Il metodo descritto qui permette l'analisi time-lapse di sviluppo degli organi in embrioni di zebrafish utilizzando un microscopio a fluorescenza dissezione in grado di eseguire sezionamento ottico e semplici strategie di riadattamento per correggere la deriva focale e planare.
Per comprendere organogenesi, le alterazioni spaziali e temporali che si verificano durante lo sviluppo dei tessuti devono essere registrati. Il metodo descritto qui permette l'analisi time-lapse di sviluppo normale e compromessa rene in embrioni di zebrafish utilizzando un microscopio a fluorescenza dissezione attrezzata per l'illuminazione strutturata e acquisizione z-stack. Per visualizzare nefrogenesi, zebrafish transgenico (Tg (wt1b: GFP)) strutture del rene con fluorescente sono stati utilizzati. Difetti renali sono stati innescati da iniezione di un oligonucleotide antisenso morfolino contro il Wilms gene del tumore wt1a, un fattore noto per essere cruciale per lo sviluppo del rene.
Il vantaggio del setup sperimentale è la combinazione di un microscopio dello zoom con strategie semplici per i movimenti ri-regolazione in direzione X, Y o Z senza apparecchiature aggiuntive. Per aggirare drift focale che è indotto da variazioni di temperatura e vibrazioni meccaniche, Una strategia autofocus stata applicata invece di utilizzare una camera ambientale normalmente richiesta. Al fine di ri-regolare i cambiamenti di posizione a causa di una xy-drift, sono state impiegate le camere di imaging con griglie di trasferimento impressa.
In confronto a configurazioni più complesse per la registrazione time-lapse con sezionamento ottico come la scansione laser confocale o microscopi foglio di luce, un microscopio zoom è facile da maneggiare. Inoltre, offre dissezione benefici specifici del microscopio come l'elevata profondità di campo e una distanza di lavoro prolungato.
Il metodo per studiare organogenesi qui presentata può essere utilizzato anche con microscopi a fluorescenza stereo non in grado di sezionamento ottico. Anche se limitata per high-throughput, questa tecnica offre un'alternativa ai mezzi più complessa che viene normalmente utilizzato per la registrazione time-lapse di tessuti in via di sviluppo e le dinamiche di organi.
A seguito di gastrulazione, organogenesi è la prossima fase del ciclo di vita di un individuo. Esso comporta il riarrangiamento, interazione e molto spesso la migrazione di cellule a produrre tessuti e organi. Inaccuratezza nei processi alla base dello sviluppo di organi porta spesso a malattie che possono manifestarsi immediatamente o anche più tardi nella vita. Pertanto, la comprensione organogenesi è stato un grande sforzo in biologia dello sviluppo e della ricerca biomedica. Per essere in grado di esaminare lo sviluppo di un particolare organo, deve essere visibile anche attraverso la parete del corpo dell'embrione. Ciò consente la registrazione delle alterazioni spaziali e temporali che si verificano durante lo sviluppo. Inoltre al fine di analizzare l'importanza dei fattori coinvolti nella organogenesi, deve essere suscettibile di manipolazione.
Un organismo che è estremamente adatto per l'indagine dell'organogenesi in vivo è zebrafish. La sua trasparenza durante lo sviluppo embrionale in combinazione con l'uso di linee transgeniche fluorescenti permette l'osservazione delle dinamiche di localizzazione proteine e di espressione, così come la visualizzazione degli organi interni 1. Ciò fornisce un vantaggio unico per quanto riguarda la ricerca di sviluppo degli organi in tempo reale rispetto ai modelli di mammiferi i cui organi sono inaccessibili per l'analisi microscopica. Inoltre, diversi strumenti sono disponibili per manipolare lo sviluppo embrionale di zebrafish. Accanto alla generazione di linee mutanti, oligonucleotidi antisenso morfolino (MO) possono essere utilizzati per abbattere l'attività di particolari geni che sono coinvolti nello sviluppo di certi organi. MO sia bersaglio di un sito giunzione o la traslazione codone di inizio (AUG), e quindi interferiscono con splicing del pre-mRNA o la traduzione.
Il rene embrionale zebrafish, i pronephros, è un modello anatomicamente semplice ma prezioso per studiare lo sviluppo dei reni e la funzione di generazionees legate a malattie renali 2. Si compone di due sole unità funzionali chiamate nefroni. Ogni nefrone è composto da un glomerulo dove filtrazione del sangue avviene 3. Ulteriori componenti sono regione del collo breve e tubulo segmentato per la secrezione e il riassorbimento di soluti e del condotto, che termina nella cloaca 4. Indipendentemente dalla sua composizione semplice, l'organizzazione ed i diversi tipi cellulari dei pronephros zebrafish sono molto simili al rene mammiferi 5,6.
Un fattore, che è criticamente coinvolta nello sviluppo del rene, è codificata dal gene soppressore del tumore di Wilms WT1 7. Zebrafish possiede due paraloghi chiamati wt1a e wt1b essere espresso in un modello identico sovrapposizione, ma non durante lo sviluppo dei pronephros 8. Utilizzando zebrafish transgenico con strutture Pronefro GFP-marcato, è stato dimostrato che la completa knock-down di wt1a </ em> o di una particolare forma di giunzione porta a malformazioni gravi o lievi del rene embrionale, rispettivamente 9,10.
Il metodo descritto qui permette l'analisi time-lapse di nefrogenesi normale e compromessa in embrioni di zebrafish utilizzando un microscopio a fluorescenza dissezione attrezzata per sezionamento ottico tramite l'illuminazione strutturata. sezioni ottiche in generale consentono l'acquisizione di immagini che contengono solo informazioni di messa a fuoco. Out-of-focus informazioni può essere evitato vari approcci, come algoritmi matematici (ad es. Deconvoluzione), design ottico (ad es confocale a scansione laser microscopia) o una combinazione di entrambi (per esempio illuminazione strutturata).
Per indurre difetti di sviluppo del rene abbiamo usato un antisenso MO contro wt1a che è stato iniettato in una linea di zebrafish transgenico (Tg (wt1b: GFP)). Questa linea mostra GFP-fluorescenza nel glomerulo, il collo e la parte anterioreparte del tubulo 9,10. In confronto a configurazioni più complesse per le registrazioni time-lapse con sezionamento ottico come la scansione laser o microscopi foglio di luce, un microscopio zoom è facile da gestire e meno costoso. Inoltre, Attrezzature per illuminazione strutturata può facilmente essere combinato con apparecchiature convenzionali di fluorescenza (ad esempio fluorescenza lampada, filtri) e offerte sezionare vantaggi specifici microscopio ad esempio una distanza di lavoro estesa e ampio campo visivo. I problemi con la deriva sono stati risolti senza l'utilizzo di ulteriori attrezzature (camera ambientale, tavolo anti-vibrazione) di solito necessari per ottenere risultati stabili. Per correggere la deriva focale è stata stabilita una strategia di messa a fuoco automatica e le camere di imaging con griglie di trasferimento impresse sono stati utilizzati per ri-regolare il posizionamento a seguito di una deriva in direzione xoy.
Il metodo proposto può essere applicato anche per microscopi senza opzioni sezionamento ottico, come la fluorescenza stereo microscopes e offre un'alternativa ai mezzi più complessa che viene normalmente utilizzato per la registrazione time-lapse di tessuti in via di sviluppo e le dinamiche di organi.
Il pesce zebra è diventato un organismo modello popolare per gli studi di sviluppo dei vertebrati e modellizzazione di malattie umane. Perché zebrafish embrioni rimangono trasparenti, in via di sviluppo organi come il cervello e il cuore può essere osservato con un microscopio di preparazione standard. Approfittando di linee transgeniche con organo fluorescenza specifica consente valutazioni di organogenesi tutto diversi stadi di sviluppo all'interno di embrioni che vivono al microscopio a fluorescenza. Una limitazione per l'imaging dettagli strutturali di organi interi con epifluorescenza standard è l'impatto di segnali da oggetti sopra e sotto il piano focale. Questa luce out-of-focus non solo i risultati in contrasto diminuito e la risoluzione, ma anche può oscurare importanti strutture di interesse 13,14. Diverse tecniche quali la scansione laser confocal-, filatura confocal- disco o microscopia multiphoton sono state sviluppate per minimizzare le informazioni fuori fuoco e con ciò increascontrasto dell'immagine e così come risoluzione assiale. Un metodo alternativo per ottenere sezioni ottiche è la libera microscopia illuminazione strutturata al laser e scansione, un'ampia tecnica di illuminazione campo base, che è e semplice da implementare su un microscopio regolare 15. I risultati qui presentati illustrano che sezionamento ottico, raggiunto da illuminazione strutturata, implementato su un microscopio da dissezione e combinato con la ricostruzione di immagini messa a fuoco estesa, consente la visualizzazione dei dettagli strutturali del normale e disturbato lo sviluppo dei reni in zebrafish. In particolare, le cellule GFP-positive in morphants wt1a sono disperse a varie profondità focali, e le immagini di un solo piano con out-of-fuoco sfocatura sottostimerebbero tre complessità dimensionale del fenotipo.
Per seguire le dinamiche di organo organizzazione, riassetto o interruzione, time-lapse microscopia a fluorescenza è una potente seppur tecnica complessa. Durante il time-lapseimmagini lievi vibrazioni o variazioni di temperatura minori provocano derive in direzione X, Y o Z. Ciò richiede dispositivi aggiuntivi (camera ambientale, tavolo antivibrante) al fine di ottenere risultati stabili. Il metodo presentato utilizza la capacità di un microscopio da dissezione con un drive fuoco motorizzata per la registrazione di immagini in tempo-lapse senza dispositivi aggiuntivi. Per mantenere un focus stabile, una strategia autofocus è stato stabilito e una griglia trasferimento impresso sul fondo della camera di imaging è stato utilizzato per la correzione di x, y instabilità.
La corretta incorporamento dell'embrione è un passo fondamentale all'interno del protocollo. Alcuni pratica è necessaria per posizionare la struttura di interesse più vicino possibile al fondo di vetro e nelle immediate vicinanze alla rete senza sovrapposizione con esso.
Il principale vantaggio del metodo è che è uno strumento economico e semplice per l'osservazione diretta dei processi di sviluppo come la crescita e la migrazione nel soggiornoembrioni per diverse ore. Inoltre, la dissezione specifici microscopio vantaggi quali grande campo di vista e la distanza di lavoro estesa facilitare l'esame dei campioni più grandi, tra cui interi organi. Tuttavia, alcune limitazioni devono essere tenuti in considerazione. Pausa dell'esperimento per controllare e regolare la posizione rende la procedura richiede tempo e l'assenza di un controllo di temperatura robusta cambia il tempo di sviluppo "standard", che è definito come hr dopo la fecondazione a 28,5 ° C per 16 zebrafish. Un altro potenziale problema è la profondità ristretta di imaging nella animale, in particolare quando la struttura di interesse si trova all'interno del embrione o larve. Tale struttura è il glomerulo pronephric zebrafish, che si trova tra le somiti e il sacco vitellino. La profondità limitante per l'imaging del glomerulo è risultata essere di circa 200 micron, una distanza che si raggiunge dopo 5 giorni di sviluppo. Al contrario, le strutture fluorescenti che sono lituato vicino alla superficie dell'animale può essere ripreso per un tempo più lungo. Per esempio cellule epatiche sono accessibili per l'imaging almeno fino 9 dpf. Un'ulteriore limitazione è che l'immobilizzazione lungo termine dell'embrione o larve in agarosio e trattamento Tricaine indurre ritardo della crescita e edema cardiaco, rispettivamente. Perché questo può interferire con lo sviluppo normale, si raccomanda di limitare la durata della registrazione time-lapse per un certo periodo di interesse. Per garantire che durante strutture di imaging di interesse sviluppano normalmente è utile confrontare (alla fine) l'aspetto complessivo con quella di un animale tenuto sotto stesse condizioni sperimentali, ma senza incorporare e anestesia.
Registrazione di un z-pila di sezioni ottiche ogni 30 minuti per un periodo di 5 ore e il successivo calcolo della profondità delle immagini sfocate esteso fornito informazioni spaziali e temporali su eventi precoci del normale e disturbato lo sviluppo del rene che è stato indotto batterramento di wt1a y morfolino-mediata. Esperimenti morpholino atterramento precedentemente svolte hanno già dimostrato che Wt1a svolge un ruolo precoce e essenziale nella formazione pronephros ibridazione in situ con l'indicatore del rene 17,18 e l'occupazione del wt1b transgenico:. Linea GFP per lo sviluppo pronephros di imaging in tempo fisso sottolinea 9,10 rivelato che i risultati carenza wt1a nella morfogenesi glomerulare interrotto e non è riuscito specifica podocyte. In contrasto con questi approcci statici, registrazioni time-lapse visualizzare direttamente le dinamiche di nefrogenesi presto embrioni controllo e la migrazione delle cellule GFP-positive dalla regione pronephric in morphants wt1a. La possibilità di monitorare le cellule pervenute all'indirizzo sbagliato nel tempo permette una più dettagliata analisi del fenotipo.
In generale, il metodo che viene qui presentato fornisce un economico e facile da usare alternativa al complesso, e meno accessibili seTups normalmente utilizzati per time-lapse imaging come microscopio a scansione laser (dotato di una camera climatica e tavolo anti-vibrazione) o microscopio foglio di luce. La routine descritta per risolvere i problemi di deriva può essere applicato anche per eseguire time-lapse immagini su configurazioni senza opzioni sezionamento ottico, come microscopi a fluorescenza stereo.
La tecnica non è adatto solo per indagare sviluppo renale, ma può essere applicato anche per monitorare morfogenesi normale e difettoso di altri organi come il cuore o il fegato. Inoltre, il metodo può essere usato per osservare i vari processi più dinamici in organismi modello embrionali e adulte, come la guarigione o la rigenerazione delle ferite.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Thomas Bates per la lettura e migliorare il manoscritto in modo critico. Ringraziamo anche Christina Ebert e Sabrina Stötzer per la manutenzione del pesce.
Material | |||
Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. Nr. 9 |
0,5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
Graticule 5mm / 0.05mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
Equipment | |||
Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |