Abstract
В процессе разработки новых вазоактивных препаратов, артериальная мониторинг артериального давления имеет решающее значение для оценки эффективности предлагаемых новых лекарственных средств. Действительно, исследование сосредоточив внимание на открытие новых потенциальных терапевтических мишеней с использованием генетически измененных мышей, требует надежной, долгосрочной оценки системного изменения артериального давления. В настоящее время золотым стандартом для получения долгосрочных измерения артериального давления в амбулаторных мышей использует имплантируемые радио-передатчики, которые требуют катетеризацию артерии. Этот метод избавляет от необходимости привязывать, сдерживая или обезболивающее животных, которые вводят стресс и артефакты во время выборки данных. Тем не менее, артериальный мониторинг артериального давления у мышей через катетеризацией может быть довольно сложной задачей из-за малого размера артерий. Здесь мы представляем руководство шаг за шагом, чтобы проиллюстрировать важнейшие ключевые проходы для успешной подкожной имплантации радиопередатчиков и сонной артерии Cкольчатость у мышей. Мы также включаем примеры долгосрочной деятельности артериального давления, взятых из свободно движущихся мышей после периода восстановления после операции. После этой процедуры позволит надежные записи прямого кровяного давления из одновременно нескольких животных.
Introduction
Гипертония является одним из основных факторов риска развития сердечно - сосудистых заболеваний, возможно , это является одной из основных проблем общественного здравоохранения как в развитых , так и развивающихся странах 1. Существует несколько моделей на животных экспериментальной гипертензией, были разработаны , чтобы имитировать гипертензивные реакции , как те , наблюдается у людей 2. Среди прочего, амбулаторная мышь представляет собой отличную модель для изучения генезиса и прогрессирования артериальной гипертензии , позволяющий в естественных условиях анализа последствий хронического воздействия гипертонии.
Артериальное давление (АД) мониторинг у мышей помогло исследователей распутать несколько механизмов , участвующих в физиологии и патофизиологии заболеваний , таких как гипертония и сердечная недостаточность 3, 4. Действительно, манипулирование мышиного генома позволила поколение трансгенных или моделей ген-направленных подходящей для изучения гипертонии 5, 6. Тем не менее, даже нежные манипуляцииосознанного мышей индуцирует волнениями , которые потенциально могут ввести артефакты во время сбора данных, в то время как использование седативных препаратов или транквилизаторов сильно влияют на кровяное давление 7. Эти аспекты являются особенно важными и должны быть приняты во внимание при попытке долгосрочного мониторинга АД.
Есть несколько способов для записи BP у мышей, и сравнение наиболее распространенных методов , доступных в настоящее время обсуждается в другом месте 8, 9. Тем не менее, рекомендации AHA для измерения артериального давления к выводу , что внутриартериальное измерение АД обычно являются предпочтительными из - за их способности непосредственно измерить АД в течение длительного периода времени 10. Радио-телеметрия в сочетании с прямым измерением артериального давления является метод внедренный для мониторинга физиологических функций в сознании и свободно движущихся лабораторных животных при минимизации стресса и экологически связанных артефактов 9, 11.Радио-телеметрия предлагает возможность автоматического сбора артериального давления, частоты сердечных сокращений, температуры тела и активности животных из нескольких сознательных животных.
Хотя эта методика становится очень популярным во многих лабораториях, радио-телеметрической имплантации у мышей может быть технически сложной задачей. Здесь мы покажем протокол шаг за шагом, который показывает, как имплантировать датчик давления у мышей. Методика включает подкожное введение зонда в корпусе мыши, канал катетера до шеи и вперед вблизи дуги аорты, через левую сонную артерию. Удаленно захваченные данные показаны в прямом эфире на мониторе компьютера. Данные также сохраняются для анализа "офф-лайн".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этика заявление: Все процедуры на животных, упомянутые в этом видео-статьи были рассмотрены и утверждены по уходу и использованию комитета животных (IACUC) в Университете штата Теннесси Научного центра здоровья с помощью.
Примечание: Используйте стерильные микрохирургические инструменты по всей хирургической процедуры. Хирургические инструменты могут быть стерилизованы с использованием инфракрасного стерилизатора при оптимальной температуре стерилизацию 1500 ° F (815,6 ° C). Дальномеры могут быть повторно использованы, однако, прежде чем вставить его в животное убедитесь, чтобы стерилизовать весь передатчик в соответствии с инструкциями производителя и, что кончик катетера был пополнен специальным гелем, предоставленного производителем.
1. Экспериментальные животные
- Получить одобрение IACUC для всех экспериментов, которые будут выполнены. Консультации с институциональными IACUC настоятельно рекомендуется в отношении требований, предъявляемых к послеоперационным анальгетиков после этой процедуры.
- Держите животных в Climate контролируемые комнаты, имеющие температуру окружающей среды 21 ° С, относительной влажности 60%, и 12-часовом цикле свет-темнота со свободным доступом к пище и воде.
Примечание: Поскольку тело мышь для размещения телеметрического зонда (аппроксимативно 1 см диаметр х 2 см в длину), то предпочтительно использовать мышей весом 20 г или более.
2. Анестезия и оперативной подготовки
- Взвесьте мышь, используя точный масштаб и записать его вес. Убедитесь в том, чтобы обращаться с животным мягко и тихо.
- Поместите животное в индукционную камеру и закрыть его. Установить расход кислорода на уровне 0,5 л / мин и установить изофлуран концентрации в 4 - 5%.
- Когда мышь теряет сознание, поместить его на согревающего тело пластины поддерживается на уровне 36 - 37 ° C. Поддержание анестезии через головная часть с множеством изофлурановым на 2% (держать расход в 0,5 л / мин).
- Готовят Операцию регионов путем удаления волос из задней части шеи и тон вентральной шеи путем применения крема для удаления волос.
- Лечить сайт надреза с 3-мя приложениями хирургического скраб (бетадин раствор) чередуются с 70% изопропилового спирта.
3. хирургия
- Поместите мышь в положении лежа на спине. Проверьте наличие рефлексов, зажимая ногу, и регулировать обезболивание до тех пор, пока нет ответа. Сделать приблизительно 1 см срединный разрез ниже горлышка мыши с скальпелем. В левой части разреза создают подкожное пространство, тщательно отделяя кожу от подлежащей соединительной ткани.
- Переверните мышь, и использовать скальпель, чтобы сделать кожу надрез приблизительно 1,5 см в спинном левой стороне позади лопаткой. Создание подкожный карман вдоль фланг животного, достаточно большой, чтобы приспособить устройство. Вставьте передатчик в карман.
- Вставьте небольшую кровоостанавливающего зажима в заднем надрез и маневрировать подкожно по направлению к переднейшея открытие. Используя зажим вставляется-кровоостанавливающего, осторожно схватить нетоксичного полиэтилена трубку (4 см длина х 1 мм ID).
- Потяните кровоостанавливающего обратно через туннель из боковой разрез на спине, пока трубка не будет выступать как от брюшной и спинной разрез, выпустите трубку из кровоостанавливающего. От задней части, вставьте датчик катетера в трубку, чтобы туннель кончик чувствительного давления катетера через шейку. Из передней поверхности шеи, потяните и снимите полиэтиленовую трубку и закройте спинной разрез с помощью металлических хомутов.
- Осторожно отделить нижнечелюстной железы с помощью стерильного ватного наконечника аппликаторов и спрячьте левую нижнечелюстной железы с помощью эластичного пребывания крюк. Используя остроконечный изогнутых щипцов, местонахождение сонной артерии вдоль левой части трахеи. Держите хирургический стерильный сайт путем размещения и закрепления стерильную драпировку.
- Тщательно изолировать сосуд от окружающей ткани и аккуратно отделитьблуждающий нерв (беловатые), который находится вдоль сонной артерии от артерии. Будьте осторожны, чтобы не порезать или повредить нерв или артерию.
- Проходят три части нерассасывающегося 7-0 швом под разделом изолированной сонной артерии. Свяжите черепной шов, чтобы закрыть поток крови. Потянуть шов, который находится ближе всего к грудине временно закупорить кровоток от аорты.
- Сделать свободный узел, используя средний шов. Это будет использоваться для фиксации катетера в сосуде. Вырезать небольшой разрез в артерии между черепной и грудины швами с помощью микро-ножниц.
- Возьмите катетер со специальными катетеризация сосуда щипцами, стараясь не выдавить катетер, чтобы предотвратить потерю геля от зонда. Осторожно, возьмите артерия с тонкой кончик пинцетом изогнутыми щипцами, извлечь катетер, и вставить его в сосуд через небольшой разрез.
- Затянуть средний узел шовного вокруг артерии и осторожно продвигаться вперед кошкуheter. Стравить шов, который проксимально по отношению к грудине и продолжают продвигать катетер к поперечной аорты.
- Обратите внимание на метку на катетере, который дает приближенное показатель того, насколько катетер должен быть вставлен. После того, как точка будет достигнута, аккуратно затянуть как нижний и верхний шов вокруг катетера. Катетер прикрепляется к сонной артерии с помощью шовных узлов.
- Закройте разрез кожи с нерассасывающегося 5-0 швом. После того, как закрытое, запечатать разрез с тканевым клеем.
4. Хирургические восстановления и BP Измерения
- Монитор животных близко для возвращения нормальных позы и поведения. В течение 24 ч после операции период администрировать обезболивание по указанию ветеринара персонала.
- После того, как животные выздоровели (5 - 7 дней после операции), их размещение по отдельности в обычной клетке мыши, размещенной на верхней части телеметрический приемник пластины.
- Включите имплантированный трansmitters "на" и "выключено" с помощью магнитного устройства на короткое время расположены близко к животному с внешней стороны клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Данные могут быть получены удаленно посредством приемника; следы визуализируются на экране компьютера для контроля качества (Рисунок 1a). Детали , такие как животное ID, диастолического артериального давления и систолического артериального давления также показаны (рис 1b). Артериальное ВР может непрерывно (24/7) , записанные или для коротких запрограммированных интервалов (то есть, 60 сек приобретение каждый час). Данные могут быть автоматически сохранены на жестком диске для последующего анализа. Усредненные данные BP от 3-дневной непрерывной записи приведены в (Рисунок 2), можно оценить циркадный ритм различия между темными и светлыми цикла. Среднее значение изменения давления и частоты сердечных сокращений были рассчитаны и в зависимости от времени.
Рисунок 1. Типичные Прориси артериального давления 4 различных мышей с имплантированными телеметрической устройством. (A) Прориси показывающие в реальном времени изменения артериального давления (мм рт.ст.) по сравнению с интервалом в 5 мин. Данные приобретаются одновременно из четырех различных взрослых мышей через 5 дней после имплантации. (B) Трассировка на более высоком временном разрешении , извлеченной из A, можно оценить диастолическое артериальное давление и систолическое значения, продолжительность цикла АД и частоту сердечных сокращений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Долгосрочный артериального давления показывает циркадного ритма вариации. Усредненные данные давления , иллюстрирующих значения (A) систолическое давление (SP), (B) диастолического давления (DP), (C) среднее артериальное давление (MAP), и (D) сердце рат.е выражается в уд / мин. Данные были извлечены из непрерывных записей, принятых в течение дня (световой цикл, L) или ночью (темный цикл, D). Запись началась через 7 дней после операции. Все данные представлены в виде среднего значения ± SEM (n = 4 мышей). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Имплантируемые радио-телеметрической значительно улучшилось за последнее десятилетие; меньший размер зонда делает имплантат менее травматично для животного, длительное время работы от батарей позволяет снизить затраты, а также независимые частоты телеметрических устранения перекрестных помех между приемниками. Телеметрия считается метод внедренный для сбора широкий спектр физиологических параметров свободно движущихся животных без артефактов , связанных с применением ограничений, человеческого взаимодействия, или анестезии, которые требуются другими методами 8,9.
Тем не менее, некоторые из недостатков его техники связаны с начальными затратами прибора и программного обеспечения. Датчики являются хрупкими и подвержены повреждениям, а аккумулятор в конечном итоге делает разрядится, и их необходимо заменить. Несмотря на то, что компания предлагает переоборудовать эти поврежденные зонды по более низкой стоимости, стоимость может быть еще непомерно высокой для некоторых лабораторий.Кроме того, эта процедура может быть технически сложной и практика требуется для достижения надежного измерения АД. И, наконец, есть некоторая послеоперационной связанная с ними смертность, которая в наших руках составляет около 5%. Это может значительно увеличить, если специфическое лечение должно быть проверено, или если генетические манипуляции ставит под угрозу здоровье мыши.
Следующие важные факторы имеют важное значение для успешного выполнения процедуры: поддержания гидратации ткани стерильным физиологическим раствором в течение всей процедуры. Всегда обрабатывать передатчик с большой осторожностью; не держать его датчиком давления, так как это может привести к гелю просочиться или повредить передатчик. При установке катетера, связать центральный шов с двойным узлом, так как неспособность сделать это приведет к катетеру, покидающего сосуд. Требуемую длину катетера, который должен быть вставлен в сонную артерию может меняться в зависимости от штамма мыши и весовой коэффициент, используемый в этом particuлар исследование. Поэтому, настоятельно рекомендуется выполнить некоторый предварительный эксперимент, чтобы определить, насколько глубоко катетер должен быть вставлен, чтобы избежать закупорки аорты. И, наконец, контролировать животное ежедневно, и убедитесь, что кожа над излучателем не растягивается или некротической. Если происходит некроз распространяется или инфекция, эвтаназии животных в соответствии с институциональной политикой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal anesthesia system | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | low-flow small animal anesthesia system | |
| Pad warmer and mouse termometer | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | allows monitoring body temperature, and homeothermic control in small animals | |
| Binocular Microscope | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | KSCXTS-1121 | binocular body with boom stand pole and top LED |
| Hemostat Forceps | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750451 | used to clamp blood vessels or tag sutures |
| Small metal Clips, 7 mm, Stainless Steel | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750344 | used for skin closure |
| Betadine solution | Purdue Products L.P., Stamford, CT, USA | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
| Normal saline solution | Abott Laboratories | 04930-04-10 | needed for preventing tissue from drying. |
| Nair (Hair remover lotion) | needed for fur removal from the site of incision/surgery | ||
| Braide silk suture | Teleflex Medical OEM, Coventry, Connecticut, USA | Size 5.0, 6.0, 7.0 | |
| Ethanol | 2716 | 70% ethanol for disinfection | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
| Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
| Scalpel blade | 2976-0 | No. 10 | |
| Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
| Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
| Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
| Fine needle nose Forceps | Fine Science Tool | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Melville, New York, USA | a general inhalation anesthetic agent | |
| Sterilizer | Benchmark Scientific, 116 Corporate Blvd, South Plainfield, NJ, USA | B1000 | sterilize surgical tools in 5-10 seconds using infrared heating |
| Gauze Pads | Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA | JJ8513 | to use for wound cleaning, prepping, scrubbing or dressing |
| Telemetry Device | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | DSI-PA-C10 | to record blood pressure in freely moving mice |
| Telemetry receiver system coumpled with a PC | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | ||
| Tubing | Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA USA | BTPE-90 | |
| Vessel Cannulation Forceps, 13 cm, 0.5 mm OD | World Precision Instruments | 503374 | special vessel cannulation forceps |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, St. Paul, MN, USA | NAC No.: 11380041 | use to close minor wounds, often eliminating the need for sutures and/or bandages |
| Weighing scale | BB300 | precision analytical laboratory balance |
References
- Danaei, G., et al. The preventable causes of death in the United States: comparative risk assessment of dietary, lifestyle, and metabolic risk factors. PLoS Med. 6 (4), e1000058 (2009).
- Dornas, W. C., Silva, M. E. Animal models for the study of arterial hypertension. J Biosci. 36 (4), 731-737 (2011).
- Henze, M., et al. Persistent alterations in heart rate variability, baroreflex sensitivity, and anxiety-like behaviors during development of heart failure in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 295 (1), H29-H38 (2008).
- Hoffmann, D. S., et al. Chronic tempol prevents hypertension, proteinuria, and poor feto-placental outcomes in BPH/5 mouse model of preeclampsia. Hypertension. 51 (4), 1058-1065 (2008).
- Lerman, L. O., Chade, A. R., Sica, V., Napoli, C. Animal models of hypertension: an overview. J Lab Clin Med. 146 (3), 160-173 (2005).
- Johns, C., Gavras, I., Handy, D. E., Salomao, A., Gavras, H.
- Vatner, S. F., Braunwald, E. Cardiovascular control mechanisms in the conscious state. N Engl J Med. 293 (19), 970-976 (1975).
- Zhao, X., et al.
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Kurtz, T. W., et al. Recommendations for blood pressure measurement in humans and experimental animals. Part 2: Blood pressure measurement in experimental animals: a statement for professionals from the subcommittee of professional and public education of the American Heart Association council on high blood pressure research. Hypertension. 45 (2), 299-310 (2005).
- Kurtz, T. W., et al. Recommendations for blood pressure measurement in animals: summary of an AHA scientific statement from the Council on High Blood Pressure Research, Professional and Public Education Subcommittee. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (3), 478-479 (2005).
