteína de la matriz (M1) y las ribonucleoproteínas virales (vRNP), se pueden identificar claramente en la fracción de gránulos mediante SDS-PAGE. Al disminuir el pH a 6,0 o menos en la capa inferior, se elimina selectivamente el M1 del pellet, seguido de la liberación de vRNP en condiciones más ácidas. Las bandas de proteínas virales en geles teñidos con Coomassie se pueden someter a cuantificación densitométrica para monitorear estados intermedios de desensamblaje de IAV. Además del pH, se pueden evaluar otros factores que influyen en la estabilidad del núcleo viral, como la concentración de sal y los supuestos factores de desrecubrimiento viral, simplemente modificando la capa de glicerol que contiene detergente en consecuencia. En conjunto, la técnica presentada permite un análisis altamente reproducible y cuantitativo del desrecubrimiento viral in vitro. Se puede aplicar a otros virus con envoltura que se someten a complejos procesos de desenmascaramiento.

Introducción

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Influenza A virus (IAV) es un virus con envoltura y pertenece a la familia de Orthomyxoviridae. Sus genes están codificados en un sentido negativo segmentado y genoma de ARN de cadena simple. En los seres humanos, IAV causa infecciones respiratorias, que se producen en brotes epidémicos estacionales y tiene el potencial de pandemias globales 1. Tras la unión a los residuos de ácido siálico en la superficie de la célula huésped 2, IAV es internalizado por endocitosis dependiente de clatrina y las vías de clathrin independiente 3-8. El medio ácido (pH <5,5) en las vacuolas endocíticas desencadena un cambio conformacional importante en la IAV espiga glicoproteína hemaglutinina (HA), lo que resulta en la fusión de la viral y el fallecido membrana 9 endosomal. Una vez que la cápside IAV (aquí también se hace referencia como "núcleo" viral) ha escapado de los endosomas finales (LES), que no está recubierto en el citosol seguido por el transporte de las ribonucleoproteínas virales (vRNPs) en el núcleo - el sitio ola replicación del virus y la transcripción f 10-13. Antes de la activación ácida de HA del virus experimenta una disminución gradual en el pH en el sistema endocítica, que ceba el núcleo para su posterior desmontaje 14-16. En este "cebado" intensificar los canales iónicos M2 en la membrana viral mediar en la afluencia de protones y K +10,14,16. El cambio en la concentración iónica en el interior virus perturba las interacciones se acumulan por la proteína de la matriz M1 viral y el haz vRNP ocho, y facilita IAV uncoating en el citoplasma después de la fusión de membranas 10,14-17.

El análisis directo y cuantitativa de la etapa de cebado se ha visto obstaculizada por el hecho de que los endosomas son difíciles de acceder experimentalmente. El proceso de entrada es, por lo demás, altamente no sincrónico. Además, los ensayos de punto final, como QRT-PCR mediciones de ARN o la infectividad viral liberados, no proporcionan una imagen detallada sobre el estado bioquímico de la capsi virald en cualquier etapa dada de entrada. Mientras que la perturbación de los endosomas de siRNA o tratamiento de drogas ha contribuido significativamente a la comprensión de la entrada IAV 18-20, puesta a punto es difícil y propensos a los efectos secundarios inespecíficos en el programa endosoma maduración estrechamente controlada.

Para evitar estos problemas, hemos adaptado un protocolo previamente desarrollado in vitro basado en el uso de la velocidad de centrifugación en gradiente de 17. A diferencia de otros intentos 21,22, 23,24, que se basan principalmente en combinaciones de escisión proteolítica y tratamiento con detergente seguido por análisis de EM, este enfoque permitió un resultado fácilmente cuantificable. La centrifugación a través de diferentes capas de gradiente permite que las partículas que sedimentan a estar expuestos a y reaccionan con las condiciones cambiantes de una manera controlada. En el protocolo presentado, IAV derivado de fluido alantoideo aclarado o partículas virales purificadas se sedimentan en un glicerol de dos capasgradiente en el que la capa inferior contiene el detergente no iónico NP-40 (Figura 1). A medida que el virus entra en la segunda capa, que contiene detergente, la envoltura de lípidos y glicoproteínas de la envoltura viral se solubilizan con suavidad y dejaron atrás. El núcleo, formado por el haz de ocho vRNP y rodeado por una capa de matriz, los sedimentos como una estructura estable en la fracción de sedimento. proteínas del núcleo viral, tales como M1 y nucleoproteína asociado-vRNP (NP), se pueden identificar en el sedimento por SDS-PAGE y tinción Coomassie. En particular, tomando ventaja de geles de gradiente disponibles en el mercado y la tinción con el coloidal Coomassie altamente sensible 25, permite una alta precisión y la detección de incluso pequeñas cantidades de proteínas del núcleo asociada virales.

Esto establece la base para probar si las diferentes condiciones tales como el pH, la concentración de sal, y los factores putativos Uncoating tener efectos sobre el comportamiento de sedimentación de los componentes del núcleo y de núcleo Stabil dad. Para este objetivo, solamente la capa que contiene detergente menor en el gradiente de glicerol se modifica mediante la introducción del factor o condición de interés. La técnica ha sido particularmente valiosa en la investigación del efecto de diferentes valores de pH y concentraciones de sal en la integridad del núcleo 16 IAV. Pasos intermedios de IAV uncoating podrían ser monitorizados incluyendo la disociación de la capa de la matriz a pH ligeramente ácido (<6,5), seguido de vRNP disociación a pH 5,5 e inferior 16,17 (Figura 1). Este último paso se ha mejorado aún más por la presencia de una alta concentración de K + en la capa de glicerol, lo que refleja un entorno endocítica finales 16. Por lo tanto, como el virus y el núcleo sedimentan a través del gradiente que experimentaron un medio de cambio que imita las condiciones en los endosomas. El resultado fue un desmontaje por etapas del núcleo viral in vitro, como complemento de los resultados derivados de los ensayos de biología celular.

t "> El método que aquí se presenta ha permitido el análisis rápido y altamente reproducible de IAV (X31 y A / WSN / 33) e IBV (B / Lee / 40) Uncoating desencadenada por pH ácido y el aumento de K +16,17, así como el desmontaje de núcleos de paramixovirus tras la exposición pH alcalino 17. es concebible que el enfoque se puede adaptar a otros virus con envoltura para obtener información sobre las propiedades bioquímicas de la estructura de la cápside viral y desmontaje de la cápside durante la entrada en la célula.

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Protocolo

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1. Preparación de tampones y soluciones de archivo

  1. Preparar tampón SM (MES 20 mM, Tris 30 mM y NaCl 100 mM) disolviendo 470 mg de clorhidrato de Tris, 390 mg de hidrato de MES y 580 mg de NaCl en 80 ml ​​ddH2O Ajustar el tampón a pH 7,4 y llevarlo a un volumen final de 100 ml con ddH 2 O.
  2. Preparar tres soluciones idénticas de tampón MES 500 mM disolviendo 9,76 g de hidratos de MES en 80 ml ​​de H2O destilada cada uno. Ajuste los tampones a pH 5,8, 5,4, y 5,0, respectivamente, por titulación con NaOH concentrado. Llevar a cada tampón a un volumen final de 100 ml con dH 2 O.
  3. Preparar dos soluciones idénticas de tampón Tris 500 mM disolviendo 7,88 g de Tris clorhidrato en 80 ml ​​dH 2 O cada uno y ajustar el pH a 7,4 y 6,4, respectivamente, por titulación con HCl concentrado. Llevar el tampón a un volumen final de 100 ml con dH 2 O.
  4. Preparar una solución de glicerol al 50% en H2O destilada y mezclar bien hasta que el glycerol es homogéneamente mezclado. Filtrar la solución a través de una unidad de filtro Steritop (0,22 micras de tamaño de poro) en una botella de vidrio.
  5. Preparar una solución al 10% de NP-40 y 1 M NaCl en dH2O
  6. Preparar 25x inhibidor de la proteasa concentrada disolviendo dos tabletas en 4 ml ddH2O

2. Preparación de glicerol gradientes

  1. Preparar 5 ml de detergente mezcla maestra tampón (NaCl 300 mM, 2% de NP-40, 2x concentrado inhibidor de la proteasa) solución para cada condición de pH de ensayo (pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4, y 5,0). Para este propósito, la mezcla 9 ml de 1 M NaCl, 6 ml de 10% de NP-40, 2,4 ml del inhibidor de la proteasa de 25x, y 9 ml ddH 2 0.
  2. Para cada condición de pipeta pH 4,4 ml de la mezcla maestra en un tubo cónico de 50 ml.
  3. Para valores de pH superiores a 5,8 añadir 0,6 ml de la respectiva solución de 500 mM Tris Stock pH ajustado al tubo. Para un pH de 5,8 y menor añadir 0,6 ml de la solución madre respectiva MES 500 mM de pH ajustado.
  4. hacer 5ml de solución tampón que contenía NaCl 300 mM, inhibidor de la proteasa 2x, 60 mM Tris ajustó a pH 7,4 y ddH 2 O. Esto servirá como tampón de gradiente de control sin detergente.
  5. Si es necesario, un ajuste preciso del pH de las soluciones a pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4, y 5,0 mediante la adición de soluciones de HCl o NaOH concentrado, respectivamente.
  6. Añadir 5 ml de la reserva de glicerol 50% a 5 ml de las mezclas de tampón que contiene detergente y libre de detergentes resultantes en seis soluciones de glicerol diferentes 25%. Verificar los valores de pH mediante el uso de tiras indicadoras de pH.
    NOTA: En caso de que el pH medido difiere significativamente del valor deseado, las respectivas soluciones deben prepararse de nuevo.
  7. Preparar la solución de glicerol 15% mediante la mezcla de 50% de glicerol con dH 2 O en una proporción de 3: 7.

3. La ultracentrifugación de IAV

  1. Añadir 3 ml de solución de glicerol al 15% en tubos de centrifugación ultra claras (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) utilizando una jeringa de 5 ml y una neeDLE (21 g, 9 cm de largo). No dejar gotas en la pared interior del tubo ya que esto podría perturbar la integridad del gradiente. Repita este procedimiento para un total de seis tubos de centrifugación, una para cada una de las cinco condiciones de pH para probar y uno para la muestra de control.
  2. Coloque cuidadosamente solución de glicerol 3,4 ml 25% bajo la capa de glicerol 15% mediante el uso de una jeringa de 5 ml y una aguja larga. Tenga cuidado de no mezclar las dos capas. Repita este procedimiento para todas las seis condiciones para poner a prueba con las respectivas soluciones de glicerol con pH ajustado.
    NOTA: El trabajo en clase II cabina de bioseguridad para los siguientes pasos.
  3. superponer suavemente los gradientes de glicerol con 30 l aclarado líquido alantoideo que contiene IAV (X31, H3N2) diluido en 1 ml de tampón SM (corresponde a alrededor de 20-30 g de proteína viral total) para cada gradiente.
  4. Equilibrio oponerse tubos y colocarlos en un rotor SW41 ultracentrifugación. Se centrifuga durante 150 minutos, a 55.000 xg, y 12 ° C.
  5. Después de la centrifugación, cuidadosamenteEliminar el sobrenadante, es decir, las dos capas de glicerol mediante el uso de una pipeta Pasteur y limpia un aspirador. Resuspender el precipitado en 40 l (1x) no reductoras tampón de muestra LDS. Es importante pipetear arriba y abajo varias veces para disolver el precipitado completamente. Transferir la muestra en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.

4. SDS-PAGE de las fracciones de pellets y tinción Coomassie

  1. Calentar todas las muestras a 95 ° C durante 10 min. En este punto las muestras se pueden almacenar a -20 ° C hasta que se analizaron por SDS-PAGE.
  2. Carga de 20 l de los gránulos disueltos en un gradiente de pre-cast (4-12%) de mini gel Bis-Tris y una duración de 1 hora a 200 V en 1x MOPS SDS funcionamiento de amortiguación.
  3. Hacer solución de fijación con 40% de metanol y ácido acético glacial 10% en ddH 2 O.
  4. Incubar el gel en solución de fijación durante 1 hora y manchar durante la noche en una placa de cultivo celular de 15 cm con un volumen suficiente de solución de Coomassie coloidal mientras que suavementeagitación a temperatura ambiente.
    NOTA: Es importante cerrar el plato con el fin de evitar la evaporación de la solución de tinción.
  5. Destain el gel en ddH2O Vuelva a colocar la ddH2O cada 15-20 minutos hasta que el fondo gel se vuelve clara. Almacenar el gel en ddH2O a 4 ° C hasta que se escanea para la cuantificación banda.
  6. Analiza el gel a alta resolución y el uso de software disponible o hecho a medida en el comercio para la cuantificación de la intensidad de la banda de proteína. Restar la señal de fondo de una región cerca de las respectivas bandas y normalizar estos valores para las muestras de control sin detergente (a pH 7,4).

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Resultados

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Como ya se ha comentado, el cebado en los endosomas que se requiere para hacer que el núcleo IAV uncoating competente. La protonación del núcleo debilita la interacción de M1 y vRNPs (compuesto del ARN viral, NP, y la polimerasa PB1 complejo / PB2 / PA). Este proceso se inicia cuando el virus entrante se expone a un pH de 6,5 (o inferior) en los endosomas tempranos (EEE) y continúa hasta que los fusibles de virus en torno a pH 5,0 en LES.

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Discusión

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cápsides virales son complejos macromoleculares metaestables. Durante el montaje de los viriones requiere la encapsidación y la condensación del genoma del virus, el inicio de la siguiente ronda de infección depende de desmontaje de esta estructura de la cápside compacto. Los virus han evolucionado para explotar varios mecanismos celulares para controlar el ciclo de recubrimiento-uncoating, incluyendo receptores celulares, chaperones, enzimas proteolíticas, fuerzas físicas proporcionadas por proteínas motoras o helicase...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos a Yohei Yamauchi y Roberta Mancini para que nos proporciona reactivos. El laboratorio AH fue apoyada por las Redes de formación inicial Marie Curie (ITN), el Consejo Europeo de Investigación (CEI), y por la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (Sinergia).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
cOmplete™, comprimidos inhibidores de la proteasa sin EDTASigma-Aldrich11873580001La solución madre puede almacenarse a 2 a 8 °C; C durante 1 a 2 semanas
Ácido acético glacialMerck Millipore100063
Glicerol anhidro BioChemicaAppliChemA1123
Ácido clorhídricoMerck Millipore100317
Aguja de inyección larga (21  G, 9 cm, bisel o extremo romo)
MES hydrateSigma-AldrichM8250
MetanolMerck Millipore106009
NP-40Sigma-AldrichI8896Ahora disponible comercialmente como IGEPAL® CA-630
NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini geles, 10  Pocillos, 1,0 mmLife TechnologiesNP0321
Tampón de muestras NuPAGE LDS (4x)Life TechnologiesNP0008
NuPAGE MOPS SDS tampón de funcionamiento (20x)Life TechnologiesNP0001
Tiras indicadoras de pH, pH 4.0-7.0Merck Millipore109542
QC Tinción coloidal de Coomassie BIORAD1610803
Sodio cloruroMerck Millipore106406
hidróxido de sodioMerck Millipore106498
unidad de filtro SteritopMerck MilliporeSCGPT05RE
SW41 Ti, juego de rotores de ultracentrífugaBeckman Coulter331336
Thinwall, tubos de centrífuga ultratransparentes, 13.2  ml, 14 mm x 89 mmBeckman Coulter344059
Clorhidrato de Tris AppliChemA1087
X31 Virus de la influenza A (H3N2), líquido alantoico clarificado cultivado en huevoVirapurRecién descongelado en 4 & grados; C

Referencias

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