La generación de cardiomiocitos a partir de células madre pluripotentes in vitro permite el acceso a grandes cantidades de tejido cardíaco in vitro para aplicaciones clínicas y de ciencia básica. Este protocolo utiliza el factor atrializante Grem2 tanto para aumentar el número de cardiomiocitos obtenidos como para generar cardiomiocitos con un fenotipo auricular.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
La diferenciación de los cardiomiocitos auricular partir de células madre pluripotentes Uso del antagonista de BMP Grem2
En este artículo
Resumen
Resumen
Los protocolos para la generación de poblaciones de cardiomiocitos a partir de células madre pluripotentes se han desarrollado, pero estos generalmente producir células de fenotipos mixtos. Los investigadores interesados en seguir estudios con miocitos subtipos específicos requieren un enfoque más dirigido diferenciación. Por el tratamiento de células madre embrionarias de ratón (ES) con Grem2, un antagonista de BMP secretada que es necesario para la formación de cámara auricular in vivo, un gran número de células cardiacas con un fenotipo auricular se pueden generar. El uso de la línea de células madre pluripotentes MYH6-DsRed-Nuc, permite la identificación, selección y purificación de los cardiomiocitos. En este protocolo cuerpos embrionarios se generan a partir de células MYH6-DsRed-Nuc utilizando el método de la gota que cuelga y se mantienen en suspensión hasta que la diferenciación día 4 (D4). En las celdas D4 son tratados con Grem2 y se sembraron en placas recubiertas de gelatina. Entre D8-D10 grandes áreas contratantes se observan en las culturas y continúan expandiéndose ymATURALEZA través de d14. Molecular, análisis histológicos y electrophysiogical indican células en células tratadas con Grem2 adquieren características similares a auriculares proporcionan un modelo in vitro para estudiar la biología de los miocitos auriculares y su respuesta a diversos agentes farmacológicos.
Introducción
Las células madre pluripotentes son una herramienta poderosa para la generación y el estudio de células de una serie de tejidos difícil acceso para los estudios de investigación básica y pre-clínicos, especialmente en seres humanos 1-5. la modulación adecuada de las vías de señalización de desarrollo puede dirigir la diferenciación de células madre pluripotentes para el destino fenotípica deseada. Muchos protocolos se han desarrollado para generar cardiomiocitos (CMS) a partir de células madre pluripotentes 6-14. Estos protocolos implican generalmente la modulación de la superfamilia TFGβ (activina, BMP, y TGF) y las vías mediante la adición tem....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación de medios de cultivo celular, soluciones y reactivos.
- Preparar 500 ml de células madre embrionarias de ratón (mESC) de los medios de mezclado y filtrado estéril (0,2 micras de tamaño de poro) 445 ml Glasgow medio esencial mínimo (GMEM), 50 ml inactivado por calor suero fetal bovino (FBS), 5 ml de 100X concentró L- la sustitución de glutamina, 5 l de ratón recombinante del factor inhibidor de la leucemia (LIF) a 1 x 10 7 unidades por ml y 1,43 l ß-mercaptoetanol (concentración final es 50 mM). Almacenar a 4 ° C hasta que esté listo para su uso.
- Preparar 500 ml de embrioides cuerpo (EB) medio de diferenciación mediante la ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Antes de la diferenciación, las células madre pluripotentes deben ser compactos y libres de diferenciación espontánea. Las células que se muestran en la Figura 1A están listas para ser singularizado y se utiliza para colgar gotas como se describe en 5.1 de la sección de protocolo. Las células que se muestran en la Figura 1B están diferenciando de forma espontánea y no deben ser utilizados para la preparación de gotas colgantes.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo produce rutinariamente cultivos con un alto porcentaje de los CM que son característicos del linaje auricular. Al igual que con cualquier protocolo de diferenciación, la calidad de los mESCs antes de la diferenciación se debe prestar especial atención. mESCs deben ser controlados rutinariamente por la morfología adecuada (Figura 1A). Cualquier diferenciación espontánea que se produce antes de la formación de EB, limitar considerablemente la eficiencia de cardiogénesis y debe ser eliminado.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores de este manuscrito no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones y HL083958 HL100398 (AKH) y 2T32HL007411-33 "Programa de Mecanismos cardiovasculares: Formación en Investigación" (JB).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Aminoácidos no esenciales | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Placas de cultivo de tejidos | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Placas de Petri bacterianas | VWR | 25384-342 | |
| cm Placas de Petri bacterianas | VWR | 25384-092 | |
| Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 proteína recombinante | R& amperio; D Systems | 2069-PR-050 | |
| Unidades de filtro estériles | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatina (de piel de cerdo) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Estéril | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| Solución de tripsina-EDTA al 0,05% | Life Technologies 25300054 | ||
| DPBS, sin calcio, sin magnesio | Life Technologies | 14200 |
Referencias
- Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
- Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
