La investigación de la función de Coronin A en la temprana respuesta del hambre de<em&gt; Dictyostelium discoideum</em&gt; Los ensayos de agregación por

Resumen

La ameba social Dictyostelium discoideum experimenta una transición de desarrollo hacia un organismo multicelular cuando se le priva de hambre. La proteína coronina A, conservada evolutivamente, desempeña un papel crucial en el inicio del desarrollo. Utilizando ensayos de agregación como método principal, nuestro objetivo es dilucidar el papel de la coronina A en el desarrollo temprano.

Resumen

Dictyostelium discoideum amebas se encuentra en el suelo, se alimentan de bacterias. Cuando las fuentes de alimentos se vuelven escasos, secretan factores de iniciar un programa de desarrollo pluricelular, durante el cual las células individuales chemotax hacia los centros de agregación ^1-4. Este proceso es dependiente de la liberación de adenosina monofosfato cíclico (cAMP) ^5. cAMP se produce en ondas a través de la acción concertada de la adenilato ciclasa y las fosfodiesterasas, y se une a receptores de cAMP acoplados a proteínas G ^6,7. Un ensayo ampliamente utilizado para analizar los mecanismos implicados en el ciclo de desarrollo del menor eucariota Dictyostelium discoideum se basa en la observación de la agregación celular en condiciones sumergidas ^8,9. Este protocolo describe el análisis de la función de coronin A en el ciclo de desarrollo por el hambre en placas de cultivo de tejidos sumergidos en solución salina equilibrada (BSS) ^10. Coronin A es un miembro de la pr ampliamente conservadafamilia Otein de coronins que han sido implicados en una amplia variedad de actividades de ^11,12. Dictyostelium células que carecen de Coronin A no son capaces de formar agregados multicelulares, y este defecto puede ser rescatado por el suministro de pulsos de cAMP, lo que sugiere que Coronin A actúa aguas arriba de la cAMP en cascada ^10. Las técnicas descritas en estos estudios proporcionan herramientas robustas para investigar funciones de las proteínas durante las etapas iniciales del ciclo de desarrollo de Dictyostelium discoideum aguas arriba de la cascada de AMPc. Por lo tanto, la utilización de este ensayo de agregación puede permitir el estudio adicional de coronin una función y avanzar en nuestra comprensión de la biología coronin.

Introducción

La familia de proteínas coronin está altamente conservada en todo eucariotas. Estas proteínas se caracterizan por la presencia de un triptófano-aspartato amino-terminal (WD) región seguido de una región única conectado a un dominio espiral de la bobina carboxi-terminal ^13,14 repetir que contienen (Figura 1). Coronins han sido implicados en una variedad de funciones celulares, incluyendo la regulación del citoesqueleto y la transducción de señales ^12. En los mamíferos, hasta seis moléculas cortas coronin (coronin 1-6), así como un 'tándem' coronin 7, se pueden co-expresaron ^12,15. Coronin 1 es el miembro de la ....

Protocolo

1. Observar la respuesta del hambre a principios de Dictyostelium discoideum por microscopía de lapso de tiempo.
   1. Se cultivan las células o células DH1.10 Cora-deficiente en un erlenmeyer que contiene HL-5 medio (para 1 litro: 5 g de peptona proteosa, 5 g thiotone E peptona, 10 g de glucosa, 5 g de extracto de levadura, 0,35 g de Na ₂ HPO ₄ * 7H ₂ O, 0,35 g KH ₂ PO _4, 0,05 g dihidroestreptomicina-sulfato, pH 6.6) a 22 ° C en una incubadora de agitación con una rotación de 160 rpm. Mantener las células a una densidad entre 0,01 x 10 ⁶ células / ml y 2 x 10 ⁶ células / ml.
   2. Exa....

Resultados

Las células deficientes en coronin Un espectáculo de un defecto en el desarrollo temprano (Figura 2). En ausencia de Coronin A las células no son capaces de formar agregados multicelulares, que es el paso inicial durante el ciclo de desarrollo de Dictyostelium discoideum. Por lo tanto, coronin A parece jugar un papel durante la respuesta del hambre temprano y / o la señalización de cAMP. De hecho, la falta de formación de agregados multicelulares en ausencia de .......

Discusión

Las proteínas Coronin se encuentran en la mayoría taxones del clado eucariota. Dictyostelium discoideum coronin A, el homólogo de coronin de mamíferos 1, está implicado en la respuesta del hambre temprano, ya Coronin A-deficiente células no son capaces de formar centros de agregación durante el temprano desarrollo ciclo de ^10. Para poder evaluar cuantitativamente y con precisión el retraso en el desarrollo entre las cepas, un microscopio de imágenes de células vivas puesta a punto con el controlador .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medios HL-5 (para 1 L: 5 g de peptona proteosa, 5 g de peptona E de tiotona, 10 g de glucosa, 5 g de extracto de levadura, 0,35 g de Na2HPO4*2H2O, 0,35 g de KH2PO4, 0,05 g dihidroestreptomicina-sulfato, pH 6,6)
Proteosa peptona	BD Bioscience	211693
Puntona E BD	Bioscience	211684
Extracto de levadura	BD Bioscience	212750
Glucosa	AppliChem	A3666
Na2HPO4*2H2O	Fluka	71643
KH2PO4	AppliChem	A1043
dihidroestreptomicina-sulfato	Sigma-Aldrich	D1954000
PBM (0,02 M fosfato de potasio, 10 μ M CaCl2, y l mM MgCl2, pH 6.1)			autofabricado
BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5)			autoproducido
0.45-μ m Filtropure S filtro	Sarstedt	83.1826
Falcon 24 pocillos Placa de cultivo de tejidos	Fisher Scientific	08-772-1H
Microscopio Cellobserver	Zeiss		a medida
Software AxioVision	Zeiss
IPC Microprocesador– bomba dosificadora controlada	ISMATEC	ISM 931
Microscopio Axiovert 135M	Zeiss	491237-0001-000
agitador de incubación	Inforst HT Minitron

hecho