Method Article

Identificación de MyoD Interactome Usando Tandem Affinity purificación Acoplada a la Espectrometría de Masas

DOI:

10.3791/53924

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May 17th, 2016

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1Epigenetics and Cell Fate, UMR 7216 CNRS, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS - Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MyoD es un factor de transcripción miogénico con una gran capacidad para inducir la transdiferenciación miogénica de muchas líneas celulares no musculares completamente diferenciadas. Los mecanismos epigenéticos implicados en esta transdiferenciación son en gran parte desconocidos. Aquí describimos un método de purificación de doble afinidad seguido de espectrometría de masas para caracterizar exhaustivamente a los socios de MyoD.

Abstract

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Esquelética diferenciación terminal muscular comienza con el compromiso de las células precursoras mesodérmicas pluripotentes de mioblastos. Estas células tienen todavía la capacidad de proliferar o pueden diferenciar y fusible en miotubos multinucleados, que maduran adicionalmente para formar miofibras. Esquelético muscular diferenciación terminal está orquestada por la acción coordinada de diversos factores de transcripción, en particular los miembros de los factores o MFR reguladoras musculares (MyoD, Miogenina, Myf5 y MRF4), también llamado el bHLH myogenic factores de transcripción de la familia. Estos factores cooperan con los complejos de remodelación de la cromatina dentro elaborada red de regulación transcripcional para lograr la miogénesis esquelético. En esto, MyoD se considera el factor de transcripción miogénica principal en el desencadenamiento de la diferenciación terminal muscular. Esta noción se ve reforzada por la capacidad de MyoD para convertir células no musculares en las células del músculo esquelético. Aquí se describe un enfoque utilizado para identificar MyoDcompañeros de la proteína de una manera exhaustiva con el fin de dilucidar los diferentes factores que intervienen en la diferenciación terminal del esqueleto muscular. El objetivo a largo plazo es entender los mecanismos epigenéticos implicados en la regulación de los genes del músculo esquelético, es decir, las metas. MyoD. socios MyoD se identifican mediante el uso de Tandem Purificación por Afinidad (TAP-Tag) de un sistema heterólogo acoplado a la caracterización Espectrometría de Masas (MS), seguido de la validación del papel de los interlocutores relevantes durante la diferenciación terminal del esqueleto muscular. formas aberrantes de factores miogénicos, o su regulación aberrante, se asocian con una serie de trastornos musculares: miastenia congénita, distrofia miotónica, rabdomiosarcoma y defectos en la regeneración muscular. Como tal, factores miogénicos proporcionan un número de posibles dianas terapéuticas en trastornos musculares, tanto con respecto a los mecanismos que causan la enfermedad en sí y los mecanismos de regeneración que puede mejorar el tratamiento de la enfermedad. Por lo tanto, la understan detalladading de las interacciones intermoleculares y los programas genéticos controlados por los factores miogénicos es esencial para el diseño racional de terapias eficaces.

Introduction

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organismos multicelulares eucariotas están compuestos de diferentes órganos y tejidos. Cada tejido funcional tiene una expresión patrón de gen específico, que se determina en cada paso diferenciación. La diferenciación celular implica la activación de genes específicos, el mantenimiento de su expresión y, en general, el silenciamiento de un conjunto de genes, tales los que participan en la proliferación celular. la diferenciación del músculo esquelético, o miogénesis, es por tanto un proceso de múltiples pasos, que comienza con la determinación de las células madre mesodérmicas en mioblastos, y luego lleva a la diferenciación terminal de estas mioblastos en primera mono-nucleado, y a continuación, multi-nucleado, miotubos . Por lo tanto, los mioblastos se "determinan" las células, que son todavía capaces de proliferar, pero que están comprometidos con el linaje del músculo esquelético, y por lo tanto pueden diferenciar únicamente en las células del músculo esquelético, ya sea durante el desarrollo embrionario o en la regeneración del músculo adulto. El proceso de la terminal de músculo esquelético difierendife- está orquestada por un programa genético específico que comienza con la salida permanente del ciclo celular de las células precursoras de mioblastos que conduce a un silenciamiento definitiva de la proliferación asociada genes, tales como E2F genes diana 1. De hecho, durante el proceso de diferenciación terminal, detener la proliferación de mioblastos es un paso crucial que precede a la expresión de genes específicos del músculo esquelético y la fusión de mioblastos en miotubos 2. un programa de este tipo permite células madre musculares adultas, también llamadas células satélite, para diferenciar durante el proceso de regeneración tras una lesión del músculo esquelético.

Miogénesis mamífero es críticamente dependiente de una familia de miogénica hélice-bucle-hélice (bHLH) factores de transcripción MyoD, Myf5, MRF4 y Miogenina, a menudo referido como la familia de factores de determinación del esqueleto muscular o MFR (músculo factores reguladores) 3. Cada uno de ellos tiene un papel esencial en la especificación y difdiferencia- de las células del músculo esquelético y tiene un patrón de expresión específico 4 5-7. La activación de Myf5 y MyoD constituye el paso determinante que compromete a las células con el linaje miogénico, y la posterior expresión de miogenina desencadena la miogénesis con la activación de genes específicos de músculo esquelético, como MCK (Muscle creatina quinasa). Myogenic factores de transcripción bHLH cooperan con miembros de la familia MEF2 en la activación de genes musculares de loci previamente silenciosa 8. También estimulan la transcripción de genes del esqueleto muscular como heterodímeros con proteínas bHLH ubicua, E12 y E47, conocidas como proteínas E, que se unen las denominadas cajas E en varias regiones gen regulador de las 8. Twist, Id (inhibidor de la diferenciación) y otros factores regulan negativamente este proceso, al competir con MyoD de proteínas E de unión 8.

MyoD es considerado como el principal jugador en el desencadenamiento de la diferenciación terminal muscular 9 ya que tiene la capacidad de inducir un programa de determinación miogénica / diferenciación (trans-diferenciación) en muchos sistemas no musculares completamente diferenciadas 10-13. De hecho, la expresión forzada de MyoD induce la trans-diferenciación de los distintos tipos celulares, incluso las derivadas de otro origen embriológico 12. Por ejemplo, puede convertir MyoD hepatocitos, fibroblastos, melanocitos, los neuroblastos, y adipocitos en células musculares similares. La acción trans-diferenciación de MyoD implica una activación anormal del programa genético miogénica (en particular sus genes diana) en un entorno no-muscular, concomitante con el silenciamiento del programa genético original (en particular, la proliferación de genes).

En la proliferación de mioblastos, MyoD se expresa pero es incapaz de activar sus genes diana incluso cuando se une a sus promotores 14-16. Por lo tanto, el requisito de MyoD a ser expresadas de forma continua en mioblastos indiferenciados sigue siendo bastante elusiva. MyoD pudo reprimir sus genes diana debido a la contratación de las enzimas represivas cromatina modificadores en la proliferación de mioblastos antes de la carga de la activación de las enzimas de remodelación de la cromatina 14,17. Por ejemplo, en la proliferación de mioblastos, MyoD se asocia con co-represor transcripcional CAP-1, las histona desacetilasas (HDACs) y methyltransferases lisina represivos (KMTS), incluyendo la lisina de la histona H3 9 o H3K9 y H3K27 KMTS, y suprimir de forma activa su expresión genes diana mediante el establecimiento de un local represiva 14,17 estructura de la cromatina. Es importante destacar que un informe reciente indica que MyoD resulte directa metilado H3K9 por el KMT G9a lo que resulta en la inhibición de su actividad transactivadora 16.

Los mecanismos epigenéticos que participan en este trans-diferenciación de las células no musculares por MyoD son en gran parte desconocidos. En particular, algunas líneas de células son resistentes a la MyoD inducida trans-diferenciación. Por lo tanto, en células HeLa, MyoD es o bien inactiva oincluso podría funcionar como represor en lugar de activador de la transcripción debido a la falta de expresión de la subunidad BAF60C de la remodelación de la cromatina complejo SWI / SNF 18. Este modelo puede por lo tanto ser de elección para caracterizar mejor los mecanismos de la represión de genes MyoD inducida. También es adecuado para ensayar la capacidad de MyoD para inducir la cromatina medio ambiente represivo en su meta loci asociados con sus socios y por lo tanto descubrir los mecanismos represivos MyoD-dependiente en la proliferación de mioblastos para afinar la diferenciación terminal.

A continuación se describe el protocolo para la identificación de los socios MyoD utilizando Tandem Purificación por Afinidad (TAP-Tag) acoplada a espectrometría de masas caracterización (MS). El uso de células HeLa-S3 que expresan de forma estable Bandera-HA-MyoD permitido obtener suficiente material para purificar los complejos de MyoD a partir de extractos nucleares fraccionadas. La identificación de los socios MyoD en el sistema heterólogo fue seguido por validatien un sistema en cuestión.

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Protocol

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1. Preparación de las fracciones HeLa-S3 Nuclear Sal-extraíbles y con destino a la cromatina

  1. Colección de las células
    1. Crecer HeLa-S3 Flag-HA-MyoD y HeLa-S3 Flag-HA (línea de células de control) en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina (crecimiento medio) a 37 ° C y 5% de CO2 en un incubador húmedo.
      Nota: Las células HeLa-S3 de forma estable que expresan las células transducidas con el vector vacío (HeLa-S3 Bandera-HA) Bandera-HA-MyoD y HeLa-S3 podría ser bien establecidos usando el protocolo descrito en: 19,20, o proporcionados por los autores.
    2. Amplificar las células hasta 10 platos completamente confluentes de 150 mm de cada línea celular (células HeLa S3-Bandera-HA-MyoD y HeLa S3-Bandera-HA).
    3. Recoger el sobrenadante (contenga subpoblación no adherentes) en 5 L de spinner.
    4. Lavar la subpoblación adherente con 10 ml de PBS por placa de 150 mm, trypsinize células durante 1 min a tem habitaciónambiente (solución de tripsina-EDTA al 0,05%, 2 ml para un plato de 15 cm).
    5. Añadir 4 ml del medio por placa de 150 mm y recoger las células en tubos de 50 ml.
    6. Combinar el sobrenadante de la etapa 1.1.3 (en el 5 L spinner) y las células de la etapa 1.1.5, añadir 500 ml de medio de crecimiento pre-calentado de nuevo para cada línea celular.
    7. Transferencia de suspensión celular en 5 L spinner y crecer las células durante al menos 60 horas a 37 ° C y 5% de CO2 en un incubador húmedo.
    8. Añadir 500 ml de medio de crecimiento fresco y crecer las células durante 24 horas.
    9. Añadir 1 L de medio de crecimiento fresco y crecer las células durante 24 horas.
    10. Sacar 1 ml de la suspensión celular a contar las células y comprobar la viabilidad celular. Color de 30 l de suspensión celular con 30 l de 0,4% de azul de tripano y las células vivas contar (no azules) bajo el microscopio utilizando hemocitómetro.
    11. Mantener la densidad celular en 2 - 6 x 10 5 células / ml mediante la adición de medio de cultivo fresco todos los días; sea ​​inferior a 1 x 10 6 células / ml. El maximode volumen durante un 5 L spinner es de 2,5 L.
      Nota: Para los siguientes pasos, proceder por lotes 2 - 2,5 l de cultivo a una densidad de 1 x 10 6 células / ml. Repita los pasos del 01/01/12 a 01/01/14 para recoger cerca de 20 L (≈ 20 g de sedimento seco) de cada línea celular antes de proceder al siguiente paso.
    12. Precipitar las células por centrifugación a 500 xg durante 5 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante.
    13. Resuspender las células en 100 ml de PBS enfriado con hielo por pipeteo y se centrifuga a 500 xg durante 5 min a 4 ° C para lavar el pellet.
    14. Repetir el lavado mediante la resuspensión de las células con 25 ml de PBS enfriado en hielo, la transferencia de la suspensión en 50 ml de tubo y centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
      Nota: Los sedimentos celulares pueden ser o bien utilizarse inmediatamente o se congelan en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C durante varios días.
  2. Aislamiento de los núcleos
    Nota: Realice los pasos 1.2.1 - 1.4.3 en la cámara frigorífica.
    1. bufé era pre-enfriamientoRS y homogeneizadores.
    2. Si se utiliza material congelado, descongelar rápidamente los sedimentos celulares en baño de agua a 37 ° C.
    3. Resuspender 20 g (≈ 20 ml) de las células en 20 ml (un volumen igual al tamaño de la pella de células) de tampón hipotónico A (Tabla 3) utilizando 10 ml del tampón al principio, luego la adición de 5 ml, a continuación, añadir otros 5 ml. Se lavan las pipetas bien con tampón fresco para obtener el máximo de las células.
    4. Transferencia de suspensión de células 40 ml en el homogeneizador de pre-enfriada con una mano de mortero ajustada.
    5. Homogeneizar las células con 20 golpes en un homogeneizador (20 movimientos de entrada y salida) y la transferencia de suspensión celular en un tubo de 50 ml.
    6. Lavar el homogeneizador con 7 ml de tampón de sacarosa (1/3 del volumen inicial de la célula, la Tabla 3) para recuperar el máximo de células. Transferir dicha suspensión rápidamente en el tubo de 50 ml de la etapa 1.2.5 para preservar los núcleos y limitar las fugas.
    7. Manchar una alícuota de 30 l con 30 l de 0,4% trypan azul, analizar bajo el microscopio para controlar la eficiencia de lisis (lisis si el tiene éxito, todos los núcleos deben ser de color azul). Si es necesario, repetir el paso de homogeneización.
    8. Centrifugar durante 7 min a 10.000 xg y 4 ° C para sedimentar los núcleos. Guardar el sobrenadante como la fracción citoplasmática.
  3. Preparación de fracción nuclear Sal-extraíble (SE)
    1. Resuspender el precipitado núcleos en 8 ml de tampón de sacarosa (un volumen igual al tamaño de la pastilla núcleos). Añadir gota a gota mientras que se mezcla a fondo en un vórtice 8 ml de tampón de alta concentración de sal (volumen pellet 1 núcleos, Tabla 3) para obtener una concentración final de NaCl 300 mM. Incubar durante 30 min en hielo y la mezcla cada 5 min.
    2. Disminuir la concentración de NaCl a 150 mM mediante la adición de 8 ml (1/3 del volumen total) de tampón de sacarosa. Centrifugar durante 10 min a 13.000 xg y 4 ° C. Recoger el sobrenadante (fracción extraíble con sal nuclear, SE).
      Nota: Ninguno de ellos continúe en el paso 1.3.3 o salir de la SEfracción en hielo durante la preparación de la fracción de cromatina determinada y luego ultra centrífuga ambas fracciones de forma simultánea.
    3. Ultra-centrífuga SE durante 30 min a 85.000 xg a 4 ° C. Tome sobrenadante (≈ 26 ml).
    4. Congelar parte alícuota de 100 l en nitrógeno líquido. Continúe con el paso 2 "proteína compleja de purificación", utilizando el resto del extracto.
      Nota: La alícuota es para ser utilizado como un control de entrada durante la etapa 5.1.1.
  4. Preparación de la fracción unida a la cromatina
    1. Resuspender el precipitado (de la etapa 1.3.5.) Meticulosamente en 7 ml (un volumen igual al tamaño de la pastilla) de tampón de sacarosa.
    2. Añadir CaCl 2 a una concentración final de 1 mM (28 l de 0,5 M CaCl 2 para 14 ml de suspensión) para activar MNase (etapa 1.4.4) y mezclar.
    3. suspensión de precalentamiento durante 1 min a 37 ° C.
    4. Añadir 70 l de nucleasa micrococcal (MNase) para obtener una concentración final de 0,0025 / l (dilución 1/200 de 0,5 TU / l de valores) y mezclar.
    5. Incubar exactamente 12 min a 37 ° C. Mezclar todos los 4 min.
    6. Colocar inmediatamente la reacción en hielo.
    7. Para detener la actividad MNase, añadir 112 l de 0,5 M EDTA pH 8,0 (1/125 dilución) a una concentración final de 4 mM. Incubar durante 5 minutos en hielo.
    8. Someter a ultrasonidos 5 veces durante 1 min a alta amplitud, entre dos sonicaciones permitir un descanso de 1 min (10 min en total).
    9. Ultracentrífuga durante 30 min a 85.000 xg y 4 ° C.
    10. Recoger el sobrenadante (fracción enriquecida nucleosoma, NE, ≈ 12 ml).
    11. Congelación de 50 l alícuota en nitrógeno líquido. Continúe con el paso 2 "proteína compleja de purificación", utilizando el resto del extracto.
      Nota: La alícuota es para ser utilizado como un control de entrada durante la etapa 5.1.1.

2. La proteína Complejos Purificación

Nota: Se procede de extractos paralelos de cada línea celular (HeLa-S3 Bandera-HA-MyoD y el control, Hela-S3 Bandera-HA).

  1. La purificación basado Bandera-
    1. Prelavado resina de la bandera. Utilice 600 l de resina de la bandera (del 50% existencias comerciales) para cada punto experimental (SE y NE fracciones para cada línea celular).
    2. La resina se transfiere a 15 ml tubo, resuspender en 13 ml de tegn frío (Tabla 3), se centrifuga durante 2 minutos a 1000 xg y eliminar el sobrenadante. Repetir 5 veces. Después de la resina de la bandera de volver a suspender último lavado en un volumen idéntico de Tegn (300 l para cada punto experimental).
    3. Para cada punto experimental, mezclar 600 l de resina de la bandera de lavado y los correspondientes extractos de proteínas (en un tubo de 15 ml para el NE 12 ml y en un tubo de 50 ml para las fracciones 26 ml SE, respectivamente). Incubar durante la noche en una rueda que gira a 4 ° C.
    4. Centrifugar durante 2 minutos a 1.000 xg a 4 ° C, dejar a un lado el sobrenadante y mantener a 4 ° C hasta que el resultado de la prueba de eficiencia de purificación (2.2).
    5. Para las muestras SE, resuspender la resina Flagen 4 ml de Tegn y la transferencia a un tubo de 15 ml. Repita este paso 3 veces, cada vez la transferencia al mismo tubo de 15 ml para evitar la pérdida de cuentas. Centrifugar 2 min a 1.000 xg y 4 ° C y retirar el sobrenadante.
    6. resina de la bandera de Wash 7 veces en un tubo de 15 ml utilizando 13 ml de tegn y centrifugando 2 min a 1.000 xg y 4 ° C.
    7. Después del último lavado, resuspender en 1 ml Tegn y transferencia en un tubo de 1,5 ml bajos vinculante. Centrifugar 2 min a 1.000 xg y 4 ° C y separar el sobrenadante.
    8. Resuspender en 200 l de solución de péptido Flag en 4 mg / ml a pH 7,8 para cada punto experimental. Mezclar los granos y los péptidos. Añadir 200 l de tampón de tegn y se incuba a 4 ° C durante al menos 4 horas o durante la noche para eluir las proteínas unidas.
    9. Centrifugar durante 2 minutos a 1000 xga 4 ° C y transferir la resina y el sobrenadante (la bandera de eluato) a una columna de centrifugación vacío colocado en un tubo de 2 ml.
    10. Se centrifuga la columna, recoger los sobrantes de sobrenadante en el tubo de 2 ml.
    11. Recoger la resina de la bandera añadiendo tampón Tegn a la columna y pasar a la segunda elución de la bandera con 200 l de solución de péptido Flag (4 mg / ml) durante la noche a 4 ° C para cada punto experimental.
    12. Repita los pasos 2.1.9 - 2.1.10 para recoger segunda elución. Combinar primer y segundo eluidos.
  2. Prueba de la eficacia de la purificación
    Nota: Durante el paso 2.1.11 a 2.1.12, lleve a cabo SDS-PAGE y tinción de plata (2.2.1 - 2.2.2).
    1. Tomar 15 l de los eluidos, añadir 5 l de tampón de carga de 4x y 2 l de 10x agente reductor, hervir durante 5 min a 96 ° C y ejecutar un SDS-poliacrilamida al 4 - 12% gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Teñir el gel utilizando el kit de tinción de plata (siga las instrucciones del fabricante). Si hay claras diferencias en los patrones de proteínas entre Bandera-HA-MyoD y Bandera-HA eluidos simulacros, en particular, la banda de la bandera-HA MyoD (alrededor de 50 kDa, la figura 1A), pasar a la siguiente step.
  3. La hemaglutinina (HA) Purificación basado
    1. resina Wash HA mediante la transferencia en 15 ml de tubo, de resuspender en 13 ml de tegn y centrifugando 2 min a 1000 xg a 4 ° C. Repita el paso de lavado 5 veces. Después de volver a suspender las perlas último lavado en un volumen igual de tampón Tegn.
      Nota: El volumen se ajusta de acuerdo con la eficiencia de purificación basado-Flag. Comience con 300 l del 50% en acciones comerciales para cada punto experimental.
    2. Por transferencia de resina HA para cada punto experimental en un tubo de unión de baja de 1,5 ml. Centrifugar 2 min a 1000 xg a 4 ° C, a eliminar el máximo de la solución tampón de lavado (Tabla 3) y añadir los eluatos de purificación basado-Flag a la resina HA.
    3. Incubar los tubos en la rueda giratoria durante la noche a 4 ° C.
    4. Centrifugar durante 2 minutos a 1.000 xg a 4 ° C, dejar a un lado el sobrenadante y mantener a 4 ° C hasta que el resultado de la prueba de eficiencia de purificación (2.3.12.).
    5. Resuspender la resina de HA en 0,5 ml de Tegn, traslado a una nueva unión de 1,5 ml tubo de baja. Repetir una vez resuspensión añadiendo al mismo tubo de 1.5 ml para evitar la pérdida de cuentas y centrífuga 2 min a 1.000 xg y 4 ° C. Aspirar el sobrenadante.
    6. Lavar los granos 8 veces utilizando 1 ml de tegn cada vez, centrifugación 2 min a 1.000 xg y 4 ° C y la eliminación de sobrenadante (evitar los granos pierden). Después del último lavado, transferir las perlas en tubos de 0,5 ml.
    7. Eliminar la mayor cantidad posible sobrenadante. Añadir 100 l de solución de HA péptido libre (4 mg / ml) a pH 7,8 en perlas para eluir las proteínas unidas. Incubar en la rueda giratoria durante la noche a 4 ° C.
      Nota: La cantidad de HA-péptido necesita ser ajustado dependiendo de la abundancia de los complejos.
    8. Centrifugar durante 2 minutos a 1000 xga 4 ° C y transferir la resina y el sobrenadante (HA eluato) a una columna de centrifugación vacío colocado en un tubo de 2 ml.
    9. Centrifugar la columna para recoger el sobrante de sobrenadante en el tubo de 2 ml.
    10. Realizar una segunda elución con 100 l de péptido HA (4 mg / ml) para cada punto experimental. Incubar en la rueda giratoria durante la noche a 4 ° C. Repita el paso 2.3.8 - 2.3.9 para recoger segunda elución.
    11. Combinar primer y segundo eluidos.
    12. Prueba de eficacia de la purificación por SDS-PAGE y tinción con plata (ver pasos 2.2.) (Figura 1A).
    13. Se concentra el eluato de HA a 30 l utilizando unidades de filtración centrífuga con un 10 kDa de corte (límite de peso molecular nominal, NMWL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    14. Divida las muestras concentradas en dos partes: 22,5 (3/4) y 7.5 (1/4) l. Congelamiento rápido 1/4 de las muestras en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. Utilice la parte 3/4 para el paso 3.
      Nota: La parte congelada 1/4 se va a utilizar para la confirmación de los resultados de espectrometría de masas por transferencia de western (véase el paso 5.1).

Análisis 3. Espectrometría de Masas

Nota: Los siguientes pasos deben ser discutidos con la instalación de espectrometría de masas que llevará a cabo el análisis.

  1. Suplemento 3/4 (22,5 l) de las muestras con 7,5 l de tampón de carga de 4x y 3,3 l de 10x agente reductor y hervir durante 5 min a 96 ° C.
  2. Cargar las muestras en un SDS-poliacrilamida al 4 - 12% de gel. gel de funcionar a 150 V constantes durante 5 minutos para permitir que todas las proteínas para entrar en el gel sin separación.
  3. Se lava el gel con agua; fijar, por 20 - 30 min con solución de fijación (ácido acético 10%, 50% de metanol, 40% de agua ultra-limpio) y luego lavar el gel fijo 5 veces en agua ultra-limpio.
  4. Cortar las bandas que contienen las proteínas, almacén en 1 ml de agua en un tubo de 1,5 ml y se enviará a las instalaciones de espectrometría de masas.

Análisis 4. Datos

Nota: Esta es una guía general para el análisis. Los pasos exactos dependerán del modo particular de los datos dados por la instalación MSutilizado para realizar el análisis (por ejemplo, 21,22).

  1. Compare la lista de las proteínas identificadas en los eluidos "MyoD" con la lista obtenida de preparación de control negativo correspondiente. Excluir del análisis de las proteínas que se encuentran en ambas listas.
  2. Eliminar las proteínas que tienen ≤2 número total de péptidos identificados a partir de la lista restante.
  3. Anotación funcional de acceso y la clasificación funcional de la lista obtenida de proteínas utilizando recursos DAVID Bioinformática (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) y clasificar la lista de las proteínas 23,24.
  4. (Opcional) Remover de la lista "autoestopistas", cargadas proteínas no nucleares con una fuerte accidental de unión a ADN cargado negativamente 25. Estos contienen proteínas del citoesqueleto, citoplásmicos, mitocondriales, y los receptores de membrana (plegamiento de proteínas, las proteínas del grupo citoesqueleto y diversas en las Tablas 1 y 2).
  5. Comparación de las listas obtenidas de los interactores MyoD de fracciones SE y NE para identificar las proteínas y las proteínas comunes específicas para cada fracción (Figura 2).

5. Confirmación de Interactianos identificadas por Western Blot

  1. Confirmación en HeLa-S3 Bandera-HA-MyoD y HeLa S3-Bandera-HA
    1. muestras de eluato descongelación obtenidos en el paso 2.3.14 (7,5 l) en hielo. Añadir 12 l de tampón de tegn, 10 l de tampón de carga de 4x y 3 l de 10x agente reductor. Hervir las muestras durante 5 minutos a 96 ° C.
    2. Preparar muestras de entrada para el Western Blot.
      1. Descongelar alícuotas de los pasos 1.3.9 y 1.4.11 y medir la concentración de proteínas, por ejemplo utilizando el kit BCA (siga las instrucciones del fabricante).
      2. Utilizar 15 mg de la proteína por carril. Medir la cantidad apropiada de extracto y ajustar el volumen de la muestra hasta 15 l con tampón Tegn.
      3. Añadir tampón de carga 4x 5 ly1,5 l 10x agente reductor. Hervir las muestras durante 5 minutos a 96 ° C.
    3. Realizar un análisis de Western blot con anticuerpos específicos de interés (para el candidato socio identificado durante el análisis de MS) usando 15 l de muestras de eluato. Utilice extractos de entrada como control de los niveles de proteína endógenos (Figura 3A).
  2. La confirmación en el sistema celular relevante
    1. Preparación de extracto nuclear total de mioblastos C2C12 de ratón.
      1. Crecer C2C12 mioblastos de ratón en medio DMEM suplementado con suero de ternera fetal 15%, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina a 37 ° C y 5% de CO2 en un incubador húmedo. Nunca exceda el 80% de confluencia celular para mantener las células en estado de proliferación.
      2. Creciendo al menos dos placas de 150 mm de C2C12 por un punto (un anticuerpo) de inmunoprecipitación (IP). Aspirar el medio, lavar células dos veces con 10 ml de PBS.
      3. Raspar las células y recoger en tubo de 15 ml. Centrifuge a 250 g durante 5 min a 4 ° C. sobrenadante de descarte.
      4. Estimar el volumen del sedimento celular (= células V). Resuspender suavemente el sedimento en 3 volúmenes V de células de tampón hipotónico B para interrumpir membrana citoplasmática (Tabla 3).
      5. Añadir 0,44 x volumen de la celda V de 10% NP-40 para alcanzar la concentración final de 1% (v / v). Invertir suavemente el tubo varias veces para mezclar.
      6. Añadir 0,89 x volumen de la celda V de SR (Tabla 3) para preservar la integridad núcleos. Invertir suavemente el tubo varias veces para homogeneizar la suspensión, y se centrifuga durante 5 min a 2000 xg para sedimentar los núcleos.
      7. Eliminar el sobrenadante (fracción citosólica). Estimar el volumen de los núcleos de pellets (= V nuc). Resuspender pellet núcleos en un solo volumen V nuc de tampón de sacarosa.
      8. Añadir gota a gota mientras que se mezcla a fondo en un vórtice un volumen V nuc de tampón de sal alta para obtener una concentración final de 300 mMNaCl, y se incuba durante 30 minutos en hielo. Mezclar todos los 5 min.
      9. Añadir un volumen V nuc de tampón de sacarosa (para disminuir la concentración de NaCl a 150 mM) y CaCl 2 (concentración final 1 mM). Mezcla.
      10. suspensión de precalentamiento durante 1 min a 37 ° C, añadir micrococcal nucleasa para obtener la concentración final del 0,0025 U / l (1/200 desde el almacén de 0,5 U / l). Mezcla.
      11. Incubar exactamente 12 min a 37 ° C. Mezclar todos los 3 min.
      12. Colocar inmediatamente reacción sobre hielo y se añade EDTA (concentración final de 4 mM) para detener la actividad MNase. Incubar durante 5 minutos en hielo.
      13. Someter a ultrasonidos 5 veces para cada 0,5 minutos a alta amplitud. Entre dos sonicaciones, permite una interrupción de 0,5 minutos (5 minutos en total).
      14. Ultra-centrifugar durante 30 minutos a 85.000 x g y 4 ° C. Recoger el sobrenadante (extracto nuclear total).
      15. Medir la concentración de proteínas del extracto nuclear total, por ejemplo utilizando el kit BCA (siga las instrucciones del fabricante) y proceder immediatEly al paso 5.2.2.
    2. La inmunoprecipitación (IP) de MyoD endógeno.
      1. Comprobar la validez de los extractos clara, lavar 10 l de proteína G bolas de agarosa para cada punto IP.
        1. Transferir el volumen necesario de la proteína G perlas de agarosa en un tubo de 1,5 ml, se resuspenden en 1,4 ml de tegn frío, se centrifuga durante 2 min a 1.800 xg y eliminar el sobrenadante. Repetir 3 veces.
      2. Mezclar los granos proteína G agarosa pre-lavar con el volumen adecuado de extracto nuclear total. Utilizar 500 g de proteína total extracto nuclear por punto IP.
      3. Incubar en una rueda giratoria a 4 ° C durante 2 horas para pre-limpiar los extractos.
      4. Centrifugar durante 5 minutos a 1800 xga 4 ° C. Mantenga sobrenadante.
      5. Mezclar 5 g de MyoD Ab o 5 mg de IgG de conejo con 500 g de extractos nucleares totales pre-limpiado en tubos de 1,5 ml de unión de baja. Añadir Tegn de almacenar hasta 1 ml. Incubar en una rueda giratoria a 4 ° C durante la noche.
        Nota: Realizar la fespués de pasos durante el paso 5.2.2.3.
      6. Prelavado proteína de 7,5 l / G solución de cuentas de valores por punto IP.
        1. Transferir el volumen necesario de perlas en un tubo de 1,5 ml, perlas de volver a suspender en 1 ml de tegn y centrifugar a 1800 xg a 4 ° C durante 2 min. Eliminar el sobrenadante. Repetir 3 veces.
      7. Proteínas Resuspender A / G cuentas en 1,5 ml de solución (Tabla 3) y se incuba en una rueda giratoria de bloqueo durante la noche a 4 ° C.
      8. Centrifugar extractos nucleares totales incubadas con Abs (paso 5.2.2.5) a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Mantenga sobrenadante.
      9. Centrifugadora bloqueado resina de Proteína A / G (paso 5.2.2.7) a 1.800 xg durante 2 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender en 1 ml de tampón de tegn. Vuelva a centrifugar a 1.800 xg durante 2 min a 4 ° C para lavar tampón de bloqueo.
      10. Resuspender bloqueado proteína A / G resina en 1 ml de tampón Tegn y alícuota en nuevos tubos de baja unión a proteínas para obtener 7,5 l bloUna resina de proteínas cked / G por punto IP. Centrifugar a 1800 xga 4 ° C durante 2 min y eliminar la mayor cantidad posible del sobrenadante.
      11. Añadir los extractos nucleares totales incubadas con el Abs (o IgG control) a la resina A / G. Mezclar e incubar durante 2 horas a temperatura ambiente (RT) en una rueda giratoria.
      12. Centrifugar la suspensión 1.800 xg a TA durante 2 min. Desechar el sobrenadante, resuspender en 1 ml de tampón de lavado y suspensión de la transferencia en nuevos tubos de unión de baja. Se incuba a RT en una rueda giratoria durante 5 min.
      13. suspensión Centrifugar a 1800 xg a TA durante 2 min, se resuspenden en 1 ml de tampón de lavado y se incuba a RT en una rueda giratoria durante 5 min. Repetir 4 veces. Para la última transferencia de lavado a un nuevo tubo de unión de baja.
      14. Eliminar máxima del sobrenadante. Añadir 7 l de tampón de lavado, 7 l de tampón de carga y 4x 3 l de 10x agente reductor a las perlas, mezclar y hervir durante 5 min a 96 ° C.
      15. Realizar un análisis de Western blot con anticuerpos de interest (específico para el candidato socio para la proteína precipitada inmunológico). Utilice 1% (5 g) de extractos de entrada como control de los niveles de proteína endógenos (Figura 3B).

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Results

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Para entender la regulación de la actividad MyoD, se realizó la caracterización exhaustiva de los complejos MyoD utilizando purificación bioquímica, basado en la inmunopurificación de una forma de doble etiquetado de MyoD seguido por espectrometría de masas (MS). El uso de la línea celular HeLa-S3 expresar MyoD Bandera de etiquetado-HA y una línea celular de control que expresa permisos Bandera-HA para obtener material suficiente para purificar el complejo MyoD mediante la realización de...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El método presentado permite la identificación exhaustiva de los socios de un factor de transcripción, MyoD. Se reveló socios MyoD en un sistema heterólogo resistente a la diferenciación inducida por MyoD, es decir, células HeLa-S3. Por lo tanto, por definición, los socios de MyoD identificados se expresan de forma ubicua. Estos incluyen factores generales y específicos de la secuencia de transcripción, enzimas de la cromatina modificadores de proteínas, procesamiento del ARN, quinasas (Tablas 1 y

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El trabajo en el laboratorio de Ait-Si-Ali fue apoyado por la Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Instituto Nacional del Cáncer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; La Université Paris Diderot y el ''¿Quién soy yo?'' Laboratorio de Excelencia #ANR-11- LABX-0071 financiado por el Gobierno francés a través de su programa ''Inversiones para el Futuro'' operado por la ANR bajo la subvención #ANR-11-IDEX-0005-01. EB contó con el apoyo de una beca del INCa.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Líneas celulares
HeLa-S3ATCCCCL-2.2
C2C12ATCCCRL-1772
Equipment
SpinnerCorning778531
Homogeneizador:  Homogeneizador de onza Wheaton432-1273 y 432-1271
Dispositivo agitador para hilanderasBellco778531
SonicatorDiagenodeUCD 200
HemocitómetroMarienfeld Superior 640610
Tubos de baja ligerezaSorenson27210
Columna de centrifugación vacíaBio-Rad7326204<
strong>Reagents
SDS-poliacrilamida 4-12%  gelLife technologiesNP0336BOX
4x tampón de carga Life technologiesNP0007
Agente reductor 10xLife technologiesNP0004
Kit de tinción de plataLife technologiesA8592
Unidades de filtro centrífugo, 10KMilliporeUFC501024
Proteína G perlas de agarosaSigma-AldrichP4691
Proteína A/G  ResinaThermo Scientific53132
Resina Flag (gel de afinidad anti-Flag M2-agarose)Resina Sigma-AldrichA2220
HA (monoclonal Anti-HA agarosa)Sigma-AldrichA2095
MNaseSigma-AldrichN3755
Péptido libre de banderas (DYKDDDDK)Ansynth Service BVSíntesis personalizadaResuspender hasta 4 mg/ml en 50 mM Tris-HCl, pH 7,8
Péptido libre de HA (YPYDVPDYA)Ansynth Service BVSíntesis personalizadaResuspender hasta 4 mg/ml en 50 mM Tris-HCl, pH 7,8
Kit de ensayo de proteínas a base de ácido bicinconínico : Kit BCAThermo Scientific23225
Inhibidores de la proteasaSigma-AldrichS8830
Quimioluminiscencia mejorada (ECL) a base de luminol Sustrato HRPTecnologías de vida34075
BSASigma-AldrichA9647
ADN de esperma de salmón cortado (Sal sódica de ácido desoxirribonucleico de testículos de salmón)Sigma-AldrichD1626
Tetraclorhidrato de esperminaSigma-AldrichS1141
EspermidinaSigma-AldrichS0266
GlicerolSigma-AldrichG5516
PBSSigma-AldrichD8537
Tampón de funcionamiento MOPSLife technologiesNP0001
DMEM (alta glucosa)Sigma-AldrichD0822Pre-calentamiento  a 37 ° C antes
de usar Tripsina-EDTA (0.05% rojo de fenolLife technologies25300-054
SueroGE ciencias de la vida para la salud PAA A15-102Cada lote de suero debe ser analizado primero para sus células.
Penicilina y estreptomicina Life technologies15140-122
Solución de Trypan Blue, 0.4%Life technologies15250-061
Agua (filtrada estéril)Sigma-AldrichW3500
Anticuerpos
HA de rata (12CA5)Roche11583816001
FlagSigma-AldrichA8592
MyoDSanta Cruzsc-32758Para usar para Western blot
MyoDSanta CruzSC-760Para usar para inmunoprecipitación y Western blot
CBFbetaSanta CruzFL-182 
HP1alphaEuromedex2HP2G9
HP1betaEuromedex1MOD1A9AS
HP1gammaEuromedex2MOD1GC
Suv39h1Tecnología de señalización celular8729
BAF47BD Biosciences612111
Myf5Santa CruzSC-302
TubulinSigma-AldrichT9026
ActinaSigma-AldrichA5441
IgG RatónSanta CruzSC-2025
IgG ConejoSanta CruzSC-2027
Cabra anti-rata -HRPSigma-AldrichA9037
Cabra anti-conejo -HRPSigma-AldrichA6154 
Cabra anti-ratón -HRPSigma-AldrichA4416

References

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