Artículo de método

Un método para detectar y aislar las vías aéreas que inervan las neuronas sensoriales en ratones

DOI:

10.3791/53917

⸱

19 de abril de 2016

 , 
1Department of Cellular & Molecular Physiology, Yale University, 2Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center

En este artículo

Resumen

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Las neuronas sensoriales específicas de órganos son difíciles de identificar. El trazado rápido de azul se utiliza para identificar las neuronas nodosas que inervan las vías respiratorias para la clasificación de células. Las neuronas nodosas clasificadas se utilizan para extraer ácido ribonucleico (ARN) de alta calidad para la secuenciación. Utilizando este protocolo, se determina la expresión génica de neuronas específicas de la vía aérea.

Resumen

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nervios somatosensoriales transducen térmica, mecánica, química, y los estímulos nocivos causados ​​por ambos agentes endógenos y ambientales. Los cuerpos celulares de estas neuronas aferentes se encuentran dentro de los ganglios sensoriales. Los ganglios sensoriales inervan un órgano específico o porción del cuerpo. Por ejemplo, el ganglio de la raíz dorsal (DRG) se encuentran en la columna vertebral y se extienden procesos en todo el cuerpo y las extremidades. Los ganglios del trigémino se encuentran en el cráneo y inervan la cara, y las vías respiratorias superiores. las vías aferentes vagales de los ganglios nodose se extienden por todo el intestino, el corazón y los pulmones. Las neuronas nodose controlan una gran variedad de funciones, tales como: frecuencia respiratoria, irritación de las vías respiratorias, tos y los reflejos. Por lo tanto, para entender y manipular su función, es crítico para identificar y aislar las vías respiratorias específicas subpoblaciones neuronales. En el ratón, las vías respiratorias están expuestos a un colorante indicador fluorescente, Fast Blue, para el rastreo retrógrado de las neuronas de la vía aérea específica nodoses. Los ganglios nodose se disocian y células activadas por fluorescencia (FAC) de clasificación se utiliza para recoger las células positivas de tinte. A continuación, el ácido ribonucleico de alta calidad (ARN) se extrae de las células positivas de tinte para la secuenciación de próxima generación. El uso de este método de la vía aérea se determina la expresión génica neuronal específico.

Introducción

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nervios somatosensoriales transducen térmica, mecánica, química, y los estímulos nocivos causados ​​por ambos agentes endógenos y ambientales. Los cuerpos celulares de estos nervios aferentes se encuentran en los ganglios sensoriales, tales como la raíz dorsal, trigeminal, o ganglios nudosos. Cada ganglio sensorial inerva regiones específicas del cuerpo y contiene células que inervan los órganos y tejidos separados dentro de esa región. Por ejemplo, el ganglio de la raíz dorsal (DRG) se encuentran en la columna vertebral y se extienden procesos en todo el cuerpo y las extremidades, mientras que los ganglios del trigémino se encuentran en el cráneo, que contiene neuronas que inervan la cara, ojos, meninges o superiores vías respiratorias 1, 2. Los ganglios nodosos del nervio vago se encuentra en el cuello por debajo del cráneo y contiene cuerpos celulares que se extienden las fibras nerviosas en todo el tracto gastrointestinal, el corazón y las vías respiratorias inferiores y los pulmones 3. En los seres humanos el ganglio nodoso se encuentra solo, sin embargo, en el ratón se fusionacon el ganglio yugular, que también inerva los pulmones 4. Este ganglio fusionado a menudo se llama la yugular / nodose complejo, ganglio vagal, o simplemente ganglio nudoso 5. En este caso, se conoce como el ganglio nudoso.

Las fibras aferentes de la nodose pasan la información de las vísceras al núcleo del tracto solitario (NTS) en el tronco cerebral. De entrada sensorial a este ganglio único controla una diversa gama de funciones, tales como la motilidad intestinal 6, la frecuencia cardíaca 7, la respiración 8,9, y las respuestas respiratorias irritantes activadas 10,11. Con esta diversidad de funciones y órganos inervados, es fundamental para dirigir y aislar subpoblaciones específicas de órgano del ganglio nudoso el fin de estudiar las vías neuronales individuales. Sin embargo, dado el pequeño tamaño de la nodose y el número limitado de neuronas que contiene esta no es una tarea trivial. Cada ratón ganglio nodoso contiene aproximadamente 5.000 neuronas 12Además de una extensa población de células de soporte satélite. De los 5.000 neuronas nodose, sólo un 3 - 5% de inervan las vías respiratorias. Por lo tanto, cualquier cambio funcionales, morfológicos o moleculares dentro de las neuronas que inervan las vías respiratorias, debido a la estimulación respiratoria o patologías, se perderán en el ganglio nodoso densamente poblado.

Para resolver este problema, se desarrolló un método para identificar y aislar las neuronas que inervan las vías respiratorias. Las vías respiratorias se expusieron a un colorante indicador fluorescente para identificar a los posteriores neuronas que inervan nodose. Fast Blue fue recogido por las neuronas y se desplaza rápidamente a sus cuerpos celulares en los que se deberá conservarse durante un máximo de ocho semanas 13 - 15. Una vez identificado, un protocolo de disociación suave, pero eficaz se utiliza para conservar tinte de etiquetado y la viabilidad celular de células activadas por fluorescencia (FAC) de clasificación. Las células clasificadas se utilizan para extraer el ácido ribonucleico de alta calidad (ARN) para determinar la expresión de genes o fu otro análisis molecular de aguas abajo. Este protocolo proporciona una técnica útil y robusto para el aislamiento de las neuronas sensoriales que inervan un tejido de interés.

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Protocolo

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Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad de Duke.

1. Administración intranasal de Fast Blue

Para Fast Blue, administrar el tinte al menos 2 días antes de la eutanasia el ratón. El tinte se mantendrá durante un máximo de ocho semanas.

  1. Anestesiar al ratón con anestesia por inhalación de luz (2,5% sevoflurano) hasta que comience a disminuir la respiración.
  2. Usar una pipeta de 200 l con puntas filtrados para infundir lentamente 40 l de solución de colorante (0,4 mM Fast Blue, 1% de sulfóxido de dimetilo, solución salina DMSO, en tampón fosfato, PBS) en la fosa nasal, haciendo una pausa de vez en cuando para asegurar que el ratón está aspirando la solución (Figura 1A).
  3. Mantenga pulsado el ratón verticalmente, cabeza en alto, y masajear suavemente el pecho para asegurar que el tinte se propaga a través de los pulmones.

2. Preparativos en la disección y el Día Análisis

  1. Preparar 10 ml0; Ganglios solución de disociación (GADS) mediante la combinación de los ingredientes como se especifica en la Tabla 1.
  2. Realizar la extracción de ARN en un área del laboratorio dedicado. Antes de comenzar el experimento, las superficies limpias con 70% de etanol, 10% de lejía, y el reactivo de descontaminación RNasa. Esto incluye la centrífuga ARN, los bastidores de tubos y pipetas. Garantizar la existencia de cajas de puntas con filtro dedicado para el uso de ARN. No utilice este equipo y el área de preparación de ADN, ya que esto va a contaminar las muestras.
  3. Mezcla fresca 70%, y 80% de etanol con agua libre de RNasa. Preparar 1 ml por muestra a ser utilizada en la extracción de RNA.
Ingrediente Cantidad
Avanzada DMEM / F12 9,5 ml
glutamina 100 l
HEPES (10 mM) 100 l
N2 suplemento 100 l
B27 (sin vitamina A) 200 l
NGF (50 g / ml) 10 l

Tabla 1. mezcla de reactivos para Ganglios solución de disociación (GADS).

3. Procedimiento de disección

  1. Llenar tubos de 1,5 ml con 500 l gads, uno para cada muestra experimental, una para un control positivo de clasificación, y uno para un control de clasificación negativa. tubos de las tiendas en el hielo a lo largo de la disección.
  2. Diseccionar el ganglio nodoso y hacer dos cortes parciales para facilitar la disociación, a continuación, poner en el tubo de muestra experimental. Por favor refiérase a la siguiente protocolo JoVe para la disección de los ganglios nudosos 16 y 17 DRG.
  3. Diseccionar y cortar parcialmente ganglios no marcado, como el ganglios de la raíz dorsal (DRG), para los controles de clasificación. Use dos ganglios para el control positivo y dos Gangliuna para el control negativo.
  4. Para obtener suficientes neuronas nodose para la clasificación exitosa, se combinan los ganglios de 5 ratones en gads que contienen un tubo de la muestra experimental.

4. Los ganglios sensoriales disociación

  1. Pipetear a cabo 500 gads l, dejando ganglios en el tubo. Lavar los ganglios de una vez mediante la adición de 1 ml de PBS, esperar a que los ganglios que se depositan en el fondo del tubo, luego de la pipeta a cabo PBS.
  2. Añadir 1 ml gads y 22 l de enzima de digestión (colagenasa I / II y la mezcla de proteasa, 2,5 mg / ml en H 2 O) a cada tubo.
  3. Añadir 20 l Fast Blue (5.26 mm) en el tubo de control positivo.
  4. Poner los tubos en un baño de agua o bloque de calefacción ya regulado a 37 ° C.
    Nota: El tiempo de digestión ganglios depende de la edad de la enzima de digestión. El plazo de 1 mes de la disolución de la enzima de digestión, digestión durante 30 minutos, dentro de 2 - 6 meses digieren durante 45 minutos. Si la enzima es más de 6 meses de edad, digerir los ganglios fo 60 min.
  5. Cada tubos de agitación 15 min brevemente y la película de ellos para asegurar ganglios están cubiertas por la solución.
  6. Mientras ganglios están siendo digeridos, preparar los gradientes de densidad utilizando una solución de partículas (partículas de sílice coloidal recubiertas con polivinilpirrolidona).
    1. Mezclar solución al 12% de las partículas en gads, 500 l por muestra.
    2. Mezclar solución al 28% de las partículas en gads, 500 l por muestra.
    3. Poco a poco y con cuidado añadir 400 l solución densidad de 12% en la parte superior de la solución de densidad de 400 l de 28% en un nuevo tubo de 1,5 ml para cada muestra. No permita que las dos capas se mezclen. Dos capas distintas deben ser visibles en el tubo; una más oscura que la otra.
  7. Mientras ganglios están siendo digeridos, etiquetar nuevos tubos de 1,5 ml de recolección para la clasificación (un tubo de Fast Blue positivo y uno negativo Fast Blue por muestra de clasificación). Dependiendo de los requisitos de las instalaciones de clasificación, estos tubos deben tener tapas desmontables de manera que no interferE con el separador de células.
  8. Después de que el tiempo de digestión apropiada, retire gads con enzima de digestión y lavar dos veces con ganglios 1 ml de PBS. Añadir 200 l de gads frescos a cada tubo.
  9. Utilice una pipeta de 200 l, ajustado a un volumen de 100 l, y los ganglios de la pipeta hacia arriba y abajo varias veces para separar las celdas. Repetir hasta que no se observa una pieza de tejido intacto. Evitar la creación de burbujas en la solución.
  10. Pase células disociadas a través de un filtro de células de 70 micras.
  11. Añadir otros 100 gads l al tubo original de disociación para recoger todas las células restantes que quedan sueltos y pasar la solución adicional a través del filtro de células. Usando una nueva punta de pipeta, recoger el líquido que contiene células restante que ha pasado por el colador y aferrado a la malla. El volumen final de células suspendidas en gads es de 300 microlitros.
  12. capa con cuidado los 300 l de células en la parte superior de la gradiente de densidad hecha previamente. Evitar las burbujas y mezcla de cells con las capas de densidad.
  13. Centrifugar durante 10 minutos a 2900 xg a TA.
  14. Mientras que las células están en la centrífuga, la mezcla de tampón de lisis (1 ml por muestra experimental) como sigue: 10 l 2-mercaptoetanol en 1 ml de tampón RLT (del kit de extracción de ARN).
    1. Añadir 300 l de tampón de lisis para tubo de recogida positivo Fast Blue y 600 l a tubos de Fast Blue negativo recolección (tubos etiquetados desde el paso 4.7). Este volumen depende del número de células que se espera sean recogidos. Para <2.000 células, añadir 300 l, para> 7.000 células añaden 600 l. Esto asegurará que el fluido de revestimiento de clasificación no diluye significativamente el tampón de lisis.
  15. Una vez que se completa la centrifugación, retirar con cuidado y desechar la capa superior de 700 l. Esta capa contiene la mayoría de los residuos celulares que de otro modo interferir con la clasificación de células.
  16. Añadir 700 l gads frescas a la célula restante solución y pipeta que contienete hacia arriba y abajo varias veces para mezclar.
  17. Se centrifuga durante 15 minutos a 2.900 xg para sedimentar las células.
  18. Mientras que las células están en la centrífuga, la mezcla de clasificación gads (500 l por muestra) mediante la adición de 5 l de ADNasa (10 mg / ml) a 1 ml gads.
  19. Una vez que se realiza la centrifugación, retirar con cuidado y desechar el sobrenadante, dejando el sedimento celular.
  20. Vuelva a suspender sedimento celular en 200 - 300 l de clasificación gads la pipeta hacia arriba y abajo con una pipeta 1.000 l ajustado a 200 l varias veces. Poner las muestras en hielo. Las células están listas para ser resuelto.

5. La fluorescencia de células activadas (FAC) Clasificación

Nota: En esta sección se requiere conocimiento operativo de un clasificador FACS o la ayuda de personal especializado.

  1. Añadir 1 l de yoduro de propidio (PI) solución madre (50 mg / ml) a cada muestra para la prueba de viabilidad celular. Dividir control negativo en 2 tubos, uno con PI y otro sin él. PI se une al ADN sólo en las células muertas. Sidespués de las primeras clases que no hay células muertas de la etiqueta, no es necesario el uso de IP.
  2. Células de transporte para citometría de flujo instrumento, por ejemplo., BD FACS AriaII que ejecuta el software de la diva 8, en el hielo.
  3. Dado que el tamaño de la celda es variable en esta población, utilizar una gran boquilla (100 micras) para la clasificación. Para disminuir la cantidad de estrés de la experiencia de las células y aumentar la viabilidad de las células usar baja presión (20 psi).
  4. Utilice el software clasificador FACS para establecer las parcelas de análisis, dispersión frontal, dispersión lateral (SSC), Fast Blue, y PI, si es necesario.
  5. Para volver a suspender las células, vórtice suavemente la muestra brevemente antes de cargarlo en el clasificador.
  6. Comience con el control negativo, sin Fast Blue o PI, para establecer el umbral de la puerta (Figura 2A). Esto determinará la cantidad de autofluorescencia en la población celular. Opcional: Ejecutar el ejemplo negativo con PI para identificar si existe una población de células muertas.
  7. Ordenar la muestra de control positivo (incubated con Fast Blue), para establecer los parámetros de compensación.
  8. Una vez que se establecen las puertas y los parámetros, comenzar a clasificar las muestras experimentales. Las muestras se clasifican en los tubos de recogida de preparados que contienen tampón de lisis de ARN.
  9. Mantener las muestras clasificadas en hielo hasta que la clasificación de células se ha completado.
  10. Comience etapa de extracción de ARN inmediatamente después se clasifican las células.

6. La extracción de RNA

  1. células clasificadas Vortex en tampón de lisis durante 1 minuto para homogeneizar.
  2. Añadir 1 volumen de 70% de etanol y la mezcla pipeteando arriba y abajo varias veces.
  3. Transferencia de hasta 700 l de la muestra a una columna de centrifugación. Centrifugar durante 15 segundos a 8.000 x g. Desechar el flujo continuo.
    1. Repetir hasta que el volumen total de la muestra se hace pasar a través de la columna de centrifugación.
  4. Añadir 350 l de tampón RW1 y continuar el proceso de purificación de ARN, incluyendo la etapa de tratamiento de DNasa, de acuerdo con protoco del fabricantel para las células.
  5. Una vez que se ha extraído el ARN, comprobar la calidad de ARN usando un sistema de electroforesis microfluídico de acuerdo con las especificaciones del fabricante.

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Resultados

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Usando este método, las neuronas que inervan las vías respiratorias se etiquetan mediante la instilación intranasal Fast Blue (Figura 1A). Después de dos días, las células Fast azul nombres aparecer en los ganglios nudosos (Figura 1C). Estas células constituyen 3-5% de la población neuronal total de los ganglios nudosos. Otros colorantes retrógradas que se han utilizado para este propósito incluyen DiI (1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametil...

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Discusión

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Este protocolo describe un método para dirigirse a las neuronas de la vía aérea-inervación en los ganglios nudosos del nervio vago. Una vez marcado, los ganglios se disocian suavemente para preservar de manera óptima el número de células y la viabilidad. Estas neuronas son entonces FAC ordenadas directamente en tampón de lisis y se extrae el ARN. La importancia de este protocolo es la posibilidad de dirigir, aislar y preservar la calidad de una población específica de células sensoriales. La expresión génica se describe...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Apoyado por el NIH subvención R01HL105635 de la SEJ. Los autores desean agradecer a Diego V. Bohórquez para el asesoramiento técnico. También agradecemos a R. Ian Cumming para la asistencia técnica y la realización de la citometría de flujo en el Centro de Vacunas Humanas Duke Instituto de Investigación de citometría de flujo de recursos compartidos (Durham, Carolina del Norte). La citometría de flujo se realizó en el Laboratorio Regional de Biocontención en Duke, que recibió un apoyo parcial a la construcción de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (UC6-AI058607).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Policiencias Azules Rápidas, Inc.17740-2stock 2 mg/ml en agua
NeuroTrace 530/615 tinción roja de NissleLife TechnologiesN21482
Dimetilsulfóxido (DMSO)Fisher ScientificD128-500
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) Libre de Ca y MgGibco14190-144
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
glutamina ( Glutamax)Gibco35050-061
HEPESGibco15630-080
N2Gibco17502-048
B27 (sin vitamina A)Gibco12587-010
Factor de crecimiento nervioso (NGF)SigmaN6009stock 50 µ g/ml en PBS/10% FBS
enzima digestiva, Liberase DH Grado de investigaciónRoche5401054001stock 2,5 mg/ml en
(Percoll)SigmaP1644-25ML
Bloque calefactorLabNet
70 µ filtro de célulasm Falcon352350
Etanol absoluto (200 pruebas)Fisher ScientificBP2818-500
Agua libre de RNasaFisher ScientificBP2484-100
Reactivo de descontaminación de RNasa, RNasa AWAYinvitrogen10328-011
2-mercaptoetanolVWREM-6010
Kit de extracción de ARN, RNeasy Plus Micro KitQiagen74034
Kit de DNasa, Set de DNasa sin RNasaQiagen79254
DNaseSigmaD5025-15KUstock 10 mg/ml en 0,15 M
NaCl Yoduro de propidioSigmaP4170-10MGstock 10 y micro; g/ml en
el sistema de electroforesis microfluídica PBS (TapeStation 2200)Agilent
solución de partículas de agua

Referencias

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