Artículo de método

Preparación de geles de colágeno en 3D y microcanales para el estudio de las interacciones 3D En Vivo

DOI:

10.3791/53989

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9 de mayo de 2016

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1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 4Morgridge Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, 5Paul P. Carbone Comprehensive Cancer center, University of Wisconsin-Madison

En este artículo

Resumen

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El colágeno es un componente central de la ECM, y proporciona indicaciones esenciales para varios procesos celulares que van desde la migración a la diferenciación y la proliferación. Aquí se incluye es un protocolo para la incorporación de las células dentro de los hidrogeles de colágeno en 3D, y una técnica más avanzada para la generación de matrices de colágeno aleatorios o alineados utilizando PDMS microcanales.

Resumen

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Históricamente, la mayoría de los procesos celulares se han estudiado solo en 2 dimensiones. Si bien estos estudios han sido informativos sobre los mecanismos generales de señalización celular, descuidan importantes señales celulares recibidas de las propiedades estructurales y mecánicas del microambiente local y la matriz extracelular (MEC). Para comprender cómo interactúan las células dentro de una MEC fisiológica, es importante estudiarlas en el contexto de ensayos tridimensionales. La migración celular, la diferenciación celular y la proliferación celular son solo algunos de los procesos que se ha demostrado que se ven afectados por cambios locales en las propiedades mecánicas de una ECM tridimensional. El colágeno I, un componente fibrilar central de la MEC, es más que un simple elemento estructural de un tejido. En condiciones normales, las señales mecánicas de la red de colágeno dirigen la morfogénesis y mantienen las estructuras celulares. En los microambientes enfermos, como el microambiente tumoral, la red de colágeno a menudo se remodela drásticamente, lo que demuestra una composición alterada, una deposición mejorada y una organización de fibras alterada. En el cáncer de mama, el grado de alineación de las fibras es importante, ya que un aumento de las fibras alineadas perpendicularmente al límite tumoral se ha correlacionado con un peor pronóstico de la paciente1. Las matrices de colágeno alineadas dan lugar a una mayor diseminación de las células tumorales a través de la migración persistente2,3. El siguiente es un protocolo simple para incrustar células dentro de un hidrogel de colágeno fibrilar tridimensional. Este protocolo es fácilmente adaptable a muchas plataformas, y puede generar de forma reproducible matrices de colágeno alineadas y aleatorias para la investigación de la migración celular, la división celular y otros procesos celulares en un microentorno fisiológico ajustable en 3 dimensiones.

Introducción

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Muchos procesos celulares han sido ampliamente estudiados en 2 dimensiones, formando así un conocimiento colectivo de los mecanismos básicos de señalización celular. Estos estudios, sin embargo, descuidan importantes señales celulares recibidas de las propiedades estructurales y mecánicas del microambiente celular local y la matriz extracelular (MEC). Para comprender mejor cómo interactúan las células dentro de un contexto fisiológico, es importante estudiarlas en ensayos tridimensionales (3D). La MEC para estos ensayos 3D puede ser derivada de células o reconstituida a partir de proteínas purificadas. Independientemente de la fuente de la MEC, los ensayos de matrices 3D han demostrado ser invaluables para comprender cómo las células navegan e interactúan dentro del mundo fisiológico. Por ejemplo, las células cultivadas en matrices 3D muestran distintos modos de locomoción que dependen de la naturaleza mecánica de su ECM circundante que no se observan en los experimentos 2D4-6. Además, las células cultivadas en 3D también tienen menos fibras de estrés y adherencias focales menos pronunciadas que sus contrapartes cultivadas en superficies duras como el vidrio o el plástico7.

Sin embargo, la importancia de los ensayos 3D contextuales no se limita a la migración celular. Algunos otros eventos de señalización celular solo se pueden investigar mediante el uso de ensayos 3D. Durante la diferenciación de tejidos y células, la rigidez del entorno extracelular y la MEC proporcionan señales que pueden influir en los eventos morfogénicos. Por ejemplo, la tubulogénesis epitelial mamaria solo ocurre en matrices 3D de baja rigidez, pero no en matrices rígidas ni en sustratos 2D8,9. Cuando se cultivan dentro de matrices 3D rígidas, estas mismas células epiteliales adquieren un fenotipo aberrante con una mayor proliferación y protuberancias de la membrana celular impulsadas a través de la señalización alterada de FAK y ERK10. Se sabe que muchas otras vías de señalización y procesos celulares se ven afectados de manera similar por la rigidez del entorno celular local, y estas cascadas de señalización resaltan la importancia de investigar los eventos de señalización y el fenotipo celular en el contexto de las propiedades mecánicas locales apropiadas de un ECM 3D.

El colágeno I es una proteína particularmente relevante para su uso en estudios in vitro, ya que es el componente más abundante de la MEC y es responsable de muchas de las propiedades mecánicas del microambiente celular. Si bien originalmente se pensó que era simplemente una proteína estructural, ahora se sabe que su papel es mucho más complejo. La composición, la arquitectura, la orientación, la densidad y la rigidez de las fibras de colágeno proporcionan un entorno concentrado de información de señalización5. Durante la progresión de ciertas enfermedades, como la inflamación crónica y la tumorigénesis, la red de colágeno se remodela drásticamente2,11. Más específicamente en los cánceres de mama, el aumento de la deposición de colágeno y la rigidez del tejido acompañan y probablemente contribuyen a la progresión del tumor. En estos tumores tempranos, la red de colágeno endurecida parece tensa y más alineada, de modo que la mayoría de las fibras encapsulan el tumor en crecimiento2. A medida que el tumor progresa, el colágeno continúa reorganizándose y las regiones de la red fibrilar se orientan perpendicularmente al límite tumoral2,12. La alineación perpendicular sirve como biomarcador pronóstico donde estos pacientes tienen una peor progresión libre de enfermedad y una peor supervivencia general1. Una explicación para esta correlación es que los malos resultados son consecuencia de una mayor diseminación de las células tumorales a través de la migración celular persistente en redes de colágeno alineadas3.

Para comprender cómo las células responden específicamente a la alineación y organización que se observa en la progresión tumoral, es necesario generar matrices de colágeno 3D aleatorias y alineadas para la experimentación. Existen tres metodologías básicas para inducir la alineación dentro de las redes fibrilares. La primera técnica utiliza un dispositivo inductor de tensión en el que el colágeno entre dos puntos se contrae o estira para generar alineación. Las fibras paralelas al eje de fuerza se tensan, mientras que las fibras perpendiculares al eje se comprimen y se doblan. Si bien las técnicas inducidas por deformación suelen ofrecer una excelente alineación, este enfoque requiere equipos voluminosos que no son fácilmente adaptables a muchas plataformas3,13. Alternativamente, se puede crear una tensión inducida por células mediante la colocación de tapones localizados de células que posteriormente se contraen y alinean el colágeno13. Este método tiene el problema de ser variable, ya que muchos parámetros pueden estar sujetos a cambios. El segundo método utiliza perlas magnéticas y un campo magnético durante la polimerización para inducir la alineación del colágeno13,14. Se pueden obtener buenos resultados de este método con equipos poco sofisticados, pero requiere el uso de anticuerpos o algún otro método para magnetizar el polímero. Por lo tanto, puede ser algo costoso de usar, y la rigidez del gel de colágeno se ve potencialmente modificada por el aumento de las conexiones en la red. Además, las perlas magnéticas utilizadas en este proceso suelen ser autofluorescentes, lo que es problemático para los experimentos de imagen. Por último, la alineación puede ser generada por los canales microfluídicos PDMS3,15,16. En este método, la alineación del colágeno se logra mediante el flujo de colágeno polimerizante a través de pequeños canales microfluídicos. Estos canales microfluídicos se pueden fabricar en multitud de diseños, y son fácilmente adaptables a muchas plataformas. Además, son muy económicos ya que se utilizan cantidades muy pequeñas de colágeno y otros reactivos debido a sus diminutos tamaños.

Aquí se proporciona un protocolo simple para incrustar células dentro de un hidrogel de colágeno fibrilar tridimensional. Además, también se proporciona una técnica más avanzada, en la que se utilizan canales microfluídicos PDMS para controlar la organización y alineación de la matriz de colágeno. Este protocolo es fácilmente adaptable a muchas plataformas, y puede generar de forma reproducible matrices de colágeno alineadas y aleatorias para la investigación de la migración celular, la división celular y otros procesos celulares en un microentorno fisiológico tridimensional.

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Protocolo

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1. Neutralización, dilución y polimerización de colágeno Soluciones para la Investigación en 3D y celulares de contracción Ensayos

  1. En el hielo en la campana de cultivo de tejido estéril, neutralizar colágeno (1: 1) con HEPES estéril, enfriada con hielo 100 mM en 2x PBS, pH 7,4, en un tubo cónico de 15 ml. Mezclar bien con la pipeta de plástico hasta que la solución es homogénea y remolinos de mezcla ya no son visibles. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire durante el proceso de mezcla. Almacenar brevemente sobre hielo.
  2. Diluir colágeno neutralizado a la concentración adecuada con los medios de comunicación celular (tal como RPMI, DMEM, etc.).
    1. Para calcular la cantidad de colágeno neutralizado requerida para compensar la concentración de colágeno lo desea, utilice la ecuación N = (D * V) / (S / 2), donde N es la cantidad de colágeno neutralizado requerida, d es la concentración de colágeno deseada, V es el volumen final de la concentración de colágeno se desea, y S es tque a partir concentración de reserva de colágeno.
    2. Llevar hasta la cantidad de colágeno neutralizado al volumen mediante la adición de una solución de células y medio celular. Mezclar bien y guardar en hielo hasta que esté listo para lanzar.
      1. Ejemplo: Para un gel 2 mg / ml en un volumen de gel de 1 ml (volumen típica para un molde de gel en 6 placa de pocillos o mm de vidrio 50 plato inferior), se multiplica primero la concentración deseada (2 mg / ml) por el volumen final deseado (1 ml). Tome este número (2 mg) y se divide por la mitad de la concentración de reserva que aparece en la botella (9,49 mg / ml). En este caso, se diluyen 0,42 ml de colágeno se neutraliza con 0,58 ml de mezcla / célula medios de comunicación.
  3. Pipetear la mezcla enfriada con hielo de colágeno / célula / soporte en cualquiera de una cultura no-tejido tratado placa de 6 pocillos o un plato de cristal inferior a 50 mm. Utilice punta de la pipeta para repartir uniformemente la solución.
    NOTA: Es importante usar una cultura no-tejido placa tratada para minimizar la unión o el crecimiento de las células fuera del collagen gel.
  4. Permitir para polimerizar a temperatura ambiente durante aproximadamente 10-15 min. Los geles deben girar opaco en la polimerización.
  5. Después de que se ha vuelto opaco, mover plato o una bandeja a 37ºC durante otros 45 - 60 minutos para terminar la polimerización.
  6. Después de 45 - 60 minutos, añadir 2 - 3 ml de medio y suelte la gelatina de los lados del pozo mediante la ejecución de una punta de pipeta de p200 alrededor del perímetro del pozo o plato. plato girar suavemente para liberar el gel. El gel de colágeno debe estar flotando en los medios de comunicación.

2. Transferencia Western, la célula de la morfogénesis y Gel Gontractility Ensayo

  1. Para evaluar los niveles de proteína, la morfología o la contractilidad celular en relación con ECM rigidez, comenzar mediante el vertido de geles de colágeno, de acuerdo con 1.1 a 1.6, se sembró con células de un 7 - ensayo de 10 días. Determina cada dosis de siembra línea celular empíricamente en función de la tasa de crecimiento y la confluencia. Para un ensayo de 10 días, la densidad de siembra puede variar de 20.000 - 100.000 células / gel.
  2. Para medirla contractilidad celular, medir el diámetro gel mediante el uso de una regla o una cámara cada 24 horas o en el intervalo de tiempo apropiado.
    Nota: Además, correspondientes imágenes recogidas a partir de un microscopio se pueden examinar para las características morfológicas características de la línea celular se sembró en el gel, tales como estructuras acinos-como, túbulos epiteliales, protuberancias celulares, y lameliapodia.
  3. Para evaluar los niveles de proteína, la lisis de los geles en tampón RIPA y el proceso para el análisis de transferencia Western de proteínas de interés como se describe en Wozniak et al. 17 y Gallagher et al. 18.
    1. IMPORTANTE: En las comparaciones de la contractilidad entre las líneas celulares, normalizar la contractilidad de ADN total, que se puede extraer de los geles como se indica por Lui, et al 19, o para un inmutables, proteína de limpieza (histonas, GAPDH, etc.) a través de Western. El análisis de transferencia, como se describe en Wozniak et al. 17 y Gallagher et al. 18. Si las células contando dentro del gel utilizando un hemocitómetro, asegúrese de normalizar el número de células de la superficie total de gel como el gel de contratación se concentrará células.
  4. geles de alimentación cada 3 - 4 días mediante la eliminación de 1 ml de medio y reemplazándolo con 1 ml de medio fresco. Asegúrese de alimentar geles después de la medición se toma como la adición de medios / suero fresco causará un aumento en la contractilidad.

3. Generación de PDMS microcanales para la alineación de fibra de colágeno

Nota: Para generar matrices de colágeno alineadas, un molde de PDMS microcanales (Figura 2A) requiere un maestro de silicio SU-8 realizado a través de la litografía blanda-15.

  1. Para hacer que los canales de PDMS, la mezcla de PDMS a fondo en un vaso desechable con un palito de madera. Para un maestro de silicona 6 pulgadas, mezclar 20 g de base de elastómero con 2 g de agente de curado.
  2. De-gas la mezcla de PDMS colocando el vaso desechable en una cámara de vacío bajo una presión de vacío de550 mm Hg. De-gas por 1 - 1,5 horas.
  3. Mientras que la desgasificación del PDMS, preparar el maestro de silicona para el vertido. Preparar colocando una hoja de película de transparencia sobre una placa caliente seguido por el maestro de silicona. Asegúrese de que el molde de microcanales hacia arriba.
    NOTA: durante la colada PDMS y curado, se intercala el maestro de silicona entre dos hojas de película de transparencia.
  4. Después de 1 - 1,5 horas, retire el PDMS desgasificado de la cámara de vacío, y poco a poco se vierte sobre el maestro de silicona.
    IMPORTANTE: Evitar las burbujas de aire. Siga vertiendo en el centro de la maestra, y permitir que la gravedad distribuirla uniformemente.
    NOTA: La caída de PDMS no necesita extenderse todo el camino hasta el borde de la maestra.
  5. Después de PDMS se ha vertido en el maestro, aplicar una segunda lámina de película de transparencia en la parte superior del maestro de silicona y PDMS. Con cuidado, gire la segunda hoja de transparencia hacia abajo en la parte superior del maestro PDMS / silicona para evitar burbujas de aire. No se apresure. PDMS deben ahora uniformemente distribuidas oamo ver.
  6. Con cuidado, coloque una hoja de goma en la parte superior de la transparencia, seguido de una "hoja de acrílico 1/8.
  7. Añadir tres 10 libras pesas en la parte superior de la hoja de acrílico. Inicialmente, los pesos se "flotar". Deje que se asientan y se estabilicen antes de seguir adelante.
  8. Establecer temperatura de la placa a 70 C y curado PDMS durante 4 horas. Deje que se enfríe por un mínimo de 1 hora adicional antes de molestar.
  9. Retire con cuidado la hoja superior de película de transparencia de la oblea, y quitar los canales con una pinza.
  10. Almacenar en el plato libre de polvo hasta que esté listo para su uso.

4. Preparar PDMS microcanales de uso

  1. Coloque los canales boca abajo sobre nueva, limpia película de transparencia. Limpiar todos los puertos (Figura 2b) usando un movimiento circular con unas pinzas cortantes. Retire cualquier fragmento de PDMS.
  2. canales limpios mediante el uso de un pedazo de cinta de embalaje como un trapo pegajoso. Aplique cinta a la superficie del banco (parte adhesiva hacia arriba), y luego ajuste el canal on superior. Presione hacia abajo en los canales con extremo redondo del fórceps para asegurar un buen contacto. Retire y repetir en ambos lados hasta que se elimina la suciedad visible.
  3. Transferencia de limpiado, preparada canales de PDMS en una cónica 50 ml con 70% EtOH. Vortex a velocidad máxima durante 30 segundos. Desechar EtOH y reemplazar con fresco EtOH al 70%. Almacenar en EtOH al 70% hasta que esté listo para su uso.
  4. En campana de cultivo de tejidos y el uso de técnicas asépticas, transferir los canales de PDMS a una cubierta de vidrio limpio y estéril o vidrio platos de fondo. Ponga el canal lateral y UV tratamiento hasta que se haya evaporado EtOH.
  5. Una vez seco, voltear el PDMS por lo que los canales estén mirando hacia abajo hacia el cubreobjetos. Pulse el canal de PDMS abajo en el cristal para hacer un buen sello. Añadir un parche de PDMS estériles para cubrir / cerrar el puerto central (puerto B, Figura 2b). Deje que se seque completamente antes de continuar.
  6. Pre-recubrir el interior de la canal con colágeno / ml 10 g de agua estéril. Para recubrir, colocar una gota de 100 l en la parte superior de un channel, y dibujar a través de vacío. Después de 1 hora a 37 ° C, los canales de transferencia llenos de solución de recubrimiento de colágeno a un refrigerador. Enfriar durante aproximadamente 15 - 30 min.
  7. Retire la solución de revestimiento de colágeno con un aspirador o una pipeta, y comenzar la preparación de colágeno.

5. Preparación de colágeno para uso en microcanales

  1. En el hielo, neutralizar colágeno (1: 1) con HEPES enfriada con hielo 100 mM en 2x PBS, pH 7,4. Mezclar bien hasta que sea homogénea (Para más detalles, véase la sección 1.1).
  2. Diluir colágeno neutralizado a las concentraciones apropiadas con los medios de comunicación celular (Para más detalles, véase la sección 1.2). Incubar durante 15 minutos en hielo.
  3. Al mismo tiempo, el enfriamiento canales en hielo montado.
    NOTA: El objetivo es tener todos los componentes para el proceso de canal a 4 ° C o por debajo. El colágeno temperatura de nucleación y el tiempo son parámetros clave para el proceso de polimerización, y pueden ser el punto de partida para una mayor optimización, si es necesario.
  4. Councélulas T con un hemacitómetro y resuspender en la densidad de siembra apropiada en este momento. Para facilidad de cálculos, resuspender a 1 - 3 millones de células / ml. (Para más detalles, véase también la sección 2.1).
  5. Una vez que las células han sido contados y 15 minutos han pasado, continúe con el colágeno vertido.

6. Verter alineados y microcanales aleatoria de colágeno

  1. Antes de elaborar colágeno a través de canales, ajustar y fijar la presión de vacío con un regulador de vacío en línea. La presión de vacío proporciona la fuerza para inducir y controlar la velocidad de flujo de colágeno, que determina el grado de alineación.
    1. Para matrices aleatorias o no alineados, utilizar una amplia canal (3 mm de ancho x 200 m de altura) con una presión de vacío de 10 mm Hg o menos.
    2. Para matrices alineadas, utilice estrecho canal (1 mm de ancho x 200 m de altura) con una presión de vacío de 60 mm Hg o mayor.
  2. Retire canal montada de hielo y colocar sobre la superficie limpia y desinfectada de flujo laminar hud.
  3. Trabajar de forma rápida y cargar 120 - 150 l de colágeno neutralizado en el puerto A (Figura 2b).
  4. Dibuje colágeno a través del canal mediante la colocación de una pipeta de 25 ml unido a la línea de vacío a través del puerto c (Figura 2b). Dibuje colágeno a través de un solo movimiento, uniforme. IMPORTANTE: Para matrices aleatorias o no alineados, dibujar colágeno lentamente a través del canal (aproximadamente 0,5 - 1 mm por segundo), y parar una vez que llegue al final. Para matrices alineados, dibujar el colágeno a través de más rápidamente, pero tenga cuidado para evitar burbujas de aire.
  5. Eliminar cuidadosamente el exceso de colágeno de la región con el puerto Pipetman p200 o aspirador.
  6. Colocar parches PDMS estériles sobre ambos puertos A y C. Todos los puertos ahora deben ser cubiertos.
  7. Después de 2 - 3 minutos, retirar de muestra central PDMS (puerto B) y añadir 2 - 3 l de células (5 - de 10 mil células) en el puerto central. Deje que se polimeriza parcialmente (a su vez opaco) a temperatura ambiente durante otros 10 - 15 min.
  8. después de 10- 15 min, la transferencia a 37 ° C durante otros 15 - 30 minutos para terminar la polimerización. Retire las cubiertas de PDMS y añadir medios para cubrir completamente las células de canal y de cultivo, según sea necesario. Las células pueden ser alimentados mediante la eliminación de un ml de los viejos medios, y su sustitución por un ml de los nuevos medios.

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Resultados

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Mientras que los ensayos en 3D se pueden hacer dentro de la misma rigidez del gel de colágeno, la variación de la rigidez del gel se puede utilizar para determinar cómo las células responden a los cambios mecánicos en su microambiente celular. Un hidrogel de colágeno rígido se define como un gel, donde las células embebidas no son capaces de contraerse localmente el colágeno circundante. La contractilidad intrínseca de diferentes tipos de células es único, y por lo tanto es mejor empezar...

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Discusión

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geles de colágeno en 3D son una valiosa adición a nuestra caja de herramientas para comprender cómo interpretan las células y responder a su microambiente local. Este manuscrito ha proporcionado un protocolo muy básico para incrustar las células dentro de una matriz de colágeno 3D, y para generar de forma reproducible matrices con las fibras de colágeno al azar o alineados. Ambos protocolos se plataformas como adaptables en diferentes isoformas de colágeno, agentes de reticulación, u otras proteínas de la matriz potenci...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar

Agradecimientos

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Los autores desean reconocer los números de subvención UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24 y T32-GM008692-18 para financiar este trabajo. También reconocemos Jeremy Bredfelt y Liu Yuming de loci para el desarrollo y la asistencia con el análisis CT-FIRE.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Colágeno de cola de rata de alta concentración Corning354249
SylGard184 kit de elastómeroCorningNC9285739para canales PDMS
HEPESFisherBP310para tampón de neutralización HEPES
KCl FisherBP366Para tampón de neutralización HEPES
KH2PO4FisherBP362Para tampón de neutralización HEPES
Na2HPO4FisherS374Para tampón de neutralización HEPES
NaClFisherBP358Para tampón de neutralización HEPES
Levy Hemacitómetro Neubauermejorado Fisher15170-208 recuento decélulas
placa de cultivo sin tejido de 6 pocillos Plato con fondo de vidrio Corning351146
50 mmMatTekP50g-1.5-30-f
Bel-Art Desecador de vacío de plásticoBel-ArtF4200-2021Cámara de desgasificación para
película de transparencia PDMS 3Mpp2950Película de plástico para verter canales pdms
ThermoScientific CimaRecThermoScientific HP141925Placa calefactora para el curado de microcanales PDMS
Regulador de vacío PrecisionMedicalPM3100Regulador de vacío para microcanales de colágeno
Lámina de caucho de 8" x 8"Amazon - Silicona Rubber-Cal- Lámina de caucho 60Apara verter Microcanal PDMS
Lámina acrílica de 8" x 8" x 0.125"Láminas de plexiglásAmazonpara verter microcanales PDMS
Pesos de 10 lbBarra AmazonCAPpara verter microcanales PDMS
15 ml Tubos cónicosFisher352097
50 ml Tubos cónicosFisher352098
Pipetas de plásticoDot Scientific229202B, 229206B y 667225B2  ml, 5 y nbsp; ml, y 25  ml
70% EtOHFisherNC9663244

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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