Murino Hind Limb largo Bone La disección y el aislamiento de médula ósea

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para la disección de huesos largos de extremidades traseras (fémures y tibias) del ratón de laboratorio. Describimos además una técnica rápida para el aislamiento de la médula ósea de estos huesos que utiliza la centrifugación para la extracción de la médula ósea del espacio de la médula ósea.

Resumen

La investigación del hueso y la médula ósea es crítica en muchos campos de investigación, incluyendo la biología ósea básica, la inmunología, la hematología, la metástasis del cáncer, la biomecánica y la biología de las células madre. Sin embargo, a pesar de la importancia del hueso en estados sanos y patológicos, es un órgano poco investigado debido a la falta de conocimientos especializados sobre la disección ósea y el aislamiento de la médula ósea. Los ratones son un organismo modelo común para estudiar los efectos sobre el hueso y la médula ósea, lo que requiere un método estandarizado y eficiente para la disección de huesos largos y el aislamiento de la médula ósea para el procesamiento de grandes cohortes experimentales. Describimos un procedimiento de disección sencillo para la extirpación del fémur y la tibia que es adecuado para aplicaciones posteriores, que incluyen, entre otras, el análisis histomorfológico y las pruebas de fuerza. Además, describimos un procedimiento rápido para el aislamiento de la médula ósea de los huesos largos mediante centrifugación con un tiempo de manipulación limitado, ideal para la clasificación de células, el cultivo primario de células o la extracción de ADN, ARN y proteínas. El protocolo está optimizado para el procesamiento rápido de muestras para limitar el error experimental y está estandarizado para minimizar la variabilidad de usuario a usuario.

Introducción

El estudio de los huesos largos y las células de la médula ósea es fundamental para una miríada de disciplinas de investigación, que incluyen, entre otras, la biología ósea, la biología del cáncer, la inmunología, la hematología y la biomecánica. El hueso es un órgano altamente dinámico que, junto con el cartílago, forma el esqueleto para proporcionar soporte mecánico contra la carga y protección de los órganos internos. Además, los componentes minerales del hueso son un sumidero de almacenamiento para las moléculas de señalización críticas calcio y fósforo, así como para otros factores¹. Por último, los huesos albergan la médula ósea y, junto con los osteoblastos formadores de hueso metabólicamente activos y los osteoclastos reabsorbentes de hueso, proporcionan el nicho de células madre necesario para el mantenimiento de las poblaciones de células hematopoyéticas y linfoides.

El hueso y la médula ósea se ven afectados en muchos trastornos, lo que a menudo conduce a la disfunción de la médula ósea, dolor óseo severo y fractura patológica. El hueso es un sitio común de metástasis en muchos tumores sólidos, sobre todo en el cáncer de mama y el cáncer de próstata, donde las células tumorales interactúan directamente con el nicho de la médula ósea para iniciar el círculo vicioso de la metástasis ósea y desplazar a las células madre hematopoyéticas^2,3. Las neoplasias malignas hematopoyéticas, como el mieloma y la leucemia, se caracterizan por una disfunción de la médula ósea, así como por una desregulación del remodelado óseo sano¹. Otros trastornos esqueléticos no malignos también son áreas activas de investigación, como la osteoartritis, la osteoporosis, la escoliosis y el raquitismo. Incluso en un individuo sano, la falla biomecánica en un hueso conduce a una fractura dolorosa. Todos estos trastornos representan áreas activas de investigación con el objetivo de identificar nuevas medidas preventivas y regímenes de tratamiento para reducir la morbilidad y la mortalidad.

Para investigar la plétora de funciones del hueso y la médula ósea, tanto en condiciones fisiológicas como patológicas, es fundamental que los investigadores dispongan de un método estandarizado simple y eficiente para la disección de los huesos largos del ratón para el procesamiento rápido de grandes experimentos in vivo. El protocolo de disección descrito aquí es adecuado para todos los análisis de huesos largos, incluidas las imágenes ex vivo, la histología, la histomorfometría y las pruebas de resistencia, entre otros. Del mismo modo, un método estandarizado de aislamiento de médula ósea con una alta recuperación de células de médula ósea y una baja variabilidad entre usuarios es importante para el análisis experimental, como la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o la PCR cuantitativa (qPCR), así como para aplicaciones posteriores, como el cultivo celular primario de células de médula ósea.

Protocolo

Todos los animales de trabajo fue aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo de acuerdo con las recomendaciones descritas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.

La disección 1. extremidad posterior del hueso largo

1. La eutanasia el ratón de acuerdo con las directrices institucionales.
2. Coloque el ratón en una posición supina y colocar fijando las cuatro patas a través de las almohadillas de las patas del ratón debajo de la articulación del tobillo.
3. Pulverizar el ratón con un 70% de etanol, rociar a fondo las piernas.
4. Hacer una pequeña incisión a la derecha de la línea media en el abdomen inferior, justo por encima de la cadera.
5. Extender la incisión en la pierna y más allá de la articulación del tobillo.
6. Tire hacia atrás la piel y cortar el músculo cuádriceps anclado al extremo proximal del fémur para exponer la cara anterior del fémur y el pasador hacia fuera de la pierna, colocando el pasador en un ángulo de 45 grados con respecto a la placa.
7. Con el blade de la tijera contra el lado posterior del fémur, cortar los tendones de la corva lejos de la articulación de la rodilla.
8. Tirar de la piel y los músculos isquiotibiales anclados al extremo proximal del fémur para exponer el lado posterior del fémur y el pasador hacia fuera de la pierna, colocando el pasador en un ángulo de 45 grados con respecto a la placa.
9. Con las pinzas, mantenga el extremo distal del fémur, justo por encima de la articulación de la rodilla. Guía de las cuchillas de las tijeras a cada lado del eje femoral hacia la articulación de la cadera, teniendo cuidado de no cortar en la propia fémur.
10. Después de alcanzar la cabeza del fémur, indicado por las tijeras se abren ligeramente, torcer la tijera con la hoja superior de la tijera se mueven directamente sobre la cabeza del fémur para dislocar el fémur, con cuidado de no romper el hueso debajo de la cabeza del fémur.
11. Agarre la parte superior del eje femoral con el fórceps, cortar el tejido blando lejos de la cabeza femoral para liberarla de acetábulo.
12. Tire todo el hueso de la pierna, incluyendofémur, la rodilla, y la tibia, arriba y lejos del cuerpo, cuidadosamente cortar el tejido conectivo y muscular que conecta la pierna a la piel.
13. Extender demasiado la articulación del tobillo y otra vez utilizar las tijeras en un movimiento giratorio para dislocar la tibia.
14. Agarrando el extremo distal de la tibia, teniendo cuidado de no cortar los tendones, tire de la tibia hacia arriba y lejos del cuerpo y el tablón de anuncios.
15. Cortar cualquier tejido conectivo restante fijar el hueso largo para el ratón en la rodilla.
16. Eliminar cualquier músculo adicional o tejido conectivo unido al fémur y la tibia.
17. Para las aplicaciones que requieren que el hueso se mantienen intactos (histología, la histología, las pruebas biomecánicas, etc.), Proceder con protocolos estándar en la casa (como en el ^4-7). Para aislar la médula ósea, pase a la sección 2.

2. Preparación de hueso largo de médula ósea Aislamiento

1. Usando las pinzas, agarre el fémur con la rótula de espaldas a unand el extremo proximal (cabeza femoral) hacia abajo.
2. Extender demasiado la articulación de la rodilla y el uso de las tijeras en un movimiento giratorio para dislocar la tibia y el fémur.
3. Cortar cualquier tejido conectivo que sostiene el fémur y la tibia juntos.
4. El uso de las pinzas, sujete el fémur con el lado anterior de espaldas y el extremo proximal (extremo de la cabeza femoral) hacia abajo.
5. Guiar la tijera hasta la diáfisis femoral a los cóndilos.
6. gire suavemente las tijeras de ida y vuelta para eliminar los cóndilos, la rótula y la epífisis para exponer la metáfisis.
7. Retire cualquier músculo adicional o tejido conectivo unido al fémur usando fórceps, tijeras y Kimwipes.
8. El uso de las pinzas, sujete la tibia con el lado anterior de espaldas y el extremo distal (extremo de tobillo) hacia abajo.
9. Si la epífisis tibial está intacto, guiar a las tijeras de la diáfisis de la tibia de los cóndilos.
10. gire suavemente las tijeras de ida y vuelta para eliminar los cóndilos y la epífisis para exponer el metaphanalysis.
11. Retire cualquier músculo adicional o tejido conectivo unido a la tibia utilizando fórceps, tijeras y Kimwipes.

Aislamiento 3. médula ósea

1. Empuje una aguja de 18 G a través de la parte inferior de un tubo de 0,5 ml de microcentrífuga.
2. Coloque los huesos largos (máximo de 2 fémures y tibias 2) en el tubo, hasta la rodilla extremo hacia abajo termina hacia abajo y cierre la tapa.
3. Nido del tubo de microcentrífuga de 0,5 ml en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
4. Centrifugar los tubos anidados en ≥10,000 xg en una microcentrífuga durante 15 segundos.
5. Compruebe que la médula ósea se ha hecho girar hacia fuera de los huesos mediante inspección visual. Los huesos deben aparecen de color blanco y no debe haber una gran pastilla visual en el tubo más grande.
6. Desechar el tubo de microcentrífuga de 0,5 ml con los huesos.
7. Suspender la médula ósea en solución apropiada (por ejemplo, PBS, medios de cultivo, tampón FACS) y proceder con el protocolo experimental (DNA, RNA, o el aislamiento de proteínas,análisis FACS, o cultivo de células primarias).

Resultados

El protocolo descrito aquí está optimizado para una rápida disección del fémur y la tibia de ratón con un mínimo de daños en el tejido óseo. Esta técnica es adecuado para un número de análisis aguas abajo, incluyendo estudios de biomecánica, histomorfometría (Figura 1A - B), y la histología (Figura 1C) ^{de 4,7.} El representante histomophometric reconstrucción micoCT 3D (Figura 1A - B) demuestra que tanto el hueso esponjoso y cortical shell se mantienen que permite la cuantificación exacta de los parámetros estructurales normalizados para la histomorfometría de hueso, incluyendo el número trabecular, el grosor, y el espaciamiento; volumen de hueso; y el grosor cortical, entre otras medidas ^8. El corte histológico muestra un representante fijado en formalina y descalcificadas tibia H & E manchadas (Figura 1C). La imagen demuestra la integridad tanto de la b calcificadouno y la médula ósea celular para el análisis histológico.

El procedimiento de aislamiento de la médula ósea conserva la esterilidad del espacio de la médula ósea, tiene baja manejo para reducir la contaminación, y no requiere el corte del hueso largo, reduciendo así la pérdida de rendimiento de la médula ósea. Esta médula ósea es conveniente para muchas aplicaciones posteriores, incluyendo citometría de flujo ⁵ y los análisis de PCR. Además, este procedimiento se puede utilizar para aislar de la médula ósea para el cultivo celular primario de células de médula ósea, incluyendo los osteoclastos y los osteoblastos (Figura 2A - B) ^4,6.

Figura 1. histomorfológico y análisis histológicos de ratón hueso largo. MicroCT la reconstrucción tridimensional de una tibia de ratón que muestra (A) la concha cortical externa y (B trong>) hueso trabecular (barra de escala = 0,5 mm). (C) histológico tinción con HE de una tibia descalcificada y seccionada (4x). Imágenes cortesía de Katherine Weilbaecher, Facultad de Medicina, Universidad de Washington, EE.UU.. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Primaria de Médula Ósea cultivo celular para la diferenciación de los osteoclastos y osteoblastos. Tinción (A) para los osteoclastos multinucleadas TRAP después de 7 días en los medios de comunicación osteoclastogénicos (4x). (B) La fosfatasa alcalina (color púrpura) de los osteoblastos y rojo de alizarina (color rojo) para la mineralización de manchas después de 21 días en los medios de comunicación osteogénico. Imágenes cortesía de Katherine Weilbaecher, Facultad de Medicina, Universidad de Washington, EE.UU..iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Presentamos un método simple y eficiente para la eliminación de los huesos largos posteriores del ratón y el posterior aislamiento de la médula ósea. Este método mantiene la alta integridad estructural y celular de los huesos y la médula ósea y tiene un bajo tiempo de manejo, lo que minimiza la probabilidad de fractura inducida por el usuario o puntuación ósea que puede influir en los análisis posteriores. Además, el método de centrifugación para aislar la médula ósea no requiere cortar el hueso para exponer el espacio de la médula ósea o el líquido para enjuagar la médula ósea, lo que reduce los posibles puntos de contaminación. Además, la técnica de centrífuga tiene un rendimiento relativamente alto con un tiempo de manipulación más bajo que otros métodos, lo que reduce el tiempo de procesamiento.

La alta variación es inherente a los estudios in vivo con ratones debido a la alta variación fenotípica de ratón a ratón. Para maximizar el impacto en la investigación de los estudios con ratones, costosos y laboriosos, es fundamental minimizar el error experimental técnico^9,10. El tiempo desde el sacrificio de animales hasta el análisis posterior o la fijación de tejidos introduce variaciones experimentales que pueden superar cambios sutiles y reducir grandes diferencias entre grupos. Por lo tanto, el procesamiento rápido de las muestras es esencial para un análisis preciso de los datos. Las técnicas de disección de huesos largos y aislamiento de médula ósea descritas aquí están optimizadas para el procesamiento rápido de animales y muestras para reducir la variación técnica.

Este protocolo se puede aplicar ampliamente a muchos campos de investigación, incluida la investigación del tejido óseo en sí o el interrogatorio de las células de la médula ósea. Además, este enfoque sencillo de la disección de huesos largos permitirá a los investigadores en campos relacionados interrogar directamente las contribuciones óseas para ampliar nuestro conocimiento de la disfunción de la médula ósea en patologías poco estudiadas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
de tablero
de
70% etanol
Tijeras de disección
pinza
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
			16 G 1,5
ml Tubo
0,5 ml Tubo
Microcentrífuga