Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Desarrollo de una

12.4K vistas

⸱

DOI:

10.3791/53974

⸱

10 de junio de 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Laboratory, The University of Tokyo Hospital, 2Department of Respiratory Medicine, The University of Tokyo Hospital

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos el desarrollo y la aplicación de un ensayo de contracción en gel para evaluar la función contráctil en células mesenquimales que experimentaron una transición epitelio-mesenquimatosa.

Resumen

La fibrosis a menudo está involucrada en la patogénesis de diversas enfermedades crónicas progresivas, como la enfermedad pulmonar intersticial. La característica patológica es la formación de focos fibroblásticos, que se asocia con la gravedad de la enfermedad. Se propone que las células mesenquimales que consisten en los focos fibroblásticos se derivan de varias fuentes celulares, incluidos los fibroblastos intrapulmonares originalmente residentes y los fibrocitos circulantes de la médula ósea. Recientemente, se ha supuesto que las células mesenquimales que se sometieron a una transición epitelio-mesenquimal (EMT) contribuyen a la patogénesis de la fibrosis. Además, la EMT puede ser inducida por el factor de crecimiento transformante β, y la EMT puede ser mejorada por citocinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral α. El ensayo de contracción en gel es un modelo in vitro ideal para la evaluación de la contractilidad, que es una de las funciones características de los fibroblastos y contribuye a la reparación de heridas y fibrosis. Aquí, se demuestra el desarrollo de un ensayo de contracción en gel para evaluar la capacidad contráctil de las células mesenquimales que se sometieron a EMT.

Introducción

Fibrosis está implicada en la patogénesis de diversas enfermedades progresivas crónicas, como la enfermedad pulmonar intersticial, fibrosis cardiaca, cirrosis hepática, insuficiencia renal terminal, la esclerosis sistémica, y las enfermedades autoinmunes 1. Entre las enfermedades pulmonares intersticiales, fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad progresiva crónica y muestra mal pronóstico. característica patológica de la IPF es el desarrollo de focos de fibroblasto que consiste en fibroblastos y miofibroblastos activados que están asociados con el pronóstico. Se proponen los orígenes de tales fibroblastos pulmonares que se derivan de varias células mesenquimales, incluyendo fibroblastos pulmonares residentes originalmente y que circulan fibrocitos de la médula ósea. Recientemente, se ha propuesto transición epitelio-mesenquimal (EMT) que se asocia con la formación de células mesenquimales 2, y para contribuir a la patogénesis de trastornos fibróticos.

Se cree que la EMT juega un papel importante en el proceso de desarrollo fetal, la cicatrización de heridas, y la progresión del cáncer, incluyendo la invasión tumoral y la metástasis 3. Tras el proceso de EMT, las células epiteliales obtener la capacidad de las células mesenquimales por la pérdida de marcadores epiteliales, tales como la E-cadherina, y por la expresión de marcadores mesenquimales, tales como la vimentina, y α-actina de músculo liso (SMA) 4,5. Estudios anteriores mostraron la evidencia de que proceso de EMT se ha asociado con el desarrollo de fibrosis de tejidos en el riñón y el pulmón 6 7. Además, la inflamación crónica promueve la enfermedad fibrótica 8; Además, las citoquinas inflamatorias tales como miembro de la superfamilia de factor de necrosis tumoral 14 (TNFSF14; LIGHT), factor de necrosis tumoral (TNF) -α, y la interleucina-1β, se ha demostrado para mejorar EMT 9-12.

ensayo de contracción de gel de colágeno, un ensayo de contracción de las células a base de colágeno en el que los fibroblastos se incrustan en el tipo Igel de colágeno tridimensional, es un ideal modelo in vitro para la evaluación de la contractilidad. La contractilidad es una de las funciones características de los fibroblastos y contribuye a la reparación de heridas normal y fibrosis 13. En este ensayo, se cree que la unión de los fibroblastos para colágeno tipo I a través de mecanismos dependientes de integrina se supone para producir tensión mecánica bajo ciertas condiciones, y en consecuencia dar lugar a la contracción del tejido.

Aquí, se informa que el desarrollo del ensayo de contracción de gel que adaptarse para evaluar la adquisición de la función contráctil en las células que se sometieron a EMT. Este informe demuestra que este ensayo modificado es adecuado para la evaluación de la contractilidad de las células mesenquimales que se sometieron a EMT.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Preparación y cultivo de células epiteliales de pulmón

  1. células epiteliales de pulmón humano A549 Cultura (línea de células adherentes) en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 UI / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina.
  2. Retirar y desechar el medio de cultivo celular de placa de cultivo, y se lava una vez con 5 - 10 ml de tampón fosfato salino (PBS). Después del lavado, aspirar inmediatamente a la PBS.
  3. Añadir 2 ml de ácido tripsina / etilendiaminotetraacético (EDTA) (0,05%) y se incuba a 37 ° C y 5% de CO2 durante 3 min.
  4. Recoger las células separadas en tubos de centrífuga que contiene medio de cultivo de células, centrifugar los tubos a temperatura ambiente durante 4 min a 150 x g.
  5. Resuspender el pellet de células en 2 ml de medio de cultivo celular y retirar una muestra para el recuento de células. Contar el número de las células utilizando un hemocitómetro con tripán azul mancha para comprobar la viabilidad celular.
  6. células A549 semilla en10 placas de poliestireno cm a una densidad de 0,5 - 1,0 x 10 6 células / placa con 10 ml de medio para el ensayo de contracción de gel. Sembrar las células en placas de 6 pocillos de poliestireno a una densidad de 0,5 - 1,0 x 10 5 células / pocillo con 2 ml de medio para la confirmación de la EMT. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 horas.

2. Procedimiento de EMT

  1. Añadir 10 l de TGF-β1 (5 g / ml) y 10 l de TNF-α (10 g / ml) a la placa para el ensayo de contracción de gel sembrado en el paso 1.6. Añadir 2 l de TGF-β1 (5 g / ml) y 2 l de TNF-α (10 g / ml) a la placa para la confirmación EMT cabeza de serie en el paso 1.6. Se incuba a 37 ° C y 5% de CO2 durante 48 horas.

3. Confirmación de Procedimiento EMT por PCR y Western Blotting

  1. Confirmar cambio en la morfología (de similar a la piedra del adoquín al husillo forma) de las células tratadas utilizando microscopía de contraste de fase.
    Nota: Normacélulas de Al A549 tienen adoquín apariencia similar a la piedra y de forma triangular que es una característica de las células epiteliales, pero después de la estimulación con TGF-β1 y TNF-α, las células aparecen de largo y en forma de huso que es similar a las células mesenquimales 14,15.
  2. Evaluar la expresión de un marcador epitelial, tales como E-cadherina, y los marcadores mesenquimales tales como N-cadherina, vimentina y actina de músculo liso α-utilizando PCR o Western Blot.
    1. Extraer el ARN total de las células usando el kit de extracción de ARN 16 y sintetizar cDNA utilizando la transcriptasa inversa 17 de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    2. Medir la expresión de los niveles de mRNA utilizando el sistema de PCR en tiempo real 18 y tinte de cianina monomérica kit PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores específicos para GAPDH (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa), ACTA2 (alfa-actina-2), CDH1 (cadherina-1; E-cadherina) y VIM (vimentina) se muestran en la Tabla 1 .
    3. Lisar las células utilizando un tampón de lisis (Tabla 2) que contenía 1% de cóctel inhibidor de proteasa. Medir todas las concentraciones de proteína de la muestra utilizando un kit de ensayo de proteínas de 19,20, y aplicar las mismas cantidades de proteína en un gel de poliacrilamida.
      1. Realizar SDS-electroforesis en gel y transferencia semiseca de las proteínas a una membrana de PVDF 21. Incubar la membrana con anticuerpos primarios en tampón de bloqueo durante 1 - 2 hr. Después de la incubación, lavar dos veces la membrana con tampón de lavado y se incuba la membrana hr 1 con segundos anticuerpos.
        Nota: Véase la Tabla de Materiales / Equipo de anticuerpos y diluciones utilizadas en estos estudios. Véase la Tabla 2 para los componentes del tampón de bloqueo.
      2. Lavar la membrana con tampón de lavado dos veces. Tome fotos de la membrana con el kit de detección de Western Blot 22 utilizando una cámara CCD de 11,23 frío.

4. Gel Ensayo de contracción para la EMT Evaluación

  1. Aspirar el medio acondicionado desde el recipiente de cultivo de células, y lavar bien con 5 - 10 ml de PBS para eliminar las células muertas. Después del lavado, aspirar inmediatamente a la PBS.
  2. Añadir 2 ml de 0,05% de tripsina / EDTA y se incuba a 37 ° C y 5% de CO2 durante 3 min.
  3. Recoger las células separadas en tubos de centrífuga que contienen DMEM complementado con inhibidor de tripsina (1 mg / ml), centrifugar los tubos a temperatura ambiente durante 4 min a 150 x g.
  4. Mezclar tipo gel 1 de colágeno con agua destilada, y 4 × DMEM concentrado para ajustar los volúmenes para lograr una concentración de colágeno de 1,75 mg / ml, y 1 × concentración DMEM. Asegúrese de mantener el medio de gel en hielo durante este paso.
    Nota: Para hacer 6 ml de medio de gel, mezclar bien 3,5 ml de tipo 1 de gel de colágeno (3 mg / ml), 1,5 ml de 4 × DMEM concentrado, y 1 ml de agua destilada.
  5. Resuspender el sedimento celular en 500 l de PBS y extraer una muestra para recuento de células. Contarel número de las células utilizando un hemocitómetro con tinción de azul de tripano para verificar la viabilidad celular.
  6. Añadir el medio de gel de ajustar los volúmenes de lograr una densidad celular de 3,0 × 10 5 células / pocillo (6,0 × 10 5 células / ml) y suavemente pero rápidamente se mezcla mediante pipeteo sin gelificación.
  7. Dispensar 0,5 ml de la mezcla en cada pocillo de una placa no tratada de 24 pocillos de forma rápida y cuidadosamente para asegurarse de forma cilíndrica ordenada. Tenga cuidado de no permitir que las burbujas de aire que contaminan los geles (Figura 1A).
    Nota: El medio de gel que contiene las células es viscoso y puede gelificar fácilmente y la forma de media luna forma en el pozo.
  8. Incubar la placa durante 15 min en un incubador de células a 37 ° C, 5% de CO2 y 95% de humedad a gel completamente.
  9. Separar los geles de la placa sin romper moviendo una espátula esterilizada de una manera para dibujar una circunferencia en una dirección. Usando una espátula, transferir suavemente los geles a placas de cultivo de tejidos de 60 mmque contiene 5 ml de DMEM / 1% de FBS con o sin TGF-β1 (5 ng / ml) y TNF-α (10 ng / ml).
  10. Agite con cuidado los platos para asegurar geles están flotando en el medio. Incubar en un incubador de células a 37 ° C, 5% de CO2 y 95% de humedad.

5. Medición de Gel Tamaño

  1. Medir el tamaño de gel de colágeno después de 0, 24, 48, y 72 hr utilizando un sistema de análisis de imagen.
    1. Encienda el sistema de documentación de geles (Figura 2A), y poner los platos en el armario de protección contra la luz. A continuación, retire la tapa de platos en el armario.
    2. Abra el software de análisis relacionada gel. Haga clic en el botón "adquisición de imágenes" en la barra de menú para mostrar la imagen de los geles en el gabinete. A continuación, haga clic en "adquirir" en la barra de menú para tomar imágenes de los geles (Figura 2B).
    3. Haga clic en el botón "detección" en la barra de menús (Figura 2C) y ajustar la región de medición (i círculo amarillon Figura 2C) arrastrando el ratón. A continuación, haga clic en el botón "detectar automáticamente" en la barra de menú (véase el botón en la Figura 2D). El software detecta automáticamente los geles que muestran un mapa de calor (Figura 2D).
    4. Haga clic en "OK" para extraer el contorno de los geles de tratamiento de la imagen y calcular áreas rodeadas por el contorno (Figura 2E). Después se calcula el área, el área calculada se visualiza en la ventana emergente separada.
      Nota: Si los geles se solapan entre sí durante la exploración, geles mueva suavemente con una punta de pipeta estéril.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Durante la EMT, las células epiteliales pierden marcadores epiteliales, como E-cadherina, y obtener la expresión de marcadores mesenquimales, como la vimentina y α-actina de músculo liso 4,5. La incubación de células epiteliales de pulmón humano A549 con TGF-β1 y TNF-α induce EMT. La aparición de células A549 normales son de adoquín como la forma y la forma del triángulo que es una característica de las células epiteliales (Figura 3A), pero después de estimula...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

El protocolo desarrollado en este estudio comprende dos etapas. La primera etapa se realiza para inducir EMT, mientras que el segundo paso es el ensayo de contracción de gel. Dado que es importante confirmar que las células se sometieron a EMT, el paso 2 proporciona un excelente complemento a los cambios en la expresión de genes y morfológicos. Estudios anteriores demostraron que la EMT de las células A549 fue inducida por sólo el 24 por TGF-β1; Sin embargo, como hemos informado anteriormente 10, e...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Tadashi Koyama por su ayuda técnica. Este trabajo fue apoyado en parte por los números de subvención JSPS KAKENHI 23249045, 15K09211, 15K19172; una subvención al Grupo de Investigación en Insuficiencia Respiratoria del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón; una beca para la investigación sobre enfermedades alérgicas e inmunología, Japón.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEMsigma aldrich11965-092para A549 medio
FBSGIBCO10437
Transformando el factor de crecimiento-β 1, Humano, productos químicos de laboratorio recombinantesWako209-16544
TNF-y alfa humano recombinante;R& D systems210-TA/CF
E-Cadherin (24E10) Tecnologíade señalización de células#3195dilución 1:3.000
Vimentina (D21H3)Tecnología de señalización de células#57411:3.000
Anti-α-Tubulina anticuerposigma aldrichT9026dilución 1:10.000
Antiactina monoclonal, α-Anticuerpo de músculo liso& nbsp;Sigma AldrichA5228Dilución 1:10.000
Anticuerpo anti-N-cadherinaBD Transduction Laboratories#610920Dilución 1:1.000
IgG anti-ratón, oveja Ab entera ligada a HRP (anticuerpo secundario)GE HealthcareNA931-100UL1:20.000 dilución
Anti-Rabbit IgG, Ab Donkey entero ligado a HRP (anticuerpo secundario)GE HealthcareNA934-100UL1:20.000 dilución
Reactivo de bloqueoGE HealthcareRPN4182% en TBS-T
pocillos Clear Flat Bottom TC-Tratado con placa de cultivo celular multipocillo, con tapacorning#353046
100 mm Placa de cultivo celularTPP#93100
DMEM, tecnologías de vida en polvo12100-046Para 4× DMEM
Gel de colágeno tipo 1Gelatina NittaCellmatrix tipo I-A
24 pocillos placa de cultivo celularAGC TECHNO GLASS1820-024
Sistema de documentación de gel ATTOAE-6911FXNGenerador de imágenes en gel
Software de análisis de gelATTODensitograph, ver. 3.00software de análisis incluido con AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0.05%), Tecnologías de Vida Roja de Fenol25300054
24 Placas de Pocillos, sin tratarIWAKI1820-024
Solución de Azul de Tripano, 0.4%Life Technologies15250-061
kit de extracción de ARNQiagen74106
Tecnologías de vida con transcriptasa inversa18080044
Sistema de PCR en tiempo realStratageneMx-3000P
SYBR kit de PCR verdeQiagen204145
Cóctel de inhibidores de proteasa (100x)life technologies78429
Membranade PVDFATTO2392390
Kit de ensayo de proteínasbio-rad5000006JA 
Gel de poliacrilamidaATTO2331810
reactivo de detección de Western blotGE HealthcareRPN2232
Cámara CCD fríaATTOEz-Capture MG/ST
Inhibidor de tripsinaSigma AldrichT9003-100MG
Polioxietileno (20)Monolaurato de sorbitánWako Productos químicos de laboratorio163-11512
Éter de polioxietileno (9) octiifeniloProductos químicos141-08321
mAb de conejo mAb de conejo dilución 6 de laboratorio de Wako

Referencias

  1. Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-214 (2008).
  2. Hardie, W. D., Glasser, S. W., Hagood, J. S. Emerging concepts in the pathogenesis of lung fibrosis. The American journal of pathology. 175, 3-16 (2009).
  3. Kovacic, J. C., Mercader, N., Torres, M., Boehm, M., Fuster, V. Epithelial-to-mesenchymal and endothelial-to-mesenchymal transition: from cardiovascular development to disease. Circulation. 125, 1795-1808 (2012).
  4. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  5. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. The Journal of clinical investigation. 119, 1420-1428 (2009).
  6. Forino, M., et al. TGFbeta1 induces epithelial-mesenchymal transition, but not myofibroblast transdifferentiation of human kidney tubular epithelial cells in primary culture. International journal of experimental pathology. 87, 197-208 (2006).
  7. Yang, S., et al. Participation of miR-200 in pulmonary fibrosis. The American journal of pathology. 180, 484-493 (2012).
  8. Reynolds, H. Y. Lung inflammation and fibrosis: an alveolar macrophage-centered perspective from the 1970s to 1980s. American journal of respiratory and critical care medicine. 171, 98-102 (2005).
  9. Camara, J., Jarai, G. Epithelial-mesenchymal transition in primary human bronchial epithelial cells is Smad-dependent and enhanced by fibronectin and TNF-alpha. Fibrogenesis & tissue repair. 3, 2(2010).
  10. Kamitani, S., et al. Simultaneous stimulation with TGF-beta1 and TNF-alpha induces epithelial mesenchymal transition in bronchial epithelial cells. International archives of allergy and immunology. 155, 119-128 (2011).
  11. Mikami, Y., et al. Lymphotoxin beta receptor signaling induces IL-8 production in human bronchial epithelial cells. PloS one. 9, e114791(2014).
  12. Yamauchi, Y., et al. Tumor necrosis factor-alpha enhances both epithelial-mesenchymal transition and cell contraction induced in A549 human alveolar epithelial cells by transforming growth factor-beta1. Experimental lung research. 36, 12-24 (2010).
  13. Grinnell, F. Fibroblasts, myofibroblasts, and wound contraction. The Journal of cell biology. 124, 401-404 (1994).
  14. Ramos, C., et al. FGF-1 reverts epithelial-mesenchymal transition induced by TGF-{beta}1 through MAPK/ERK kinase pathway . American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 299, L222-L231 (2010).
  15. Ren, Z. X., Yu, H. B., Li, J. S., Shen, J. L., Du, W. S. Suitable parameter choice on quantitative morphology of A549 cell in epithelial-mesenchymal transition. Bioscience reports. 35, (2015).
  16. Brinkmann, V., Kinzel, B., Kristofic, C. TCR-independent activation of human CD4+ 45RO- T cells by anti-CD28 plus IL-2: Induction of clonal expansion and priming for a Th2 phenotype. Journal of immunology. 156, 4100-4106 (1996).
  17. Krug, M. S., Berger, S. L. First-strand cDNA synthesis primed with oligo(dT). Methods in enzymology. 152, 316-325 (1987).
  18. Morozumi, M., et al. Simultaneous detection of pathogens in clinical samples from patients with community-acquired pneumonia by real-time PCR with pathogen-specific molecular beacon probes. Journal of clinical microbiology. 44, 1440-1446 (2006).
  19. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  20. Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Analytical biochemistry. 175, 231-237 (1988).
  21. Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W., et al. Electroblotting from polyacrylamide gels. Current protocols in protein science. Chapter 10, Unit 10.7(2001).
  22. Kricka, L. J., Voyta, J. C., Bronstein, I. Chemiluminescent methods for detecting and quantitating enzyme activity. Methods in enzymology. 305, 370-390 (2000).
  23. Noguchi, S., et al. An integrative analysis of the tumorigenic role of TAZ in human non-small cell lung cancer. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 20, 4660-4672 (2014).
  24. Kasai, H., Allen, J. T., Mason, R. M., Kamimura, T., Zhang, Z. TGF-beta1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition (EMT). Respiratory research. 6, 56(2005).
  25. Chen, X., et al. Integrin-mediated type II TGF-beta receptor tyrosine dephosphorylation controls SMAD-dependent profibrotic signaling. The Journal of clinical investigation. 124, 3295-3310 (2014).
  26. Saito, A., et al. An integrated expression profiling reveals target genes of TGF-beta and TNF-alpha possibly mediated by microRNAs in lung cancer cells. PloS one. 8, e56587(2013).
  27. Dvashi, Z., et al. Protein phosphatase magnesium dependent 1A governs the wound healing-inflammation-angiogenesis cross talk on injury. The American journal of pathology. 184, 2936-2950 (2014).
  28. Hallgren, O., et al. Enhanced ROCK1 dependent contractility in fibroblast from chronic obstructive pulmonary disease patients. Journal of translational medicine. 10, 171(2012).
  29. Kobayashi, T., et al. Matrix metalloproteinase-9 activates TGF-beta and stimulates fibroblast contraction of collagen gels. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 306, L1006-L1015 (2014).
  30. Horie, M., et al. Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. Experimental lung research. 40, 222-236 (2014).
  31. Kohyama, T., et al. PGD(2) modulates fibroblast-mediated native collagen gel contraction. American journal of respiratory cell and molecular biology. 27, 375-381 (2002).
  32. Muir, A. B., et al. Esophageal epithelial cells acquire functional characteristics of activated myofibroblasts after undergoing an epithelial to mesenchymal transition. Experimental cell research. 330, 102-110 (2015).
  33. Zhong, Q., et al. Role of endoplasmic reticulum stress in epithelial-mesenchymal transition of alveolar epithelial cells: effects of misfolded surfactant protein. American journal of respiratory cell and molecular biology. 45, 498-509 (2011).
  34. Liu, X. Inflammatory cytokines augments TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in A549 cells by up-regulating TbetaR-I. Cell motility and the cytoskeleton. 65, 935-944 (2008).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Ensayo de contracci n de gelTGF beta 1TNF alfac lulas A549contractilidad celularan lisis por Western blottinci n por inmunofluorescenciaincubadora de cultivo celular
Desarrollo de una
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.