El análisis de glicanos Nodo: un enfoque de abajo hacia arriba para Glicómica

Resumen

Este artículo presenta una forma mejorada de una novedosa técnica glicómica de abajo hacia arriba diseñada para analizar el perfil composicional agrupado de glicanos en biofluidos no fraccionados a través de la descomposición química de los glicanos en sus monosacáridos específicos de enlace constituyente para su detección por GC-MS. Las aplicaciones potenciales incluyen la detección temprana del cáncer y otros trastornos afectivos de los glicanos.

Resumen

Sintetizados en un proceso no impulsado por plantillas por enzimas llamadas glicosiltransferasas, los glicanos son actores clave en varios eventos intra y extracelulares significativos. Muchas condiciones patológicas, en particular el cáncer, afectan la expresión génica, que a su vez puede desregular la abundancia relativa y los niveles de actividad de las enzimas glucósido hidrolasa y glicosiltransferasa. Los glicanos enteros aberrantes únicos que resultan de glicosiltransferasas desreguladas a menudo están presentes en cantidades mínimas dentro de biofluidos complejos, lo que dificulta su detección y, a veces, estocástica. Sin embargo, con una preparación adecuada de la muestra, una de las formas más antiguas de espectrometría de masas (cromatografía de gases-espectrometría de masas, GC-MS) puede detectar de forma rutinaria la colección de monosacáridos específicos de punto de ramificación y enlace ("nodos de glicanos") presentes en biofluidos complejos. Complementario a las técnicas tradicionales de glicoma de arriba hacia abajo, el enfoque discutido en este documento implica la recolección y condensación de cada nodo de glicano constituyente en una muestra en una sola señal analítica independiente, que proporciona información estructural y cuantitativa detallada sobre los cambios en el glicoma en su conjunto y revela glicosiltransferasas potencialmente desreguladas. Las mejoras en la permetilación y las posteriores etapas de extracción líquido/líquido proporcionadas en este documento mejoran la reproducibilidad y el rendimiento general al facilitar la exposición mínima de los glicanos permetilados a condiciones acuosas alcalinas. Las modificaciones en la etapa de acetilación aumentan aún más el grado de reacción y el rendimiento general. A pesar de su reproducibilidad, se ha demostrado que los rendimientos generales de acetatos de alditol parcialmente permetilados (PMAA) de N-acetilhexosamina (HexNAc) son inherentemente más bajos que su valor teórico esperado en relación con los PMAA de hexosa. El cálculo de la relación entre el área bajo el cromatograma iónico extraído (XIC) para cada PMAA de hexosa individual (o PMAA HexNAc) y la suma de dichas áreas XIC para todas las hexosas (o HexNAcs) proporciona un nuevo método de normalización que facilita la cuantificación relativa de los nodos de glicanos individuales en una muestra. Aunque actualmente está limitado en términos de sus límites absolutos de detección, este método acelera el análisis de biofluidos clínicos y se muestra considerablemente prometedor como un enfoque complementario a la glucómica tradicional de arriba hacia abajo.

Introducción

Los glicolípidos, glicoproteínas, proteoglicanos, y glicosaminoglicanos constituyen las cuatro clases principales de carbohidratos complejos y heterogéneos conocidos colectivamente como glicanos. Como componentes ubicuas e integrales de la membrana plasmática, glycocalyx, y la matriz extracelular y los líquidos, los glicanos participan en diversos procesos tales bioquímicos como la endocitosis, el tráfico intracelular, la motilidad celular, la transducción de señales, reconocimiento molecular, la activación del receptor, la adhesión celular, la interacción huésped-patógeno , comunicación, inmunovigilancia, y la iniciación respuesta inmune intercelular. ¹ presente en casi todos los ámbitos de la vida, las enzimas conocidas como glicosiltransferasas que se acumulan polímeros de glicano actuar en conjunto con glucósido hidrolasas (también conocidos como glicosidasas, que se descomponen glicanos) para construir, remodelar, y finalmente producir polímeros finalizado glicanos ^2. Aunque cada glicosiltransferasa puede operar en diferentes glicoconjugados, una glicosiltransferasageneralmente forja una de ligamiento y de anómero específico de enlace glicosídico mediante la transferencia de la fracción de monosacáridos de un determinado nucleótido activado azúcar donante (por ejemplo, GDP-fucosa) a una determinada categoría de aceptores nucleófilos (por ejemplo, un lípido, polipéptido, ácido nucleico, o en crecimiento oligosacárido). Se ha estimado que más del 50% de proteínas (especialmente proteínas de membrana y de secreción) son después de la traducción modificado por glicosilación ³ cálculos combinatorios rudimentarios proporcionar una apreciación de la variabilidad considerable, versatilidad y especificidad concedido a glicoproteínas de glicosilación.; por ejemplo, si un sustrato polipéptido tiene sólo 10 sitios de glicosilación y cada sitio se puede formar un enlace glicosídico con 1 de extremos reductores solamente 3 de monosacáridos diferentes, entonces, teóricamente, la glicoproteína final puede asumir 3 ¹⁰ = 59.049 identidades distintas. En glicoproteínas, enlaces glicosídicos forman comúnmente con la cadena lateral de nitrógeno oresiduos f asparagina en la secuencia Asn-X-Ser / Thr (X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina) para producir N -glycans ² y de la cadena lateral hidroxilos de residuos de serina y treonina para dar O -glycans ^4. La composición de glicoma de una célula (es decir, su complemento de los productos de glicosilación) es único y limitado, ya que, con pocas excepciones, las glicosiltransferasas exhiben estricta donante, aceptor, y la especificidad de ligamiento. ⁵ glicoproteínas plasma sanguíneo importantes y abundantes sufren glicosilación aberrante como consecuencia de aguas abajo de expresión de glicosiltransferasa anormal y la actividad debido a muchas condiciones patológicas, especialmente cáncer y enfermedades inflamatorias. ^6-24

Principalmente debido a factores epigenéticos, la glicoma es significativamente más diverso, dinámico y complejo que el proteoma y transcriptome ^25,26. Mientras que aproximadamente 1% del genoma de mamíferos codifica la formación, modificación, ymontaje de glicanos, ²⁷ procede de glicosilación de una manera-un marcado contraste impulsado la no-plantilla para la biosíntesis del polipéptido y ácido nucleico. La interacción entre la cantidad relativa y la actividad de las enzimas de glicosilación y los factores ambientales tales como la disponibilidad de nutrientes y precursor en última instancia, determina la naturaleza, la velocidad y grado de glicosilación. ^5,28 embriogénesis (por ejemplo, la determinación y diferenciación), la activación celular y la progresión a través la expresión del gen influencia del ciclo celular (es decir, transcripción y traducción) y alterar la identidad y cantidad de glicosiltransferasas disponibles, cuya actividad es el determinante aguas arriba inmediata de perfil de glicano de la célula. Debido a que (algunos de) la proliferativa, adhesivo, y las propiedades invasivas de las células cancerosas se parecen a los de las células embriogénicas ordinarias, cambios específicos en las rutas biosintéticas de glicano (por ejemplo, la acumulación de precursor, la expresión desregulada, aberranmodificación t, truncamiento estructural, o una novela formación) sirven biomarcadores de cáncer como universales que indican diversas etapas de la formación del tumor, progresión, migración y la invasión ²⁹ Aunque la glicosilación es muy compleja, evidentemente, sólo unas pocas alteraciones en la glicosilación pueden permitir la carcinogénesis y la metástasis.; Al parecer, algunos productos de glicosilación "aberrantes" de hecho se benefician células cancerosas por lo que les permite evitar el reconocimiento inmune y sobrevivir a las exigencias de la migración en ambientes inhóspitos intravasculares y metastásicos. ^28,30,31 Como era de esperar, los experimentos han revelado que la interrupción o la prevención de los patrones de alteración la expresión del gen y la formación de glicano aberrante puede detener la tumorigénesis. ²⁹ no obstante, los glicanos aberrantes detectados en una muestra de biofluido (por ejemplo, orina, saliva, y el plasma sanguíneo o suero) pueden no ser indicadores directos de cáncer (u otra enfermedad), pero en lugar de aguas abajo resultados de sutil pero significativacambios en el sistema inmune o ramificaciones cuantificables de una condición perniciosa en un órgano impredecible. ³²

A pesar de que proporcionan información acerca de la glicoma universales, muchas técnicas basadas en glicómica de interacción molecular (por ejemplo, lectina arrays de anticuerpos y / metabólica / marcaje covalente) dependerá de la detección de estructuras de glicano enteros y no proporcionan información estructural detallada sobre glicanos individuales. En marcado contraste, la espectrometría de masas (MS) puede ayudar a identificar y cuantificar las estructuras de glicano individuales y revelar información estructural como los sitios de unión a núcleos de polipéptidos. expresión o actividad de sólo una glicosiltransferasa Desregulado pueden iniciar una cascada de eventos moleculares perjudiciales en múltiples vías de glicosilación. Debido a que cada glicosiltransferasa puede operar en más de un sustrato glicoconjugado ya través de diferentes polímeros de glicanos en crecimiento, cascadas biosintéticas desreguladas dió desproporcionalmente mayores cantidades de un solo producto de glicano, sino varias clases heterogéneas de glicanos aberrantes en los fluidos intra o extracelulares. ³³ Sin embargo, tales glicanos aberrantes únicos a veces se consideran poco práctico como biomarcadores para el cáncer u otras patologías de glicano-afectivo, ya que, en comparación con la gran piscina de glicanos bien regulada, estos glicanos aberrantes representan una fracción muy pequeña que a menudo pueden permanecer indetectable incluso por tales técnicas altamente sensibles como la espectrometría de masas. Por ejemplo, en los fluidos corporales intra y extracelulares, el amplio espectro de proteínas de concentración (que abarca ocho órdenes de magnitud) puede impedir la detección de glicoproteínas escasos que están enmascarados por las especies más abundantes. ³² Por otra parte, determinar la actividad de glicosiltransferasa sigue habiendo una considerable práctica y el desafío teórico porque muchas glicosiltransferasas están ausentes en fluidos biológicos o clínicos vuelven inactivas ex vivo. A pesar de la dificultad del consistently detección y cuantificación de cantidades diminutas de ultra-glicanos enteros únicos, los profesionales de la espectrometría de masas han dado grandes pasos hacia el empleo de glucanos intactos como marcadores clínicos. Hemos desarrollado recientemente un enfoque complementario para el análisis de glucanos intactos que, empleando GC-MS, facilita la detección de todos los constituyente punto de ramificación y monosacáridos-vinculación específica ( "nodos de glicano") que juntos confieren singularidad a cada glicano y en muchos casos sirven directamente como sustitutos moleculares que cuantifican la actividad relativa de la glicosiltransferasa (s) culpable.

Desde su primera informó de aplicación directa en el análisis de glicanos en 1958, cromatografía de gases (GC) ha demostrado ser una técnica poderosa para analizar mono- y disacáridos per-metilado, ³⁴ determinar su anomericity y configuración absoluta, y separarlos para el análisis de espectrometría de masas posterior. ³⁵ entre 1984 y 2007, y sus colegas Ciucanuintrodujo y refinó una técnica permetilación glicanos en fase sólida que emplea hidróxido de sodio y yodometano, seguido de extracción líquido / líquido de glicanos permetilados con agua y. cloroformo ^35,36 Entre 2005 y 2008, Kang y compañeros de trabajo integrados un giro de ahorro de tiempo -column enfoque en el paso permetilación ^37,38. En 2008, el grupo de investigación Goetz ideó una fase sólida cuantitativa permetilación método de glicano de perfiles utilizando láser de desorción-ionización asistida por matriz (MALDI) espectrometría de masas para comparar y diferenciar potencialmente invasivas y no las células de cáncer de mama no invasiva; ³⁹ entonces, en 2009, el equipo de técnicas de liberación químicos Goetz enzimática y combinado para escindir O -glycans de glicoproteínas intactas en un esquema permetilación en fase sólida altamente alcalina ⁴⁰ Aunque el procedimiento Goetz facilitó permetilación simultánea y las emisiones químicas. de -glycans O, se aplica sólo a pre-aislado glicoproteínas. Hemos modificado esta técnica en 2013 y lo adaptó para fluidos biológicos no fraccionadas enteros y muestras de tejido homogeneizadas mediante la incorporación de ácido trifluoroacético (TFA) hidrólisis, reducción y acetilación pasos. ³³ Estos pasos adicionales también la liberación de los glicanos de glicolípidos y N -vinculada glicanos de glicoproteínas y convertir ellos en acetatos parcialmente metilados de alditol (PMAAs, Figura 1), cuyos patrones de metilación y acetilación distintivo facilitar el análisis por GC-MS y únicamente caracterizar los nodos de glicano constituyentes en el original polímero glicano intactas ⁴¹ (Figura 2). ³³ en última instancia, este procedimiento produce un retrato compuesto de todos los glicanos en un biofluido complejo basado en la cuantificación directa, en relación de características únicas, tales como glicanos "fucosilación núcleo", "6-sialilación", "bisectriz GlcNAc", y "beta 1-6 de ramificación" - cada una derivada de una sola chromatograp GC-MSpico de HIC. Este artículo presenta una mayor optimización de la permetilación, acetilación, el aislamiento, y las etapas de limpieza, junto con mejoras en el modo de cuantificación relativa.

Protocolo

Precaución: Evitar el contacto / ojo piel con cualquiera de los reactivos utilizados en este experimento. Tras la exposición, lave bien el área afectada con agua y acudir al médico inmediatamente.

1. permetilación y glicanos Extracción

1. Preparación de la columna
   1. Obtener el máximo de unidades de columna de microcentrífuga giro como las muestras a analizar. Romper y separar las tapas de los tubos de depósito de plástico. Colocar un filtro de microcentrífuga de mini en cada tubo de depósito. Colocar las columnas de centrifugación de microcentrífuga ensamblados (que contienen los mini filtros) en un bastidor de tubo de microcentrífuga.
   2. Obtener un stock de hidróxido de sodio (NaOH) perlas (malla 20-40). Transferir parte de NaOH a un pequeño recipiente de pesar o, si la humedad está causando aglutinación, un mortero de porcelana caliente como el material de trabajo de NaOH. Evitar el uso de macizos de perlas de NaOH NaOH o triturado / polvo.
      Precaución: NaOH es una potente toxina y la base corrosivo. Enjuagar expuestas de la piel / ojos con agua durante 15 minutos. ThorougHly limpiar la mesa de trabajo después de completar el experimento.
   3. Usando una cuchara pequeña o una espátula, transferir perlas de NaOH de la solución de trabajo para llenar los mini filtros de microcentrífuga con NaOH hasta el primer bisel exterior (~ 5 mm por debajo del borde). Toque en los filtros de microcentrífuga cubrir en el banco de trabajo para empacar / condensar los granos de NaOH.
      Nota: En este experimento, para minimizar la adsorción de agua excesiva por perlas de NaOH higroscópicos, mantener el nivel de cualquier líquido añadido (por ejemplo, acetonitrilo, sulfóxido de dimetilo, la solución de analito) por encima de la superficie del relleno de la columna de NaOH y limitar el contacto directo con el aire.
   4. Obtener un stock de acetonitrilo (ACN). Transferencia ~ 350 l de ACN para cada mini filtro de microcentrífuga repleto de NaOH. Mantenga el NaOH sumergido bajo ACN y eliminar grandes burbujas de aire mediante agitación con una punta de pipeta de punta de carga de gel rizadas.
      Precaución: El acetonitrilo es un irritante inflamable.
   5. La centrifugación en columna
      1. Organizar las columnas de microcentrífuga simétricamente dentro de una centrífuga; utilizar un tubo de equilibrio si es necesario. No permita que caiga gránulos de NaOH dentro de la centrifugadora. Cierre la tapa de la centrífuga.
      2. Centrifugar las columnas (que contiene NaOH y ACN) durante ~ 15 segundos a 2.400 x g.
      3. Al término de la centrifugación, eliminar columnas de microcentrífuga de la centrífuga, y desechar la ACN en un contenedor de desechos peligrosos. Mantener la columna de NaOH embalaje intacto.
   6. Añadir ~ 350 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a cada mini filtro de microcentrífuga repleto de NaOH. Mantenga el NaOH sumergido bajo DMSO y eliminar las burbujas de aire de gran tamaño con una punta de pipeta. Como se ha descrito anteriormente, las columnas de centrifugación durante ~ 15 segundos a 2400 × g, y desechar el DMSO mientras se mantiene el NaOH embalaje intacto.
      Precaución: El DMSO es un mutágeno e irritante y es fácilmente absorbido por la piel.
   7. Enchufe todos los mini filtros de microcentrífuga con los tapones incluidos en el filtro giratorioequipo. Transferir ~ 350 l de DMSO a cada mini filtro de microcentrífuga repleto de NaOH y el uso de una punta de pipeta de 200 l para eliminar las burbujas de aire en el embalaje de NaOH por lo que el DMSO llega a todas las regiones dentro de embalaje a continuación NaOH. Evitar el aplastamiento o excesivamente raspado de las perlas de NaOH; NaOH en polvo no es deseable. Finalizar este paso lo más rápidamente posible.
2. Preparación de Control de Calidad de plasma (QC) muestra (s)
   Nota: Para asegurar resultados consistentes a través de los lotes experimentales, considerar el uso de al menos una alícuota de una muestra tomada de una colección mayor grande, homogénea del material biológico de interés para ser analizadas en cada lote. Por ejemplo, si el análisis de plasma de la sangre, utilice alícuota (s) de una colección mayor de plasma sanguíneo como la muestra de control de calidad (s) en cada lote. muestras de procesos de control de calidad en la misma manera que las muestras desconocidas.
   1. Centrífuga una muestra social de plasma de control de calidad durante 4 minutos a ~ 10.000 x g. Durante la centrifugación, algo de precipitado de alta densidad puede conformarse a the inferior y algo de precipitado de baja densidad pueden flotar a la parte superior del plasma. Evitar tanto cuando la eliminación de alícuota (s) de plasma.
   2. Vaya a "1.3) Preparación de la muestra" más adelante. A continuación, vuelva a este paso después de la centrifugación de plasma se ha completado.
   3. Retirar 9 l de plasma de control de calidad se centrifugó y la transfiere a un tubo de ensayo 1,5 ml de polipropileno marcada apropiadamente equipado con una tapa a presión de cierre (de aquí en adelante como "tubo de ensayo de plástico de 1,5 ml"). Añadir 1 l de agua desionizada a cada alícuota; si se desea, utilizar esto como un soporte para el estándar (s) interna.
   4. Añadir DMSO 270 l a este control de plasma. Vortex para asegurar la disolución completa.
3. Preparación de la muestra
   1. Obtener el máximo de tubos de ensayo de plástico de 1,5 ml como el número de muestras biológicas (analito).
   2. Transferencia de 9 l de cada muestra biológica (analito) a su correspondiente tubo de ensayo de plástico de 1,5 ml. Transferir 1 l de agua desionizada y 270 l DMSO a cada tubo de muestra.
   3. Mezclar vigorosamente (por ejemplo, mezclar y / o repetidamente la pipeta hacia arriba y abajo) las muestras para asegurar la completa disolución en DMSO.
      Precaución: Realice los siguientes pasos dentro de una campana de humos. Utilizan en los pasos siguientes, yodometano _(CH3 I), diclorometano (CH ₂ Cl _2, también conocido como cloruro de metileno) y cloroformo (CHCl _3, triclorometano), son líquidos volátiles capaces de disolver ciertos tipos de plástico (por ejemplo, guantes de nitrilo) . Asegúrese de utilizar guantes resistentes a los disolventes. Debido a su baja viscosidad y alta presión de vapor, estos reactivos pueden gotear desde una punta de pipeta durante la transferencia. Minimizar la pérdida de reactivos y la exposición potencial a través de la celebración de la solución de reserva adyacente al recipiente de recepción.
   4. Añadir un volumen total suficiente de yodometano a un tubo pequeño y limpio. Cada muestra de analito requerirá 105 yodometano l. Transferencia ~ 500 l diclorometano en another tubo limpio. Para evitar la obstrucción de la jeringa, enjuagar la jeringa con diclorometano inmediatamente después de la transferencia de yodometano.
      Precaución: yodometano es fotosensible, volátil, y potente toxina capaz de dañar el sistema nervioso central o causar la muerte si se inhala o se ingiere. El diclorometano es un carcinógeno potencial, mutágeno reproductiva y potente irritante capaz de dañar varios órganos o causar la muerte.
   5. Utilice una jeringa analítica para añadir yodometano 105 l de cada muestra de analito. tubos de analitos tapa inmediatamente para minimizar la evaporación yodometano. A fondo vórtice y, si es necesario, centrifugar brevemente todas las muestras para asegurar que el líquido no permanece en la tapa. Cualquier cambio de color (por ejemplo, de color marrón, morado o amarillo) indica la degradación yodometano, lo que puede poner en peligro la siguiente reacción permetilación.
   6. Enjuague la jeringa analítico utilizado para transferir yodometano con diclorometano al menos 3 veces. Esto evitará que from obstrucción. Desechar este enjuague, junto con yodometano extra y diclorometano en un recipiente de residuos orgánicos peligrosos. Coloque los tubos de ensayo utilizados en un contenedor de desechos peligrosos.
   7. Obtener un nuevo conjunto de tubos de depósito de plástico de 2 ml. Quitar complemento tapas si se desea.
   8. Desenchufe los filtros de microcentrífuga de mini. Centrifugar las columnas desenchufado de 15 segundos a 2400 × g, y luego desechar los tubos de depósito junto con el efluente de DMSO.
   9. Vuelva a conectar las columnas de centrifugación se centrifuga, y colocarlos dentro de los nuevos tubos de depósito. Número cada columna de centrifugación y de su tubo de depósito correspondiente con el mismo número de la muestra. Asegúrese de que los mini tacos de filtro están apretados; la posibilidad de fugas puede afectar el siguiente paso. Reducir al mínimo el tiempo entre la eliminación de DMSO de las columnas de centrifugación y la transferencia de las muestras de analito en las columnas de centrifugación.
   10. permetilación
       1. Transferir cuantitativamente cada solución de muestra a su correspondiente co microfuga giro lleno de NaOH-granolumna. Utilice una punta de pipeta de 1.000 l para este paso. Después de la transferencia, engarce ~ 2 mm del extremo de una punta de 200 l y dejarlo en el contenido de las columnas para utilizar como un agitador. Repita este procedimiento para todas las muestras.
          Nota: La baja viscosidad de yodometano puede causar la pérdida de muestra porque la solución analito puede gotear de la punta de la pipeta durante la transferencia. Mantenga el tubo de muestra y la columna de centrifugación adyacentes entre sí con una mano, y transferir rápidamente la solución de muestra con la otra mano.
       2. Permitir que la reacción permetilación proceder durante 11 minutos. Agitar cada muestra por lo menos 4-5 veces durante este período. Para facilitar permetilación eficiente, que se produce en la superficie de perlas de NaOH, utilizar puntas de carga de gel con punta de pipeta rizadas como agitadores para mezclar suavemente el contenido de las columnas. mezclado agresivo puede perforar el filtro giratorio, pulverizar y suspender granos de NaOH (que puede reducir la eficacia de la posterior extracción líquido / líquido), y / o causar la pérdida de la muestra (como la sample empapada de gránulos de NaOH pueden desbordarse de la columna).
       3. En la preparación para la etapa de extracción líquido / líquido posterior, preparar una cantidad suficiente de solución 0,5 M de cloruro de sodio (NaCl) en un tampón fosfato de sodio 0,2 M (pH 7,0), que se almacena a temperatura ambiente. Cada muestra requerirá un total de ~ 12 ml de solución de NaCl para los tres ciclos de extracción líquido / líquido.
       4. Al finalizar el período de permetilación 11-min, inmediatamente aún desenchufe cuidadosamente las columnas y centrifugar durante 15 segundos a 2.400 x g. Desechar los tapones.
   11. Retire inmediatamente columnas de giro de la centrífuga y colocarlos en un nuevo conjunto de tubos de depósito giro vacías, dejando la solución de flujo continuo que contiene glicanos recién permetilados atrás. No deseche nada.
   12. Tan pronto como sea posible, añadir 300 l de acetonitrilo (ACN) para los filtros de espín, llenas de NaOH seco. Centrifugar los filtros de giro durante 30 segundos a 9.600 x g.
   13. immediately a partir de entonces, transferir la solución principal permetilación (es decir, la solución que se incubó con las perlas de NaOH durante 11 min y después se hizo girar a través del filtro de centrifugado en un tubo de centrífuga antes de la adición de 300 l de ACN en el paso anterior) para silanizada 13 x tubos de ensayo de vidrio de 100 mm que contiene ⁴² 3,5 ml de tampón 0,2 M de fosfato de sodio que contiene 0,5 M NaCl, pH 7,0 y mezclar (vórtice) inmediatamente. Evitar la transferencia de cualquier residuo blanco sólido durante este paso. Hacer esto para cada muestra antes de proceder al siguiente paso.
   14. Sin demora, la transferencia (combinar) la escisión a través de ACN en cada tubo de depósito a (con) el resto de la muestra de líquido en su respectivo tubo de vidrio silanizado y mezclar (vórtice) inmediatamente. Una vez más, evitar la transferencia de cualquier residuo sólido de color blanco durante este paso. Gorra, batido, y agitar el tubo de vidrio. Repita este procedimiento para cada muestra. Desechar las columnas de NaOH y pipetas Pasteur de contenedores de residuos adecuados.
4. Líquido / líquido extracción y glicanos Purificación
   1. Dentro de la campana de extracción, añadir 1,2 ml de cloroformo a cada muestra. Inmediatamente después, la tapa los tubos de vidrio silanizados y mezclar vigorosamente el contenido.
   2. De precalentamiento bloques de metal a aproximadamente 75 ° C en un colector de evaporación. Utilice bloques de calentamiento con pozos que pueden acomodar los tubos de 13 mm × 100 mm de vidrio.
   3. Obtener un nuevo conjunto de pipetas Pasteur silanized, pipetas Pasteur no silanized, y tubos de ensayo de vidrio con tapas silanized.
      Precaución: cloroformo _(CHCl3) es un irritante, mutágeno y carcinógeno potencial capaz de permear a través de algunos tipos de guantes.
   4. centrifugar brevemente (~ 3.000 × g) tubos de vidrio que contiene la muestra para separar las capas acuosa y orgánica.
   5. Utilizar una pipeta Pasteur no silanizada para extraer suficiente de la capa acuosa superior de tal manera que ~ 3 mm de la capa acuosa se mantiene por encima de la capa orgánica inferior.
   6. Añadir 3,5 ml de la M Na 0,5solución de Cl en un tampón fosfato de sodio 0,2 M (pH 7) a cada tubo de vidrio, mezclar vigorosamente, y se centrifuga brevemente (~ 3.000 × g). Como en el paso anterior (1.4.3), utilizar una pipeta Pasteur no silanizada para extraer la capa acuosa.
   7. Repetir la etapa anterior (1.4.4), pero deje ~ 1 ml de la capa acuosa.
   8. Utilizar una pipeta Pasteur silanizada limpia para transferir la capa orgánica a un tubo de ensayo de vidrio silanizada mm limpio y debidamente etiquetados 13 × 100. Evitar la contaminación acuosa mediante la extracción de la siguiente forma:
      1. Mantenga ambos los tubos de ensayo de vidrio silanizado actuales y nuevos adyacentes entre sí en una mano. Con la otra mano, oprima el bulbo de pipeta para crear burbujas mientras que la inserción de la pipeta a través de la capa acuosa.
      2. Una vez dentro de la capa orgánica, dejar de crear burbujas, y mantenga el bulbo de la pipeta constante para permitir que las capas orgánica y acuosa para estabilizar y se vuelven a separar. A continuación, suelte lentamente el bulbo de retirar la mayor cantidad de organicapa c como sea posible sin ninguna contaminación acuosa.
      3. elevar rápidamente la punta de la pipeta a través de la capa acuosa, y resistir el reflejo natural de liberar ligeramente la bombilla (que resulta en la retirada de algo de contaminación acuoso) mientras que aumenta la pipeta fuera del tubo.
      4. Rápida transferencia de la capa orgánica de baja viscosidad al nuevo tubo adyacente. Cualquier contaminación acuosa será visible como pequeñas gotas de líquido en la parte superior de la capa orgánica extraída de los nuevos tubos de vidrio. Si la contaminación acuosa / NaCl es visible, eliminarlo con una pipeta; centrifugar si es necesario para poner en común las gotitas acuosas en una sola gota.
   9. Deseche adecuadamente los tubos viejos de vidrio, pipetas y acuosa y soluciones de residuos orgánicos. Lavar y reciclar los tapones de los tubos de vidrio.
   10. Seque todas las muestras bajo una corriente suave y constante de nitrógeno en un colector de evaporación precalentado a 75 ° C durante ~ 5 minutos dentro de una campana de humos. Para garantizar la refrigeración por evaporación durante todo ste secamientops, un flujo suave y constante de nitrógeno debe perturbar la superficie del líquido sin salpicaduras o salpicaduras del líquido. Extraer muestras del colector de evaporación tras el secado completo de la muestra final. motas blancas en la parte inferior de los tubos de vidrio secos indican contaminación de tampón / NaCl.
   11. Pausa el procedimiento aquí si no hay suficiente tiempo restante en el día para completar la etapa de hidrólisis TFA. Temporalmente (es decir, durante la noche) almacenar muestras secas a -20 ° C. Para continuar con el procedimiento de después del almacenamiento, retire las muestras del congelador a -20ºC y permitir que se calienten por completo antes de destapar.
   12. Mientras que las muestras cálido, en preparación para la hidrólisis de ácido trifluoroacético (TFA) (próxima etapa), establecen el manto de calentamiento de tal manera que la temperatura del contenido del tubo de ensayo de líquido llegará a 121 ° C. Preparar la solución de TFA TFA de acciones (véase el paso 2.1 más adelante).

2. Ácido trifluoroacético (TFA) Hidrólisis

Precaución: ácido trifluoroacético (TFA) es un ácido orgánico corrosivo e irritante tóxico.

1. Preparar una cantidad suficiente de una solución 2,0 M de TFA en agua desionizada. Cada muestra de analito requerirá 325 l de solución 2,0 M TFA. TFA concentrado es 13.0 M.
2. Añadir 325 l de 2,0 M a cada muestra de TFA analito. Para evitar la evaporación de TFA y la pérdida de la muestra durante la etapa de secado posterior (2.3), tapar herméticamente cada tubo de muestra inmediatamente después de la adición de TFA. Marque el nivel de la solución en todos los tubos de vidrio. Vortex cada muestra a fondo antes de la siguiente etapa.
3. Incubar los tubos de muestras herméticamente cerrados durante 2 horas en un calentador precalentado adecuada o el horno de tal manera que los contenidos lleguen a una temperatura de 121 ° C. Si se usa un bloque de calentamiento en lugar de un horno, tubos de muestra cubierta con papel de aluminio para evitar la condensación de TFA en la parte superior del tubo y el secado parcial del residuo de muestra en la parte inferior del tubo. Compruebe los niveles de solución de la muestra después de 20-30 min.para garantizar un mínimo de evaporación TFA. Si es necesario, apriete las tapas más o reemplazar las tapas para un ajuste más apretado.
4. Durante la espera de 2 horas, ajustar otro colector de evaporación a 75 ° C para el siguiente paso (véase 2.4 más adelante).
5. Cuando el período de calentamiento de 2 horas es muestras completas y seco a 75 ° C bajo una ligera corriente de nitrógeno gaseoso durante ~ 15 min. No deje muestras sin vigilancia durante más de 15 minutos. comprobar con frecuencia las muestras, y deje de calentamiento y secado una vez que todas las muestras están secas.
6. Pausa el procedimiento aquí si no hay suficiente tiempo restante en el día para completar la etapa de reducción. Temporalmente almacenar las muestras (es decir, durante la noche) a -80 ° C. Para continuar con el procedimiento de después del almacenamiento, retire las muestras del congelador a -80ºC, y permita que se calienten por completo antes de destapar.

3. Reducción

1. Dentro de una campana de extracción, preparar una cantidad suficiente de un borohidruro / L de sodio 10 g (NaBH ₄₎ solución de 1 M Ammonihidróxido de um _(NH4OH). Cada muestra requerirá 475 l de esta solución. Prepare una solución fresca para cada lote de muestras. Hidróxido de amonio concentrado (27-30% w / w NH ₃₎ es de aproximadamente 14,5 M.
   Precaución: borohidruro de sodio _(NaBH4) es una toxina higroscópico reacciona con el agua y potente irritante que libera-upon contacto con vapores inflamables altamente con el agua que causan graves quemaduras al entrar en contacto por inhalación, ingestión o en ojos / piel.
   Precaución: hidróxido de amonio _(NH4OH) es un irritante corrosivo y la toxina capaz de causar quemaduras severas y daño orgánico irreversible al entrar en contacto por inhalación, ingestión o en ojos / piel. Lavar las partes afectadas con agua durante 30 minutos, y que la víctima no frotarse o rascarse las zonas afectadas.
2. Para cada muestra, añadir 475 l de la 10 g / L NaBH ₄ en 1 M NH ₄ OH. Agitar las muestras a fondo para disolver cualquier residuo. tubos de ensayo y el casquillopermitir que la reacción de reducción continúe durante 1 hr.
3. Durante la espera de 1 hora, ajustar el colector de evaporación se calienta a 75 ° C. Use un bloque de calentamiento con pocillos adecuados para los tubos de vidrio (véase el punto 3.4 más adelante).
4. Cuando el período de reacción de 1 hr es completa, añadir 63 l de metanol (MeOH) a cada muestra. Este paso y el siguiente paso eliminar el boro residual como borato de trimetil - un líquido relativamente volátil que hierve a 68 ° C.
5. Las muestras secas (en el colector precalentado) a 75 ° C bajo una ligera corriente de nitrógeno gaseoso durante ~ 15 min. comprobar con frecuencia muestras y no los deje solos. Las pequeñas gotas de líquido en la parte inferior de los tubos de vidrio indican que la muestra no es todavía seco.
   Nota: Para distinguir burbujas de aire de gotas de líquido, incline el tubo de ensayo. Sólo las gotas de líquido se mueven después de inclinar, pero lo contrario no siempre es cierto: si una burbuja no se mueve, todavía puede ser una (muy pequeña) de gotitas de líquido.
6. Una vez samplES son completamente seco, preparar un 9: solución (v / v) 1 de metanol (MeOH) y ácido acético (AcOH). Añadir 125 l de esta solución de MeOH: AcOH a cada muestra.
7. Las muestras secas (en un colector precalentado) a 75 ° C, bajo una suave corriente de gas nitrógeno.
8. Cuando las muestras son completamente seco, vacío secar las muestras durante 20 minutos a temperatura ambiente: Colocar las muestras en un recipiente de plástico vacío (tales como los vendidos por FoodSaver), cierre la tapa de vacío, ajuste el dial de vacío a "vacío", conecte el manguera de vacío, y a su vez en el vacío. Para desmontar el vacío, invierta estos pasos. Espere a que el sistema para descomprimir por completo antes de intentar abrir la tapa de vacío.
9. Pausa el procedimiento aquí si no hay suficiente tiempo restante en el día para completar la etapa de reducción. Temporalmente almacenar las muestras (es decir, durante la noche) a -80 ° C. Para continuar con el procedimiento de después del almacenamiento, retire las muestras del congelador a -80ºC, y permita que se calienten por completo antes de uncappingramo.
10. A la espera de muestras de vacío seco (o caliente, después del almacenamiento), preparar los reactivos para el siguiente paso. Obtener y un número silanizada inyector automático cónica inferior (AS) frasco (con gorra) para cada muestra. Por otra parte, de precalentamiento tanto un bloque de calentamiento de poca profundidad así como viales y un bloque de vidrio de tubos de pozo profundo de tal manera que el contenido del tubo de vidrio alcanzarán una temperatura de 50 ° C.

4. La acetilación (Realizado en una campana extractora)

1. Añadir 18 l de agua desionizada a cada muestra. Tapa y fondo Vortex todos los tubos para disolver completamente cualquier precipitado.
2. Añadir anhídrido acético 250 l a cada tubo de vidrio. Gorra, fondo de vórtice, y someter a ultrasonidos en un baño de agua durante 2 minutos para asegurar la completa disolución de los residuos y precipitados.
3. Cubra tubos de vidrio con papel de aluminio, y se incuba a una temperatura interna de 50 ° C durante 10 min.
4. Añadir 230 l de ácido trifluoroacético concentrado (TFA) a cada muestra. Inmediatamente coronar unad mezclar las muestras. A continuación, se incuban las muestras cubiertas con papel de aluminio-durante 10 minutos a una temperatura interna de 50 ° C.
5. Después de la incubación, añadir 1,8 ml de diclorometano (CH ₂ Cl ₂₎ a cada muestra. Tapar y mezclar bien.
6. Añadir 2,0 ml de agua desionizada a cada muestra. Tapa y muestras mezclar bien. Centrífuga de 0 a 3000 × g para separar las capas. Utilizar una pipeta Pasteur no silanizada para llevar a cabo la extracción líquido / líquido como se indica en el paso 1.4.6, evitando la contaminación del agua.
7. Repita la extracción una vez más, para un total de dos extracciones. Utilizar pipetas Pasteur silanized para transferir la capa orgánica en silanizada etiquetada como viales (mantenida de forma segura en un bastidor AS). Llenar los viales, justo por debajo del borde.
8. Use un bloque precalentado superficial pocillos de calentamiento para muestras secas (en viales AS) durante 15 min a 40 ° C bajo gas nitrógeno. No se exceda en seco. Los productos finales son conocidos como acetatos de alditol parcialmente metilados (PMAAs).

5. Cromatografía de Gases - Espectrometría de Masas (GC-MS)

1. Reconstituir cada muestra en 100 l de acetona y mezclar bien. Utilice un inyector automático para inyectar 1 l de cada muestra en el modo de división en el forro en modo dividido GC (mantenido a 280 ° C y que contiene un pequeño tapón de lana de vidrio silanizada). Utilice una relación de división de 40. Uso de helio como gas portador en modo de flujo constante a 0,8 ml / min a través de una columna de GC DB-5ms 30-m con un ID de 0,25 mm y 0,25 micras de espesor de película.
2. Mantenga la temperatura inicial del horno GC a 165 ° C durante 0,5 min. Después del tiempo de retención inicial, programa el horno a la rampa de la temperatura, para cada ejecución, desde 165 ° C a 265 ° C a una velocidad de 10 ° C / min (que tarda 10 min) y luego la rampa inmediatamente la temperatura de 265 ° C a 325 ° C a una velocidad de 30 ° C / min (que tiene 2 min) y mantener la temperatura a 325 ° C durante 3 min. El tiempo de ejecución total por muestra es de 15,5 min.
3. Utilice un profesionalPerly sintonizado y calibrado espectrómetro de masas para someter los componentes de la muestra que eluyen de la columna de GC a electrones de ionización (EI, 70 eV a 250 ° C). Para un analizador de masas TOF, analizar fragmentos de m / z 40 a m ​​/ z 800 con una tasa de pulso suma de 0,1 seg. Establecer un tiempo de espera para el solvente EI-filamento de 2,5 min.

Análisis 6. Datos

1. Si se utiliza un analizador de masas TOF, resumir el más abundante y / o de diagnóstico iones de fragmentos para cada PMAA mediante la aplicación de una ventana de masa de 0,15 Da para obtener un cromatograma de iones extraídos. Iones objetivo para cada PMAA se han publicado en otros lugares, pero ³³ se han realizado las siguientes alteraciones: iones t-Glc son ahora 145,1 + 205,1; 2-Man iones son 161,1 + 189,1; 3-Gal iones son 161.1 + 233.1, 6-Gal iones son 161,1 + 189,1 + 233,1; ion de 2,6-Man es 189,1; Los iones son 3,6-Man 189,1 + 233,1.
2. Utilice QuanLynx u otro software para integrar de forma automática áreas de los picos para cada resumió extraen cromatograma de iones.
3. comprobar manualmente los resultados de integración mediante la visualización de cada cromatograma de iones extraídos integrado. A continuación, exportar los datos de integración de los picos a una hoja de cálculo para su posterior análisis y normalización de datos, que consiste en dividir el área de cada individuo XIC hexosa por la suma de todas las áreas de hexosa XIC; Del mismo modo, el área de cada HexNAc XIC individuo se divide por la suma de todas las áreas HexNAc XIC. Este procedimiento produce abundancias normalizados para cada hexosa individual y HexNAc.

Resultados

Un cromatograma de la corriente de iones total (TIC) que muestra permetilación éxito, hidrólisis, reducción, y la acetilación de las muestras de plasma sanguíneo humano con respecto a los casos en los que se ejecutan incorrectamente dos pasos críticos permetilación se muestra en la Figura 3.

Absoluta Rendimiento de HexNAcs relativa a hexosas:

Discusión

En general, la producción exitosa de acetatos de alditol parcialmente metilados (PMAAs) a partir de hexosas está cargada de menos dificultades y es más robusto que el éxito de la producción de N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. El mecanismo exacto detrás de este fenómeno, ya que desempeña en cada paso de este procedimiento es desconocido, pero debe estar relacionada con la química única del grupo acetil N (en lugar de grupo hidroxilo) que es único para HexNAcs en relación con hexosas. El mecanismo det...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Perlas de hidróxido de sodio	367176	Sigma-Aldrich	Malla 20-40, grado de reactivo 97%
0,9 ml Columna de centrifugado	69705	División Pierce de ThermoFisher Scientific	Incluye  tapones y fritas de polietileno
Vial de muestreador automático GC-MS (silanizado)*	C4000-9	Vial	alta recuperación ThermoFisher Scientific Target DP, 1,5  ml, 12  mm x 32 y nbsp; mm, incluye tapones perforables revestidos de teflón
tubos de ensayo de polipropileno de 1,5 ml	05-402-25	ThermoFisher Scientific	Tapa con tapón a presión
Tubos de ensayo de polipropileno de 2 ml	05-408-138	ThermoFisher Scientific	Tapa con tapón a presión
Dimetilsulfóxido (DMSO)	D8418	Sigma-Aldrich	Biorreactivo para biología molecular, grado de reactivo >99.0%
Yodometano	I8507	Sigma-Aldrich	Contiene cobre como estabilizador, ReagentPlus 99%
Acetonitrilo	A955-4	ThermoFisher Scientific	Optima LC/MS
Microcentrífuga	75002436: Centrífuga Sorvall Legend Micro 17	ThermoFisher Scientific	Rotor de 24 x 1,5/2,0 con tapa de biocontención ClickSeal. Número de catálogo del rotor: 75003424
Tubo de ensayo de vidrio de 13 x 100 (silanizado)*	53283-800 Tubos de	ensayo de vidrio de borosilicato de 13 mm x 100 mm VWR con acabado de tapón de rosca
Tapones para tubos de ensayo de vidrio	14-930-15D	ThermoFisher Scientific	Kimble&comercio; tapones de rosca fenólicos negros; 13  Rosca GPI mm-415; Revestimiento de caucho con revestimiento de PTFE.
Cloruro de sodio	S7653	Sigma-Aldrich	>99,5% de pureza
Cloroformo	4440-08	Macron Química Fina
Ácido trifluoroacético	299537	Sigma-Aldrich	99% purificado por redestilación para la secuenciación de proteínas
borohidruro de sodio	71321	Fluka Analytical	99%
Solución de hidróxido de amonio	320145	Sigma-Aldrich	Contenido 3: 28.0-30.0%
Metanol	AH230-4	Honeywell Burdick & Ácido	de grado HPLC
Jackson	320099	Sigma-Aldrich	99.70%
Desecador de vacío de plástico	Cualquier modelo de tamaño adecuado	FoodSaver
Anhídrido acético	539996	Sigma-Aldrich	99.50%
Diclorometano	D143SK-4	ThermoFisher Scientific	Grado de HPLC estabilizado
Acetona	9006-03	J.T.Baker	Baker analizado
Colector de evaporación calentado (unidad principal)	pi18823	ThermoFisher Scientific	módulo de calentamiento y agitación Thermo Scientific* Reacti-Therm*; Modelo de triple bloque con función de calentamiento y agitación
Colector de evaporación calentado (evaporador aéreo)	pi18826	ThermoFisher Scientific	Evaporador ThermoScientific* Reacti-Vap, 27 puertos; Para uso con módulo calefactor Reacti-Therm de triple bloque
Bloques portamuestras de aluminio para colector de evaporación	pi18816	ThermoFisher Scientific	Bloque, aluminio, Reacti-Block S-1, tiene capacidad para 13  Tubos de ensayo de mm de diámetro, 13 orificios (14  mm de diámetro x 45 mm; mm de profundidad)
Cromatógrafo de gases	Modelo A7890	Agilent	Equipado con muestreador automático CTC PAL
Espectrómetro de masas	GCT Premier (Tiempo de vuelo)Aguas
Liner de modo dividido (desactivado / silanizado)	5183-4647	Agilent	Contiene un pequeño tapón de lana de vidrio silanizada
DB-5ms GC columna	122-5532	Agilent	30 m x 0,25 mm ID x 0,25 micras de espesor de película
Clorotrimetilsilano	95541	Sigma-Aldrich
Desecador de vacío de vidrio (para silanización de cristalería)	EW-06536-30	Cole-Parmer de	12" de ancho; tamaño
*La silanización de vidrio se lleva a cabo internamente, durante la noche utilizando vapor de clorotrimetilsilano en un desecador de vacío de vidrio grande.