Murino de próstata micro-disección y la castración quirúrgica

Resumen

Este manuscrito describe los protocolos de próstata micro-disección y la castración quirúrgica en el ratón de laboratorio. También se representan los resultados representativos producidos por estos protocolos. Finalmente, se discuten las ventajas y utilización de estos protocolos.

Resumen

Los modelos de ratón se utilizan ampliamente para estudiar el cáncer de próstata y otras enfermedades. El ratón es un excelente modelo con el que estudiar la próstata y se ha utilizado como sustituto de los descubrimientos sobre el desarrollo y las enfermedades de la próstata humana. La microdisección de la próstata permite el estudio coherente de la anatomía de la próstata, la histología y las características celulares específicas del lóbulo en ausencia de contaminación de otros tejidos. La testosterona afecta el desarrollo de la próstata y las enfermedades. La terapia de privación de andrógenos es un tratamiento común para los pacientes con cáncer de próstata, pero muchos tumores de próstata se vuelven resistentes a la castración. La castración quirúrgica de modelos de ratón permite estudiar la resistencia a la castración y otras facetas de la biología hormonal en la próstata. Este procedimiento puede combinarse con la reintroducción de testosterona o la regeneración hormonal de la próstata, un método poderoso para estudiar los linajes de células madre en la próstata. Juntas, la microdisección de la próstata y la castración quirúrgica abren una multitud de oportunidades para una investigación sólida y consistente del desarrollo y la enfermedad de la próstata. Este manuscrito describe los protocolos para la microdisección de próstata y la castración quirúrgica en el ratón de laboratorio.

Introducción

La próstata es el sitio más común de cáncer en hombres en los EE.UU.. Cerca de 220.000 hombres cada año serán diagnosticados con cáncer de próstata, y aproximadamente 27.000 hombres sucumbirán a la enfermedad ^1. Los hombres tienen un riesgo de 1 en 7 tiempo de vida de un diagnóstico de cáncer de próstata en los EE.UU. ^1. Hiperplasia de próstata benigna (BPH), un agrandamiento no canceroso relacionada con la edad de la próstata, es también una condición generalizada, que afecta a más del 80% de los hombres de más de 80 ^2. Como tal, la próstata es el foco de una investigación considerable.

Los modelos de ratón se han utilizado ampliamente para estudiar las enfermedades de la próstata ^3. En general, la próstata del ratón es un excelente representante de la glándula humana ^4, pero hay similitudes y diferencias entre el ratón y la anatomía y la fisiología de próstata humana ^5. En ambas especies, la próstata se encuentra en la base de la vejiga, que rodea a la uretra. La glándula de la próstata humana es una única loser, dividido en cuatro zonas: central, de transición, periférica, y el estroma fibromuscular anterior. En contraste, la próstata de ratón consta de tres lóbulos pareadas en diferentes posiciones alrededor de la uretra: anterior, ventral y dorsolateral. A nivel celular, la diferencia principal es que la célula basal a la proporción de células luminal en humanos es de aproximadamente 1: 1, pero es 1: 4 en ratones ^6. El estroma murino también es diferente en ratones en relación con los seres humanos - los seres humanos tienen más extensa del músculo liso, mientras que la capa muscular es mucho más delgada en la próstata murino. La adecuada identificación, disección, y la manipulación de la próstata del ratón son esenciales para la investigación de la próstata del ratón.

Los niveles hormonales afectan drásticamente el desarrollo y la homeostasis de la glándula de la próstata en los seres humanos y ratones. Mientras que el estrógeno parece desempeñar un papel en el desarrollo de la próstata ^7, la hormona más importante en la próstata es la testosterona. La testosterona es esencial para un desarrollo glandularmantenimiento d. Después de cualquiera de la castración física o química, aproximadamente el 90% de las células luminales en el apoptose adulto de próstata y la glándula reduce. Si se vuelve a introducir la testosterona a un individuo en condiciones de castración, la próstata es capaz de regenerarse a sí mismo a plena capacidad. La testosterona también parece conducir a cáncer de próstata, por lo que la terapia de privación de andrógenos es una estrategia terapéutica utilizada comúnmente. Sin embargo, muchos cánceres de próstata se vuelven resistentes a la privación de andrógenos. Además, los hombres sometidos a terapia de privación de andrógenos para el tratamiento del cáncer de próstata sometidos a ciclos de condiciones castrados y regeneradas. En el ratón, la castración quirúrgica, junto con la regeneración hormonal de la próstata mediante la reintroducción de la testosterona, es una herramienta importante con el que para estudiar la resistencia a la castración y los efectos de la bicicleta testosterona en la próstata.

En este artículo, vamos a discutir y demostrar las técnicas apropiadas por los que pueda LOCATe y micro-diseccionar una próstata de ratón, así como quirúrgicamente castrar a un ratón.

Protocolo

Este protocolo se reúne y sigue las directrices establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins.

1. micro-disección de una próstata de ratón

1. La eutanasia a los ratones por asfixia con dióxido de carbono o un método alternativo autorizado conforme a las directrices para el cuidado y uso de animales institucionales.
2. Pin el ratón en una posición supina a una tabla de disección por poner un pasador a través de cada una de las cuatro patas.
3. Pulverizar el abdomen con 70% de etanol.
4. Mantenga la piel de la parte inferior del abdomen con unas pinzas, y usar las tijeras para cortar a través de la piel y el peritoneo aproximadamente 1 cm por delante del orificio del pene, cuidado de no cortar cualquier órgano.
5. Cortar la piel y el peritoneo de la parte inferior del abdomen, hasta ambos lados del abdomen a la caja torácica, la exposición de la cavidad peritoneal.
6. Identificar la vejiga y el tracto urogenital, y exponerlos moviendo suavemente los órganos de grasa y otros a un lado.
7. Usiunas pinzas de agarre Ng, los conductos deferentes en la base cerca de la uretra, y arrancarla.
8. Repita con el conducto deferente opuestos.
9. Con unas pinzas, agarre cuidadosamente la vejiga y tire hacia arriba, mientras que al mismo tiempo el uso de tijeras para cortar a través de la uretra por debajo de la vejiga y la próstata ventral (aproximadamente 1 cm por debajo de la base de la vejiga).
   Nota: A medida que la vejiga se detuvo, el (la vejiga que contiene, una sección de la uretra, todos los lóbulos de la próstata y las vesículas seminales) todo el tracto urogenital vendrá con él. Puede haber un poco de resistencia.
10. Coloque el tracto urogenital (UGT) en una placa de Petri que contiene 60 a 100 mm aproximadamente 5-10 ml de fosfato salino tamponado (PBS).
11. Realizar la parte restante del protocolo bajo un microscopio de disección. Use dos pinzas finas, una en cada mano. Mantenga la pinza "como un lápiz" y descansar los antebrazos en la mesa de trabajo con el fin de mantener el equilibrio ellos.
12. Utilice unas pinzas finas para posicionar el UGT de tal manera que la vejiga estáen la parte superior, la uretra está apuntando hacia abajo, y las vesículas seminales están colocados a ambos lados de la vejiga.
13. Agarre la uretra con uno fórceps y con cuidado tire de la grasa con los otros fórceps sin que se rompa la basura cualquier tejido de la próstata. Nota: Fat aparecerá relativa "brillante" para el tejido circundante.
14. Una vez que se elimina la grasa, el uso de fórceps para rasgar el tejido conectivo entre los dos lóbulos ventrales de la próstata y separarlos.
15. Para eliminar uno de los lóbulos ventrales, utilice uno de fórceps para agarrar un solo lóbulo ventral cerca de la punta, y el uso de las otras pinzas para agarrar ese lóbulo en la base lo más cercano a la uretra como sea posible. Mientras que aún agarrando la base del lóbulo, utilizar las otras pinzas para agarrar la uretra. Tire del lóbulo lejos de la uretra con un movimiento firme y lisa. Asegúrese de que se mantiene sin tejido de la próstata unido a la uretra. Coloque el lóbulo en el medio apropiado, dependiendo de la siguiente etapa experimental.
    1. Para fijar y parafina incrustar los samplio para el análisis histológico, colocar el lóbulo en 10% de formalina tamponada neutra (NBF) ^8.
    2. Coloque el lóbulo en medio de congelación, tales como PTU, para la crioconservación y el corte ^8.
    3. Coloque el lóbulo en PBS frío para el aislamiento de células individuales para la cultura o citometría de flujo ^9.
16. Repita el paso 1.15 con el otro lóbulo ventral.
17. Para eliminar uno de los lóbulos anteriores, el uso de fórceps para tirar suavemente del lóbulo lejos de la vesícula seminal, teniendo cuidado de no perforar la vesícula seminal. Una vez que el lóbulo es independiente de la vesícula seminal, y eliminar de la misma manera como el lóbulo ventral en el paso 1,15.
18. Repita el paso 1.17 con el otro lóbulo anterior.
19. Da la vuelta al tracto urogenital restante sobre tal que la próstata dorsal es visible.
20. Para eliminar uno de los lóbulos dorsolaterales, el uso de fórceps para rasgar el tejido conectivo entre los dos lóbulos dorsolaterales y también el tejido conectivo entre los lóbulos y tél región posterior de las vesículas seminales. Retire el lóbulo de una manera similar como el lóbulo ventral en el paso 1,15.
21. Repita el paso 1.20 con el otro lóbulo dorsolateral.

2. La castración quirúrgica

Nota: Esta es una cirugía de supervivencia, por lo que la asepsia, anestesia y el tratamiento del dolor son importantes para la realización ética y exitosa de este protocolo. Siga todas las directrices para el cuidado y uso de animales institucionales. Utilice una fuente de calor externa, tal como una manta de agua de recirculación, durante el procedimiento quirúrgico para prevenir la hipotermia. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes de su uso en cirugía.

1. En una superficie limpia y estéril anestesiar al ratón usando las medidas apropiadas (por ejemplo, 2% de isoflurano inhalado) y la posición de la mOuse en una posición supina. Nota: los métodos de anestesia alternativos, como la ketamina, también se pueden utilizar, dependiendo del protocolo de animales aprobado.
2. Comprobar los reflejos del ratón apretando los dedos de los pies. Si el ratón no reacciona, proceder al siguiente paso. Si no reacciona, espere 1-3 minutos, y puedes volver a intentarlo. Afeitar el área quirúrgica con una maquinilla de afeitar eléctrica.
3. Asépticamente preparar el abdomen del ratón usando alternando matorrales de etanol al 70% y el yodo o los procedimientos recomendados por el personal veterinario institucional o IACUC.
4. Con un bisturí estéril practicar una incisión vertical de 1 cm a través de la piel en la línea media del abdomen inferior, de aproximadamente 1,5 cm por delante del pene.
5. Hacer una pequeña incisión (<1 cm) a través del peritoneo, cuidado de no cortar cualquier órgano.
6. El uso de pinzas estériles, agarre el borde del corte del peritoneo y levantarla con cuidado a fin de ser capaz de ver la cavidad peritoneal por debajo.
7. El uso de otro pinzas estériles, meter la mano en THe cavidad peritoneal y el agarre sea la almohadilla de grasa de testículo izquierdo o derecho, lateral a la vejiga. Tire de la almohadilla de grasa a través de la abertura en el peritoneo y la piel hasta que el testículo sale así. Tenga cuidado de no lesionar otros tejidos u órganos durante este paso.
8. Con un marcador de cauterio, cortar a través de la almohadilla de grasa que mantiene los testículos. Cortar lentamente a través de la arteria testicular con el lápiz cauterio Nota: Si la arteria testicular se corta demasiado rápido, puede haber sangrado excesivo y el ratón pueden tener que ser sacrificados.
9. Una vez que se cortan la almohadilla de grasa y la arteria, retire la almohadilla de testículo y grasa.
10. Repita los pasos 2.6-2.9 con el otro testículo. Nota: Un método alternativo para la eliminación de los testículos es para ligar quirúrgicamente la arteria testicular, seguido por el corte del recipiente con unas tijeras.
11. Suturar el peritoneo se cerró con sutura absorbible.
12. Grapa la piel se cerró con grapas para heridas quirúrgicas.
13. Administrar un analgésico para controlar el dolor, y el lugarel ratón en una jaula limpia en una jaula más caliente durante 5-10 minutos. Monitorear el ratón para detectar signos de dolor o sangrado.

Resultados

Todos los seis lóbulos prostáticos fueron retirados de un ratón a través de la próstata micro-disección (Figura 1). El tracto urogenital completa (UGT) se compone de todos los lóbulos de la próstata, la vejiga, vesículas seminales y la uretra (Figura 1a). El conducto deferente se une a la uretra, pero no es necesaria para la próstata micro-disección, y por lo tanto se pueden separar antes de la retirada de la UGT cortando la uretra (Figura 1b-1c). El tracto urogenital se mantendrá juntos una vez retirado del abdomen (Figura 1d). En este punto, la UGT permanece cubierto en el tejido graso, que tiene que ser eliminado para obtener acceso a los lóbulos de la próstata (Figura 1E). Todos los seis lóbulos (ventral, anterior, y pares dorsolateral) se puede ver que rodea la uretra en la base de la vejiga. Tejido de la próstata Pure entonces se puede retirar siguiendo el protocolo anteriormente (Figura 1f). Estos lóbulos puedeser colocado en el medio apropiado para su posterior análisis.

La castración es la extirpación de los testículos, que son las principales productoras de testosterona. La testosterona está presente en el ratón hasta que se produce la castración, en cuyo punto la próstata regresión (Figura 2a). La regeneración hormonal a través de la reintroducción de la testosterona puede seguir la castración (Figura 2b). Se realizó la castración, seguido de dos ciclos de regeneración hormonal, y los niveles de testosterona Se realizó monitoreo de suero de ratón por ELISA (Figura 3). En condiciones de castración, los niveles de testosterona prácticamente desaparecen. Alternativamente, el tamoxifeno (un modulador selectivo del receptor de estrógeno) no muestra diferencias significativas a la condición normal hormonalmente. Después de la castración, la testosterona fue reintroducido al ratón, haciendo que los niveles de testosterona se disparen de manera espectacular (Figura 3). A continuación, micro-disecados la próstata lexperiencias fuera del cuerpo de los ratones y las imágenes impresas como lóbulos anteriores individuales (Figura 4a). También fijado en formalina, incluidas en parafina y se seccionó el tejido. La figura 4b muestra hematoxilina y eosina de tejidos de próstata anterior manchada en condiciones normales, castrados y condiciones regenerados. lóbulos de la próstata castrados se reducen a la aproximación de una décima parte del tamaño de una próstata normal, y que la regeneración hormonal restaura la próstata a su tamaño original.

Figura 1: Bruto Histología del Protocolo de micro-disección de próstata. (A) El tracto urogenital (UGT) en su estado natural, expuesta en el abdomen murino. Las líneas de puntos abarcan las diversas partes de la UGT, incluyendo las vesículas seminales (SV), lóbulos de la próstata (próstata anterior (AP) y la próstata ventral (VP) son visibles aquí), la vejiga (B), y la uretra (que se encuentra estarDebajo del vejiga). El conducto deferente (VD) es también visible. (B) Los conductos deferentes se han eliminado. La flecha indica la región de la que se ha eliminado el conducto deferente. (C) La UGT se ha eliminado del abdomen mediante la reducción de la uretra por debajo de los lóbulos de la próstata ventral. (D) La UGT se ha colocado en PBS y se ve bajo un microscopio de disección. (E) La grasa se ​​ha eliminado de la UGT, lo que permite la visibilidad de los seis lóbulos de la próstata. Las flechas apuntan a los dos lóbulos anteriores, los lóbulos ventrales, y los lóbulos dorsolaterales. (F) Los seis lóbulos prostáticos individuales se han eliminado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Timeline para la castración y hormonal Regeneración. (a) La testosterona está presente en niveles fisiológicos hasta la castración, cuando la testosterona desaparece y la regresión de la próstata comienza. (B) La castración elimina la testosterona, hasta que se vuelve a introducir la testosterona, causando la regeneración hormonal de la próstata. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3:. Los niveles de testosterona en diferentes condiciones hormonales de testosterona ELISA bajo tamoxifeno tratada, hormonalmente normales, castrado, y hormonalmente condiciones regenera. Regenerada x 2 se refiere a la implantación y la eliminación de testosterona sintética, seguido de la implantación de una segunda ronda de testosterona sintética. Las barras de error representan Standesviación típica. Esta cifra se ha modificado desde el ^5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Aspecto de próstata en virtud de la castración y la regeneración de las condiciones (a) Aspecto macroscópico de los lóbulos anterior de la próstata en condiciones castrados, hormonalmente normales, y hormonalmente regeneradas.. Regenerada x 2 se refiere a la implantación y la eliminación de testosterona sintética, seguido de la implantación de una segunda ronda de testosterona sintética. (B) fijados con formalina, lóbulos prostáticos anteriores incluidas en parafina y teñidas con seccionados hematoxilina y eosina. Haga clic aquí para ver una granr Versión de esta figura.

Discusión

Próstata micro-disección permite la experimentación de lóbulos específica y el análisis de la próstata de ratón (Figura 1). En modelos de ratones genéticamente modificados, los fenotipos se pueden observar en un lóbulo que no se ve en otros. Además, para el análisis histológico, este protocolo asegura que la máxima cantidad de tejido de la próstata puro puede ser seccionadas y teñidas, sin otros tejidos del tracto urogenital presentes en la sección. Por último, para los experimentos de una sola célula, este protocolo permite el aislamiento de las células de la próstata casi puros. kits de enriquecimiento de células epiteliales pueden purificar más células de la próstata a partir de células del estroma. Las limitaciones a micro-disección incluyen el uso de un microscopio de disección, y la curva de aprendizaje necesario el uso de unas pinzas finas mientras se mira a través del microscopio de disección. Alternativamente, el tejido prostático puede ser seccionado para histología como parte de la UGT, haciendo micro-disección innecesaria. Sin embargo, la desventaja de seccionar toda la UGT es queotros tejidos estarán presentes en la sección, por lo que es no tan limpio. Además, para la generación de poblaciones de células de próstata individuales, los lóbulos se deben separar de la UGT para evitar la contaminación.

La castración quirúrgica es una cirugía fundamental para muchos laboratorios de investigación de la próstata y es esencial para el estudio de los efectos de la testosterona sobre el desarrollo de la próstata y la enfermedad. Este protocolo es rápido (tiempo típico de la cirugía para un usuario experimentado es de aproximadamente 5 min) y elimina casi 100% de la testosterona de la circulación (Figura 3). Es de destacar que los niveles de testosterona en ratones difieren significativamente, y pueden variar hasta en 30 veces de ratón a ratón ^10. La castración elimina esta variación. Después de la castración, los investigadores pueden decidir añadir testosterona de nuevo a regenerar la próstata (Figuras 3 - 4). Esto se puede hacer por vía subcutánea la implantación de una fuente de testosterona, tal como una bomba osmótica, una testosteronapellet, o un tubo de silastic semi-permeable que contiene testosterona en polvo ^8. Dependiendo de la cantidad de testosterona añadido, este procedimiento puede proporcionar fisiológica a suprafisiológicos los niveles de testosterona en la circulación (Figura 3). Este protocolo también se puede usar para estudiar el linaje de células de próstata y biología de células madre ^11. Otra opción es la castración química, o la terapia de privación de andrógenos, mediante el tratamiento de ratones con compuestos que inhiben la producción de testosterona, tales como dutasterida ^12. Esto también imita un tratamiento común de los pacientes con cáncer de próstata, que rara vez son castrados quirúrgicamente. Sin embargo, la castración quirúrgica proporciona un método fiable y permanente para la eliminación de prácticamente todas testosterona. Es importante tener en cuenta que las glándulas suprarrenales también sintetizan las especies de andrógenos, tales como la androstenediona y dehidroepiandrosterona, que se puede convertir en testosterona, aunque en cantidades mucho más pequeñas, con relación a los testículos^13. En algunos casos, las glándulas suprarrenales también se pueden extirpar quirúrgicamente, aunque este procedimiento es más difícil.

En general, estos dos protocolos son útiles para una gran cantidad de investigación en enfermedades de la próstata, así como los estudios hormonales. Estos protocolos son una forma fiable y consistente para analizar la biología de la próstata en condiciones normales de hormonas, castrado, u hormonal regeneradas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Herramientas quirúrgicas	Roboz	Various
Formaldehyde	Sigma	F8775
OCT medium	VWR	25608-930	Debe colocarse sobre hielo seco para congelar y almacenarse a -80 °C; C
PBS	Life Technologies	10010
Isoflurano	Johns Hopkins		También disponible de proveedores en línea
Pluma de cauterización	Medline ESCT002
Sutura de seda	AD Surgical	M-S330R19
heridas	Roboz	RS-9265