Desarrollo de una In Vitro Ensayo para evaluar la función contráctil de las células mesenquimales que la transición epitelio-mesenquimal Sufrió

Summary

Aquí, describimos el desarrollo y la aplicación de un ensayo de contracción en gel para evaluar la función contráctil en células mesenquimales que experimentaron una transición epitelio-mesenquimatosa.

Abstract

La fibrosis a menudo está involucrada en la patogénesis de diversas enfermedades crónicas progresivas, como la enfermedad pulmonar intersticial. La característica patológica es la formación de focos fibroblásticos, que se asocia con la gravedad de la enfermedad. Se propone que las células mesenquimales que consisten en los focos fibroblásticos se derivan de varias fuentes celulares, incluidos los fibroblastos intrapulmonares originalmente residentes y los fibrocitos circulantes de la médula ósea. Recientemente, se ha supuesto que las células mesenquimales que se sometieron a una transición epitelio-mesenquimal (EMT) contribuyen a la patogénesis de la fibrosis. Además, la EMT puede ser inducida por el factor de crecimiento transformante β, y la EMT puede ser mejorada por citocinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral α. El ensayo de contracción en gel es un modelo in vitro ideal para la evaluación de la contractilidad, que es una de las funciones características de los fibroblastos y contribuye a la reparación de heridas y fibrosis. Aquí, se demuestra el desarrollo de un ensayo de contracción en gel para evaluar la capacidad contráctil de las células mesenquimales que se sometieron a EMT.

Introduction

Fibrosis está implicada en la patogénesis de diversas enfermedades progresivas crónicas, como la enfermedad pulmonar intersticial, fibrosis cardiaca, cirrosis hepática, insuficiencia renal terminal, la esclerosis sistémica, y las enfermedades autoinmunes ^1. Entre las enfermedades pulmonares intersticiales, fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad progresiva crónica y muestra mal pronóstico. característica patológica de la IPF es el desarrollo de focos de fibroblasto que consiste en fibroblastos y miofibroblastos activados que están asociados con el pronóstico. Se proponen los orígenes de tales fibroblastos pulmonares que se derivan de varias cé....

Protocol

1. Preparación y cultivo de células epiteliales de pulmón

1. células epiteliales de pulmón humano A549 Cultura (línea de células adherentes) en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 UI / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina.
2. Retirar y desechar el medio de cultivo celular de placa de cultivo, y se lava una vez con 5 - 10 ml de tampón fosfato salino (PBS). Después del lavado, aspirar inmediatamente a la PBS.
3. Añadir 2 ml de ácido tripsina / etilendiaminotetraacético (EDTA) (0,05%) y se incuba a 37 ° C y 5% de _CO2 durante 3 min.
4. Recoger las células separa....

Results

Durante la EMT, las células epiteliales pierden marcadores epiteliales, como E-cadherina, y obtener la expresión de marcadores mesenquimales, como la vimentina y α-actina de músculo liso ^4,5. La incubación de células epiteliales de pulmón humano A549 con TGF-β1 y TNF-α induce EMT. La aparición de células A549 normales son de adoquín como la forma y la forma del triángulo que es una característica de las células epiteliales (Figura 3A), pero después de estimula.......

Discussion

El protocolo desarrollado en este estudio comprende dos etapas. La primera etapa se realiza para inducir EMT, mientras que el segundo paso es el ensayo de contracción de gel. Dado que es importante confirmar que las células se sometieron a EMT, el paso 2 proporciona un excelente complemento a los cambios en la expresión de genes y morfológicos. Estudios anteriores demostraron que la EMT de las células A549 fue inducida por sólo el ²⁴ por TGF-β1; Sin embargo, como hemos informado anteriormente ^10, e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	sigma aldrich	11965-092	para A549 medio
FBS	GIBCO	10437
Transformando el factor de crecimiento-β 1, Humano, productos químicos de laboratorio recombinantes	Wako	209-16544
TNF-y alfa humano recombinante;	R& D systems	210-TA/CF
E-Cadherin (24E10) Tecnología	de señalización de células	#3195	dilución 1:3.000
Vimentina (D21H3)	Tecnología de señalización de células	#5741	1:3.000
Anti-α-Tubulina anticuerpo	sigma aldrich	T9026	dilución 1:10.000
Antiactina monoclonal, α-Anticuerpo de músculo liso& nbsp;	Sigma Aldrich	A5228	Dilución 1:10.000
Anticuerpo anti-N-cadherina	BD Transduction Laboratories	#610920	Dilución 1:1.000
IgG anti-ratón, oveja Ab entera ligada a HRP (anticuerpo secundario)	GE Healthcare	NA931-100UL	1:20.000 dilución
Anti-Rabbit IgG, Ab Donkey entero ligado a HRP (anticuerpo secundario)	GE Healthcare	NA934-100UL	1:20.000 dilución
Reactivo de bloqueo	GE Healthcare	RPN418	2% en TBS-T
pocillos Clear Flat Bottom TC-Tratado con placa de cultivo celular multipocillo, con tapa	corning	#353046
100 mm Placa de cultivo celular	TPP	#93100
DMEM, tecnologías de vida en polvo		12100-046	Para 4× DMEM
Gel de colágeno tipo 1	Gelatina Nitta	Cellmatrix tipo I-A
24 pocillos placa de cultivo celular	AGC TECHNO GLASS	1820-024
Sistema de documentación de gel	ATTO	AE-6911FXN	Generador de imágenes en gel
Software de análisis de gel	ATTO	Densitograph, ver. 3.00	software de análisis incluido con AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0.05%), Tecnologías de Vida Roja de Fenol		25300054
24 Placas de Pocillos, sin tratar	IWAKI	1820-024
Solución de Azul de Tripano, 0.4%	Life Technologies	15250-061
kit de extracción de ARN	Qiagen	74106
Tecnologías de vida con transcriptasa inversa		18080044
Sistema de PCR en tiempo real	Stratagene	Mx-3000P
SYBR kit de PCR verde	Qiagen	204145
Cóctel de inhibidores de proteasa (100x)	life technologies	78429
Membrana	de PVDFATTO	2392390
Kit de ensayo de proteínas	bio-rad	5000006JA
Gel de poliacrilamida	ATTO	2331810
reactivo de detección de Western blot	GE Healthcare	RPN2232
Cámara CCD fría	ATTO	Ez-Capture MG/ST
Inhibidor de tripsina	Sigma Aldrich	T9003-100MG
Polioxietileno (20)Monolaurato de sorbitán	Wako Productos químicos de laboratorio	163-11512
Éter de polioxietileno (9) octiifenilo	Productos químicos	141-08321