Métodos de estudio de complejos macromoleculares que contienen MRP4-en el Reglamento de Migración de fibroblastos

Summary

MRP4 regula diversos eventos de señalización de nucleótidos cíclicos dependiente incluyendo un papel recientemente dilucidado en la migración celular. Se describe un enfoque directo, pero multifacética para desentrañar las dianas moleculares aguas abajo de MRP4 que resulta en la identificación de un interactoma MRP4 único que juega un papel clave en la regulación afinado de la migración de fibroblastos.

Abstract

proteína de resistencia a múltiples fármacos 4 (MRP4) es un miembro de la familia de casete de unión a ATP de transportadores de membrana y es un transportador de eflujo endógena de nucleótidos cíclicos. Mediante la modulación de la concentración intracelular de nucleótidos cíclicos, MRP4 puede regular múltiples eventos celulares dependientes de nucleótidos cíclicos-incluyendo la migración celular. Anteriormente, hemos demostrado que, en ausencia de MRP4, células de fibroblastos contienen altos niveles de nucleótidos cíclicos intracelulares y pueden migrar más rápido. Para comprender los mecanismos subyacentes de este hallazgo, hemos adoptado un enfoque directo aún multifacético. En primer lugar, hemos aislado posibles complejos de proteínas que interactúan en MRP4 de un sistema de pila de MRP4 sobreexpresión mediante inmunoprecipitación seguida de espectrometría de masas. Después de la identificación de proteínas únicas en el interactoma MRP4, hemos utilizado Ingenuity Pathway Analysis (IPA) para explorar el papel de estas interacciones proteína-proteína en el contexto de la transducción de señales. Hemos dilucidado la popapel poten- del complejo proteína MRP4 en la migración celular e identificado F-actina como un importante mediador del efecto de MRP4 sobre la migración celular. Este estudio también ha destacado el papel de cAMP y cGMP como actores clave en los fenómenos migratorios. El uso de microscopía de alto contenido, se realizaron ensayos de migración celular y observamos que el efecto de MRP4 sobre la migración de fibroblastos está completamente abolida por la interrupción del citoesqueleto de actina o la inhibición de la quinasa dependiente de cAMP A (PKA). Para visualizar las modulaciones de señalización en una celda de la migración en tiempo real, se utilizó un sensor basado en FRET para medir la actividad de PKA y encontramos, la presencia de la actividad de PKA más polarizada cerca del borde de ataque de la migración MRP4 ^{- / -} fibroblastos, en comparación con MRP4 ^{+ / +} fibroblastos. Esto a su vez aumenta la formación de actina cortical y aumenta el proceso de migración. Nuestro enfoque permite la identificación de las proteínas que actúan aguas abajo de MRP4 y nos proporciona un excesovista del mecanismo implicado en la regulación MRP4 dependiente de la migración de fibroblastos.

Introduction

La migración celular es un proceso de múltiples pasos complicado. Los estudios han demostrado que las células durante la migración se polarizó en los bordes de ataque y salida. Al adherirse a la matriz extracelular, el borde de ataque proporciona la tracción necesaria para el cuerpo de la célula se mueva hacia adelante. Por último, las liberaciones se arrastran los bordes traseros adjuntos y completa el ciclo de migración ^1,2.

polarización de las células para la migración celular eficiente está regulada por la segregación espacial de señalización intracelular. Segundos mensajeros celulares, tales como cAMP, median en la compartimentación de los eventos de señalización requeridos para la migración celular ^3,4 direccional afinado. Acumulaciones preferenciales de cAMP y la actividad de PKA quinasa dependiente de cAMP en el borde delantero desempeñan un papel clave en la migración celular direccional de ^5,6. Mediante la fosforilación de las pequeñas GTPasas como sustrato relacionada con Ras toxina botulínica C3 (Rac) y el control de la división celular de proteínas 42 homólogo o Cdc42, PKA activa la proteína actina relacionadas con 2/3 (Arp 2/3) en el borde delantero e induce la formación de lamelipodia ^7-9. PKA también fosforila un agente anti-nivelación, vasodilatador estimulada fosfoproteína (VASP), de ese modo regula los ciclos de oscilación de extensión y retracción de la membrana ^10,11.

En las células, los niveles de cAMP están regulados por tres procesos principales: i) la síntesis de la adenilato ciclasa, ii) la degradación por fosfodiesterasas, y iii) el transporte por transportadores de salida unidos a la membrana ^3. proteína de resistencia a múltiples fármacos 4 (MRP4), un miembro de la ATP vinculante cassette (ABC) de la familia de transportadores de membrana, funciona como un transportador de eflujo endógena de nucleótidos cíclicos. Por lo tanto, MRP4 puede regular los niveles intracelulares de cAMP y dependiente de cAMP celular de señalización ^11-13. Hemos demostrado previamente que en MRP4 ^{- / -,} los fibroblastos contienen niveles relativamente altos de nucleótidos cíclicos y migran más rápido compared a MRP4 fibroblastos ^{+ / + 14.} También informó de un efecto bifásico de nucleótidos cíclicos sobre la migración de fibroblastos. Sobre la base de estudios previos y nuestra conclusión de que MRP4 ^{- / -} fibroblastos contiene cAMP más polarizada durante el transcurso de la migración, la hipótesis de que esta regulación MRP4 mediada por la migración de fibroblastos es dependiente de cAMP. Con el fin de comprender el mecanismo aguas abajo, tomamos un enfoque directo aún multifacético.

Para identificar las proteínas asociadas y en interacción con MRP4, immunoprecipitated complejos macromoleculares que contienen MRP4-a partir de células HEK293 que expresan más de MRP4. El uso de la espectrometría de masa, se identificaron varias proteínas que interaccionan con MRP4 y analizamos su interconectividad usando Ingenuity Pathway Analysis (IPA). IPA es una herramienta útil para analizar las interacciones proteína-proteína (tanto estructurales como funcionales) y explorar sus aportaciones en particular, fisiológicos y patológicoseventos basados ​​en la literatura y las evidencias experimentales ^15,16. IPA indicó que F-actina es un importante objetivo aguas abajo de MRP4 en el contexto de la migración de células, donde cAMP y cGMP son la clave moléculas ¹⁷ de señalización. Estos datos fueron confirmados además por microscopía de alta contenido. Microscopía de alta contenido puede capturar y analizar los comportamientos celulares tales como la migración celular de una manera más conveniente, precisa y de alto rendimiento ^18. Los datos de alto contenido de microscopía demostraron que el efecto de MRP4 sobre la migración de fibroblastos está completamente abolida en la interrupción del citoesqueleto de actina o la inhibición de PKA ^17.

Además, se utilizó una transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) a base de sensor de PKA para controlar la dinámica de PKA en la migración de las células en tiempo real. Sensores de quinasa basados ​​en FRET por lo general consisten en péptidos sustrato de fosforilación específicos flanqueadas por PPC y YFP fluoróforos ^19-21. pmAKAR3 es una mejora y membrane dirigido sensor PKA basados ​​en FRET que contiene dominio forkhead-asociado 1 (FHA1) y la secuencia de sustrato de PKA LRRATLVD ^5,22. La fosforilación de pmAKAR3 por el pKa aumenta subunidad catalítica FRET señal entre CFP y YFP ^19. La inserción de un dominio de modificación de lípidos en el sensor se dirige a la membrana plasmática para el control de la dinámica de PKA, específicamente en el compartimento de membrana ^23.

Usando pmAKAR3, hemos demostrado que el borde delantero de la migración MRP4 ^{- / -} fibroblastos mostraron actividad PKA más polarizada que MRP4 fibroblastos ^{+ / +,} que a su vez incrementó la formación de actina cortical en borde de ataque de la célula ^17. En conjunto, estos eventos resultó en una mejor polarización celular y la migración celular más rápido direccional en ausencia de MRP4. Nuestro enfoque específico y directo identificado abajo objetivos clave para MRP4 y proporciona una importante, pero comoaún sin explorar del mecanismo para la regulación MRP4 dependiente de la migración de fibroblastos.

Protocol

1. Ingenuity Pathway Analysis

1. Carga de proteína-interactoma conjunto de datos
   1. Inserte las proteínas / genes de interés en una hoja de cálculo con sus identificadores únicos de genes (preferiblemente gen símbolos y números de identificación de genes como los obtenidos con los datos de espectrometría de masas).
   2. Asignar una columna en la hoja de cálculo para el número de identificación de genes y una columna para el valor de observación (por ejemplo., Cambio de tapa o p-valor). Seleccionar la opción "contiene encabezado de la columna" para ver los títulos de las columnas.
   3. Sube el conjunto de datos sobre el PIA haciendo clic en la ficha de carga de datos y la selección de la hoja de cálculo antes mencionado. Seleccione la pestaña formato flexible, y seleccione la categoría apropiada de identificación de genes.
      Nota: Un formato flexible del conjunto de datos supera las especificaciones de formato para la carga.
   4. Después de que aparezca el conjunto de datos, seleccione ID de observación y columnas. Asegúrese de que todas las proteínas (MRP4 interactome como se identifica en masa-spectrometry) se asignan mediante la comprobación de la ficha resumen de datos. El conjunto de datos está listo para el análisis deseado.
2. Análisis de los datos
   Nota: Descrito son los usos parcial de las características de la API que se utilizaron para este estudio.
   1. Después de subir interactoma MRP4 con sus nombres de genes como los identificadores únicos, haga clic en nuevo y elegir el análisis de núcleos en el menú superior izquierdo de software IPA.
   2. Ajustar el valor de los puntos de corte de expresión para la intensidad de acuerdo con el tipo de experimento (valor de intensidad de 100 se recomienda para el análisis).
   3. Calcular el factor de cambio en la expresión mientras se prepara el conjunto de datos si las condiciones de control y experimentales están involucrados y lo incluyen como parte del archivo de conjunto de datos si un análisis de comparación se debe realizar (Un valor de corte de 1,5 veces el cambio se recomienda generalmente para el análisis ).
      Nota: Después de completar el análisis del núcleo, múltiples secciones de análisis pueden ser obtenidos. La primera pestaña muestra el resumen de THe análisis totales y sugiere las mejores vías canónicas, reguladores de aguas arriba, funciones moleculares y celulares, y redes entre otros; todo calculado en base a la (valor p) nivel de confianza y dispuestos en orden ascendente de valor de p.
   4. Abrir las principales vías canónicas (usando la opción vía abierta) redes moleculares tan grandes que muestran gráficamente hablando cruz, superposición, y están afectadas las vías de señalización.
      Mira la lista de las vías canónicas que mayormente están involucrados basa en el valor de p (p <0,05 se considera como significativa).
      Nota: Los valores de significación para las vías canónicas se calculan mediante la prueba exacta de Fisher derecho de cola. La importancia indica la probabilidad de asociación de moléculas del conjunto de datos con la vía canónica por azar solo.
   5. Confirmar las proteínas de entrada (interactome MRP4 identificadas por espectrometría de masas) en la lista de las proteínas implicadas en cada vía.
      Nota: El uso de este option, se observó que la red celular citoesqueleto de actina de señalización es la principal vía afectada y cómo las proteínas de entrada encajan en él (Figura 1). Este enfoque ayuda a identificar qué redes moleculares estarían estrechamente relacionados y afectados por las proteínas de prueba.
   6. Usa la ficha de red en los análisis para identificar las enfermedades y las funciones principales que están potencialmente vinculados a una red de proteína en particular basado en el número de moléculas de enfoque.
      Nota: Se da un valor de puntuación basado en las proteínas que se sabe que son determinados como parte de una red, por ejemplo, el montaje celular y la red de la organización, a través del conocimiento literatura y evidencias experimentales y se centran moléculas que se identifican a partir del conjunto de datos y se convierten en parte de la red. . De aquí en adelante, la red se filtra en primer lugar en función del número de moléculas de enfoque.

2. Microscopía de alta contenido

1. Preparación de las células
   Nota: Todos los trabajos de cultivo celular se realiza bajo la campana de flujo horizontal de cultivo celular.
   1. Utilice microplacas de 96 pocillos para el ensayo de curación de heridas.
   2. Escudo la microplaca con una solución de fibronectina 1% (reconstituido en PBS), y mantener la placa en una norma incubador de _CO2 a 37 ° C durante 2 horas.
   3. Quitar MRP4 ^{- / -} y MRP4 ^{+ / +} ratón de fibroblastos embrionarios (MEFs) cultivadas en 25 cm $ ² $ frascos de cultivo de células de la incubadora, se lava 1 vez con PBS, y trypsinize las células durante 5 min usando 1 ml de 4x solución de tripsina-EDTA.
   4. Lavar las células con medio completo (DMEM que contiene 10% de FBS y 1% de penicilina / estreptomicina) y volver a suspender en 5 ml de medio completo.
   5. Aspirar la solución de fibronectina de los pozos. Recuento de células utilizando un hemocitómetro y sembrar 30.000 células (número de células debe ser optimizado en función del tipo de células) en cada pocillo.
   6. Cultivar las células a 100% de confluencia en una normaIncubador de _CO2 a 37 ° C durante 24 horas.
2. La creación de la herida
   1. Asegúrese de que todos los pocillos se llenan con la solución. Llenar los pocillos no utilizados con PBS para evitar daños a la herramienta herida decisiones (por ejemplo., WoundMaker).
   2. Después de confirmar el 100% de confluencia celular, coloque la placa de 96 pocillos dentro de la herramienta de la herida decisiones sobre la placa base de metal y pulse el bloque de púas de 96 pocillos abajo.
   3. Se lavan las células tres veces con PBS para eliminar cualquier célula desalojadas y añadir 100 l de medio completo.
   4. Añadir los compuestos de ensayo - H-89 (50 M; 1: 1000 dilución con medio completo con 50 mM stock en DMSO) o latrunculina B (1 M; 1: 1000 dilución con medio completo con 1 stock mM en DMSO) en esta etapa .
   5. Coloque la placa de ensayo en el interior del lector a 37 ° C y controlar la migración durante el período experimental.
3. Migración de Seguimiento de la célula
   Nota: La migración celular se controló utilizando el microscopio y el software provided con sistema de microscopía de alta contenido. El uso de microplacas de 96 pocillos se asegura de que las heridas se controlan automáticamente por el microscopio y registrados por el software.
   1. Configurar el software para escanear la placa de ensayo cada hora durante los ensayos de migración utilizando la pestaña de exploración horario. Seleccione una hora de inicio al menos 15 min después de la colocación de la placa de ensayo en el interior del lector a permitir el equilibrio antes de la imagen.
   2. Seleccione la bandeja y elegir el tipo de buque (96 pocillos de microplacas) y el tipo de experimento (arañazos de la herida).
   3. Seleccionar objetivo de 10X y seleccione los parámetros de imagen de contraste de fase. Seleccione los pozos que hay que analizar con la opción de edición patrón de lectura.
   4. Especificar los grupos de tratamiento y las repeticiones seleccionando la pestaña de propiedades y la creación de un mapa de placas. El análisis se puede detener en cualquier momento sobre la base de la condición experimental.
4. Análisis de los datos
   1. Después de la exploración se lleva a cabo, seleccione la ficha de vista buque para la placa de ensayo. GRAMOo para los servicios públicos de empleo y trabajo de análisis nuevo análisis de selección de lanzamiento.
   2. Establecer herida cero, como el tipo de trabajo y seleccione el intervalo de tiempo para el análisis (0 punto de tiempo de 24 h punto de tiempo).
   3. Seleccione los pozos a ser escogidos para el análisis de un solo clic en el pozo y haga clic en "Aceptar" para iniciar el análisis. Una vez realizado el análisis, visualizar datos gráficamente la densidad relativa de la herida (RWD) para cada pocillo en cada punto de tiempo utilizando la exportación a la opción de gráfico.
   4. Ver el contraste de fase imagen de conjunto de cada pocillo que corresponden a diferentes puntos de tiempo utilizando la pestaña de la imagen vista. Seleccionar un pozo específico haciendo clic en el mapa de placa, seleccione un punto de tiempo específico desde la ficha hora y haga clic en la pestaña de la imagen vista.

3. Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET)

1. Preparación de las células
   1. Escudo 35 mm placas con fondo de vidrio con 100 l de solución de fibronectina 1% (como se describe en la sección 2.1) y mantenerlos enun estándar incubador de _CO2 a 37 ° C durante 2 horas.
   2. Aspirar la solución de fibronectina de las placas y el mismo número de semillas de células HEK293 (10.000 células / placa) en medio completo.
   3. Cultivar las células a 60-70% de confluencia en los platos con fondo de vidrio recubiertas de fibronectina en una norma incubador de _CO2 a 37 ° C durante 24 horas.
2. La transfección
   1. Realizar todas las transfecciones transitorias usando un reactivo de transfección comercial según las instrucciones del fabricante.
   2. Alícuota de 250 l de medio completo en dos tubos de centrífuga de 1,5 ml estériles separados para cada placa de 35 mm.
   3. Añadir 2 g de ADN (o pmAKAR3 pmAKAR3-TA) en un tubo y 5 l (2,5 veces la concentración de ADN) de reactivo de transfección en otro tubo.
   4. Incubar los tubos durante 20 min a temperatura ambiente y luego transferir el ADN diluido en el tubo que contiene reactivo de la transfección.
   5. Mezclar bien e incubar a 37° C durante otros 30 min.
   6. Aspirar el medio de las células y lavar una vez con PBS. Añadir 1 ml de DMEM libre de antibióticos F-12 medio que contiene 10% de FBS a las células.
   7. Añadir 507 l de conjugado de ADN-lípido con los medios de comunicación a las células en cada placa, mezclar suavemente y mantener en el incubador de _CO2 a 37 ° C durante 48 horas. Utilizar 2 g de ADN (1 mg / l de stock) y lípidos 5 l de 10.000-50.000 células en cada placa.
3. Células vivas imágenes
   1. Después de 48 h de transfección, quitar el medio de crecimiento y se lavan las células 2 veces con solución salina equilibrada de Hank (HBSS, pre-calienta a 37 DO). Añadir un volumen final de 1,9 ml de HBSS a las células lavadas y montarlos en un sistema de microscopio de campo amplio invertida para obtener imágenes de FRET dentro de una medida 37 ° C mantenida cámara.
      Nota: En este sistema, la luz de excitación es proporcionada por una lámpara de 300 W de xenón atenuada con un filtro de densidad neutra con un 50% de luz transmission.
   2. Utilice objetivo 60X. enfocar manualmente sobre las células y establecer un campo de visión óptimo usando el microscopio. Active el campo de vista seleccionado en la pantalla del ordenador utilizando la opción de enfoque "F" en el software. Para la realización de mediciones de FRET, seleccione el conjunto adecuado de filtro (filtro de PPC / YFP conjunto con un filtro de 430/25 nm de excitación, un divisor de haz dicroico doble, y dos filtros de emisión (470/30 nm para PPC y 535/30 nm para FRET) a mano.
   3. Visualizar la fluorescencia por primera comprobación de la opción de canal PPC / YFP / FRET seguido haciendo clic en la pestaña fluor abierta. Mejorar la intensidad de la señal con la función de intensificación en la pestaña de la cámara.
   4. Seleccionar las células que expresan pmAKAR3 o pmAKAR3-TA evitar la saturación de la intensidad de la señal. Utilice la ventana de captura para iniciar la medición de FRET.
   5. Seleccionar la opción de lapso de tiempo y la configuración de un tiempo de exploración durante 30 minutos con un intervalo de 30 segundos. Marque la opción de FRET y establecer el tiempo de exposición a 100 ms. Introduzca la etiqueta de la imagen de unad Pulse Iniciar para iniciar la medición.
   6. Después de cinco puntos de tiempo y el establecimiento de una línea de base, se añaden 25 mM de forskolina (5 l de 10 mM de stock en etanol, se diluye con 100 l de HBSS) a las células sin molestar la placa y controlar las células durante un total de 30 min.
4. Análisis de los datos
   Nota: El uso del módulo de cálculo radiométrico para el análisis de datos.
   1. Haga clic en la herramienta de selección en el lado izquierdo de la ventana de la imagen y elegir un rectángulo sólido desde el menú desplegable. Arrastre el rectángulo en el campo de la imagen de una zona libre de células y clic derecho sobre él para configurarlo como fondo para el propósito de la sustracción del fondo.
   2. Ir a la máscara y el uso de 'crear una nueva máscara' opción. Ir a la herramienta de selección y elegir un lápiz desde el menú desplegable para dibujar manualmente una máscara alrededor de la celda para seleccionarla para una medición. Seleccionar al menos 4-6 células por condición.
   3. Seleccione la pestaña de la máscara y realizar estadísticas de la máscara.
   4. Check 'máscara completa', expanda la opción de varios canales y seleccione donante de FRET normalizado (N-FRET) (FRET / PPC). El valor N-FRET es representativa de la actividad PKA en la membrana plasmática.
   5. Añadir marcas de tiempo, tabla de consulta y la escala de barras utilizando las anotaciones.

Results

Para estudiar el efecto de MRP4 sobre la migración de fibroblastos, se utilizó un ensayo de curación de la herida utilizando la microscopía de alta contenido ^14. Heridas exacta se realizaron sobre monocapas confluentes de MEFs aisladas de cualquiera de MRP4 ^{- / -} o MRP4 ratones ^{+ / +,} y las imágenes fueron tomadas a intervalos de 1 h durante 24 hr. Se observó una tasa de migración más alta para MRP4 ^{- ...}

Discussion

La migración celular es un proceso intrincado que desempeña un papel indispensable en muchos eventos fisiológicos importantes, incluida la cicatrización de heridas^1,2. Las migraciones celulares aberrantes pueden causar eventos catastróficos, como metástasis tumorales y angiogénesis^24,25. Por lo tanto, se requiere una regulación afinada de la migración celular para mantener la función normal del cuerpo.

Usando microscopía de alto contenido¹⁸, demostramos que los...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamina 2000	Invitrogen (Carlsbad, CA)	11668-027
DMEM	Invitrogen (Carlsbad, CA)	11965-092
IncuCyte Zoom	Essen BioScience
Microplacas IncuCyte Image-Lock de 96 pocillos	Essen BioScience	4493
Latrunculin B	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).	L5288	Culata en DMSO
H-89	Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY)	BML-EI196	Culata en platos DMSO
de 35 mm con fondo de vidrio	(Corporación MatTek; Ashland, MA)	P35G-1.5-20-C
Fibronectina	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).	F1141
Opti-MEM Reduced Serum Media	Invitrogen (Carlsbad, CA)	31985-088
Sistema de microscopía FRET Microscopio	invertido Olympus (IX51)
Cámara CCD	Hamamatsu, Japón	ORCA285
SlideBook software 5.5	Intelligent Imaging Innovation (Denver, CO)
Software de análisis de vías Ingenuity	IPA, QIAGEN Redwood City,Forskolin
	Tocris (Ellisville, MO).	1099	Stock en 100% EtOH
DMEM F-12	Invitrogen (Carlsbad, CA)	11330-057
HBSS	Invitrogen (Carlsbad, CA)	14025-134
Excel	Microsoft
PBS	Invitrogen(Carlsbad, CA)	10010-023
Solución de tripsina/EDTA (TE)	Invitrogen(Carlsbad, CA)	R-001-100
Invitrogen de penicilina-estreptomicina	(Carlsbad, CA)	Números 15140-122