Este protocolo describe un método para la transfección eficiente siRNA en recién aisladas citotrofoblastos vellosos humanos usando formación de microporos y la identificación de complejos de ADN-proteína en estas células. Las células transfectadas pueden ser monitoreados por Western blot y análisis EMSA durante el tiempo de cultivo de 4 días.
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Artículo de método
Los análisis de siRNA transfección y EMSA en recién aisladas vellosos citotrofoblastos Humanos
En este artículo
Resumen
Resumen
Los citotrofoblastos vellositos primarios humanos son una fuente muy útil de células primarias para estudiar las funciones placentarias y los mecanismos reguladores, y para comprender las enfermedades relacionadas con el embarazo. En este protocolo, los citotrofoblastos vellosidos primarios humanos recién aislados de placentas a través de un protocolo estándar de DNasa/tripsina se microporan con ARN interferente pequeño (siRNA). Este enfoque proporcionó una mayor eficiencia para la transfección de siRNA en comparación con un método basado en lipofección. Las células transfectadas pueden analizarse posteriormente mediante Western blot estándar en un plazo de 3 a 4 días después de la transfección. Además, utilizando citotrofoblastos vellosíticos primarios cultivados, se optimizó el análisis del ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) y se realizó en extractos de los días 1 a 4. El uso de estas células primarias cultivadas y el protocolo descrito permiten evaluar la implicación de genes específicos y factores de transcripción en el proceso de diferenciación de citotrofoblastos vellosos en una capa celular similar a la de sincitiotropoblas. Sin embargo, el tiempo limitado permitido en el cultivo impide el uso de métodos que requieren más tiempo, como la generación de una población celular estable. Por lo tanto, las pruebas de esta población celular requieren protocolos de transferencia de genes altamente optimizados.
Introducción
La disfunción placentaria humana se asocia con el desarrollo de varias enfermedades asociadas al embarazo, como la preeclampsia y la restricción del crecimiento intrauterino 1. Un componente celular importante de la placenta son los trofoblastos, que se pueden clasificar como citotrofoblastos extravellosos o vellosos. Tras la fusión, los citotrofoblastos vellosos se diferencian aún más en la capa de sincitiotrofoblastos, una estructura celular multinuclear con un papel importante en el intercambio feto-materno y la producción de hormonas 2. Los citotrofoblastos vellosíticos primarios humanos y sus homólogos diferenciados representan muestras biol....
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Protocolo
El comité de ética de la UQAM ha aprobado estos protocolos, que están en conformidad con las directrices del Comité de Ética del Hospital de St-Luc del Centro Hospitalario Universitario de Montreal (Montreal, Canadá). Los participantes firmaron un consentimiento informado.
1. Medio Preparación y aislamiento de citotrofoblastos primarios vellosos
- Preparar medio de cultivo para citotrofoblastos vellosos primarios humanos complementando medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) con HEPES 25 mM, 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina. Se filtra el medio preparado a través de filtro de 0,22 micras estéril y guardar en....
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Resultados
placentas frescos de embarazos a término fueron utilizados para aislar citrofoblastos vellosidades primarias humanos para llevar a cabo el conjunto de experimentos presentados en la sección Protocolo. Tras su aislamiento, se analizaron primero la pureza de citotrofoblastos mediante el uso del marcador de citoqueratina-7 (Figura 1). Preparaciones de células se tiñeron por lo tanto el uso de un anticuerpo monoclonal anti-citoqueratina-7. La figura 1 repres.......
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Discusión
Los estudios sobre la función de la placenta humana y el desarrollo se han mejorado en gran medida por los protocolos orientados a optimizar el aislamiento de varias poblaciones de células placentarias. Uno de los mejores población de células de la placenta permanece estudiado los citotrofoblastos vellosos, cuyo estudio se ha beneficiado enormemente de los protocolos optimizados que permiten el aislamiento eficiente y fiable. Esto ha permitido, además, un número de experimentos, tales como estudios de transfección y de .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca del Consejo Nacional de Ciencias y la Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) (# 298527) (BB). CT fue apoyado por una beca de la FARE institucional. AV fue apoyada por un doctorado CRSNG Graham Bell beca. BB llevó a cabo una Cátedra de Investigación en Derechos Humanos Retrovirology (Nivel 2). Gracias a Beatriz Beisner en busca de ayuda en la revisión del texto.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| HBSS sin Ca2+, Mg2+ | Sigma | #H2387 | |
| HBSS (10x) | Sigma | #14060-057 | |
| DMEM Alta Glucosa sin Hepes | Gibco | #12100-061 | |
| Hepes (1 M) | Gibco | #15630-080 | |
| Penicilina-Estreptomicina-Neomicina (100x) | Gibco | #15640-055 | |
| Anfotericina B | Sigma | #A2411 | |
| CaCl2 | Sigma | #C4901 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | #M | |
| Suero fetal bovino | Gibco | #16170-078 | |
| Percoll | Sigma | #P-1644 | Para las tecnologías de gradiente de densidad |
| Syncytin-2 siRNA | Ambion Life | ||
| SiRNA codificado | Qiagen | # SI03650318 | |
| DNasa I | Sigma-Aldrich | ||
| Trypsine, tipo I | Sigma | #T8003 | |
| DharmaFECT Lipotransfección reactivos | GEhealthcare | # T-2001-01 | |
| Tecnologías de tripsina/EDTA | Life | #25300-062 | |
| Cóctel de inhibidores de proteasa | Roche Diagnostic | #11873580001 | |
| Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA | Thermo Scientific | #23225 | |
| BSA | Sigma | #A7906 | |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | |
| Anti-conejo IgG, anticuerpo ligado a HRP | Señalización celular | #7074 | |
| BM Quimioluminiscencia Western Blotting Substrate (POD) | Roche Diagnostic | #11500708001 | |
| DPBS | Tecnologías de la vida | #14287-080 | |
| T4 Polinucleótido quinasa | NEB | #M0201S | |
| ATP, [γ-32P] | Perkin Elmer | #BLU002A100UC | |
| Acrylmide | Sigma | ||
| TEMED | Life technologies | #17919 | |
| Persulfato de amonio | Sigma | ||
| Clon del anticuerpo anti-citoqueratina-7 humano LP5K, | reactivo de bloqueo Millipore | CBL194F | dilución 1:200 |
| Miltenyi Biotec | 130- 059-901 | Citómetro de flujo de dilución 1:10 | |
| BD Sistema Acuri | Becton Dickinson | ||
| Microporator MP-100 aparato | Tampón de | ||
| R (Sistema de transfección de neón 100 y micro; l Kit) | Tecnologías de la vida | MPK10096 | |
| membrana de PVDF | Millipore | IPVH00010 | Activar con metanol |
| Anticuerpo anti-GAPDH | humano Santa Cruz Biotechnology | sc-137179 | 1:500 |
| Peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado anticuerpo anti-conejo o anti-ratón anti-ratón | Señalización celular | #7074 | 1:10,000 |
| Peroxidasa de rábano picante (HRP)-conjugado cabra anticuerpo anti-ratón | Señalización celular | #7076 | 1:10.000 |
| NE-PER Reactivo de extracción nuclear y citoplasmática | Thermo Scientific | #78833 | |
| G-25 columna | GE Healthcare | #27-5325-01 | |
| Dispositivo de imágenes de quimioluminiscencia y fluorescencia | Montré al Biotech | Fusion FX5 | |
| 4% gel nativo | PBS casero | ||
| 1x | |||
| Sistema de Imagen Molecular Personal (PMI) | BioRad |
Referencias
- Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 51, 970-975 (2008).
- Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta....
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Reimpresiones y permisos
