El análisis de glicanos Nodo: un enfoque de abajo hacia arriba para Glicómica

Sahba Zaare; Jesús S. Aguilar; Yueming Hu; Shadi Ferdosi; Chad R. Borges

doi:10.3791/53961

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Artículo de método

El análisis de glicanos Nodo: un enfoque de abajo hacia arriba para Glicómica

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DOI:

10.3791/53961

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22 de mayo de 2016

Sahba Zaare¹ , Jesús S. Aguilar¹ , Yueming Hu¹ , Shadi Ferdosi¹ , Chad R. Borges¹

¹Department of Chemistry & Biochemistry, The Biodesign Institute – Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

En este artículo

Resumen

Este artículo presenta una forma mejorada de una novedosa técnica glicómica de abajo hacia arriba diseñada para analizar el perfil composicional agrupado de glicanos en biofluidos no fraccionados a través de la descomposición química de los glicanos en sus monosacáridos específicos de enlace constituyente para su detección por GC-MS. Las aplicaciones potenciales incluyen la detección temprana del cáncer y otros trastornos afectivos de los glicanos.

Resumen

Sintetizados en un proceso no impulsado por plantillas por enzimas llamadas glicosiltransferasas, los glicanos son actores clave en varios eventos intra y extracelulares significativos. Muchas condiciones patológicas, en particular el cáncer, afectan la expresión génica, que a su vez puede desregular la abundancia relativa y los niveles de actividad de las enzimas glucósido hidrolasa y glicosiltransferasa. Los glicanos enteros aberrantes únicos que resultan de glicosiltransferasas desreguladas a menudo están presentes en cantidades mínimas dentro de biofluidos complejos, lo que dificulta su detección y, a veces, estocástica. Sin embargo, con una preparación adecuada de la muestra, una de las formas más antiguas de espectrometría de masas (cromatografía de gases-espectrometría de masas, GC-MS) puede detectar de forma rutinaria la colección de monosacáridos específicos de punto de ramificación y enlace ("nodos de glicanos") presentes en biofluidos complejos. Complementario a las técnicas tradicionales de glicoma de arriba hacia abajo, el enfoque discutido en este documento implica la recolección y condensación de cada nodo de glicano constituyente en una muestra en una sola señal analítica independiente, que proporciona información estructural y cuantitativa detallada sobre los cambios en el glicoma en su conjunto y revela glicosiltransferasas potencialmente desreguladas. Las mejoras en la permetilación y las posteriores etapas de extracción líquido/líquido proporcionadas en este documento mejoran la reproducibilidad y el rendimiento general al facilitar la exposición mínima de los glicanos permetilados a condiciones acuosas alcalinas. Las modificaciones en la etapa de acetilación aumentan aún más el grado de reacción y el rendimiento general. A pesar de su reproducibilidad, se ha demostrado que los rendimientos generales de acetatos de alditol parcialmente permetilados (PMAA) de N-acetilhexosamina (HexNAc) son inherentemente más bajos que su valor teórico esperado en relación con los PMAA de hexosa. El cálculo de la relación entre el área bajo el cromatograma iónico extraído (XIC) para cada PMAA de hexosa individual (o PMAA HexNAc) y la suma de dichas áreas XIC para todas las hexosas (o HexNAcs) proporciona un nuevo método de normalización que facilita la cuantificación relativa de los nodos de glicanos individuales en una muestra. Aunque actualmente está limitado en términos de sus límites absolutos de detección, este método acelera el análisis de biofluidos clínicos y se muestra considerablemente prometedor como un enfoque complementario a la glucómica tradicional de arriba hacia abajo.

Introducción

Los glicolípidos, glicoproteínas, proteoglicanos, y glicosaminoglicanos constituyen las cuatro clases principales de carbohidratos complejos y heterogéneos conocidos colectivamente como glicanos. Como componentes ubicuas e integrales de la membrana plasmática, glycocalyx, y la matriz extracelular y los líquidos, los glicanos participan en diversos procesos tales bioquímicos como la endocitosis, el tráfico intracelular, la motilidad celular, la transducción de señales, reconocimiento molecular, la activación del receptor, la adhesión celular, la interacción huésped-patógeno , comunicación, inmunovigilancia, y la iniciación respuesta inmune intercelular. ¹ p....