Microscopía Electrónica de Barrido de tejido macerado para visualizar la matriz extracelular

Summary

Aquí se muestra un método para visualizar la ultraestructura de la matriz extracelular en tejidos cardíacos descelularizados.

Abstract

La fibrosis es un componente de todas las formas de enfermedad cardíaca, independientemente de su etiología, y aunque se ha avanzado mucho en el campo de la biología de la matriz cardíaca, todavía existen lagunas importantes relacionadas con cómo se forma la matriz, cómo difiere la remodelación fisiológica y patológica y, lo que es más importante, cómo se podría manipular la dinámica de la matriz para promover la curación e inhibir la fibrosis. Actualmente no existe una opción de tratamiento para controlar, prevenir o revertir la fibrosis cardíaca. Parte de la razón es probablemente la gran complejidad de la formación de cicatrices cardíacas, como las que ocurren después de un infarto de miocardio para reemplazar inmediatamente a los cardiomiocitos muertos o moribundos. La propia matriz extracelular participa en la remodelación activando las células residentes y también ayudando a guiar a las células infiltrantes hacia la lesión difunta. La matriz también es una especie de almacén para las proteínas matricelulares que son cruciales para el recambio normal de la matriz, así como para la señalización fibrótica. Además, se ha demostrado que la matriz desempeña un papel electromecánico en el tejido cardíaco. La mayoría de las técnicas para evaluar la fibrosis no son de naturaleza cualitativa, sino que proporcionan resultados cuantitativos que son útiles para comparar dos grupos, pero que no proporcionan información relacionada con la estructura de la matriz subyacente. Aquí se destaca una técnica para visualizar la ultraestructura de la matriz cardíaca. La microscopía electrónica de barrido del tejido cardíaco descelularizado revela diferencias sorprendentes en la estructura que, de otro modo, podrían pasarse por alto utilizando los métodos tradicionales de investigación cuantitativa.

Introduction

La fibrosis interrumpe la red normal de colágeno miocárdico, que es crítica para las funciones mecánicas normales de los cardiomiocitos ^1,2, así como para la comunicación intercelular, la señalización intracelular y la supervivencia celular ³. El desarrollo de fibrosis es un determinante importante de la función cardíaca, y la remodelación fibrótica del intersticio cardíaco que surge de una variedad de etiologías conduce a un aumento de la rigidez ventricular izquierda y disfunción diastólica ⁴. La fibrosis miocárdica también puede conducir a arritmias, y si la progresión del remodelado fibrótico es un fenómeno general o local, está altamente asociada a un mal pronóstico en pacientes con miocardiopatía isquémica y no isquémica ⁵. Asimismo, la ausencia de fibrosis miocárdica es un fuerte predictor de recuperación funcional ventricular y supervivencia a largo plazo ⁶.

El sello distintivo de la fibrosis es la deposición de exceso de colágeno, que tiene la resistencia a la tracción del acero ⁷ y puede afectar negativamente a la función de los cardiomiocitos en múltiples niveles. Las fuerzas mecánicas resultantes de una matriz excesivamente colágena pueden provocar atrofia de los cardiomiocitos ^8,9, rigidez pasiva del tejido ¹⁰, rigidez miocárdica inducida por la contracción tónica ^11-13 y reducción del suministro de oxígeno a la población restante de cardiomiocitos. El acoplamiento de la unión gap de cardiomiocitos y mioFbs también puede comprometer las características eléctricas del corazón, creando un mayor riesgo para el desarrollo de arritmias ^14-16. La fibrosis perivascular altera la reactividad vasomotora de las arterias coronarias intramurales y de las arteriolas ¹⁷ y contribuye al estrechamiento luminal que reduce el aporte de oxígeno y, por tanto, la supervivencia de los cardiomiocitos ^17-22. El remodelado fibrótico y eléctrico patogénico, que emana de un sitio inicial de lesión isquémica o desequilibrio energético, progresa inevitablemente a insuficiencia cardíaca.

La necrosis de los cardiomiocitos inicia la respuesta fibrótica y puede producirse una posterior remodelación fibrótica adversa independientemente de la etiología. Encontrar una forma de controlar la fibrosis cardíaca sería clínicamente beneficioso para el tratamiento de las miocardiopatías isquémicas e idiopáticas, la cardiopatía hipertensiva, la miocardiopatía hipertrófica, la valvulopatía y las distrofinopatías ^23-42. Independientemente de cómo comience el proceso de la enfermedad fibrótica, los factores profibróticos solubles pueden atravesar el espacio intersticial y provocar la activación de los fibroblastos intersticiales y adventiciales en sitios remotos a la cicatriz fibrótica inicial, creando un efecto en cascada que finalmente conduce a la insuficiencia cardíaca. El escenario óptimo sería explotar el proceso fibrilogénico utilizando una terapéutica dirigida que se pueda aplicar durante la etapa hipertrófica compensatoria de la miocardiopatía antes de que progrese a falla de la bomba sistólica, insuficiencia cardíaca diastólica u otros resultados en etapa terminal. El objetivo final sería revertir la fibrosis para que los cardiomiocitos muertos puedan ser reemplazados y la función cardíaca restaurada por completo.

La importancia de la matriz es ampliamente conocida, sin embargo, los métodos para estudiar la matriz se limitan principalmente a mediciones cuantitativas de los principales componentes estructurales, particularmente el colágeno, y los niveles relativos de diferentes proteínas matricelulares y de la matriz. Este protocolo pone de relieve una técnica poco utilizada que es útil para evaluar las diferencias cualitativas en la matriz cardíaca. Esta técnica se ha utilizado recientemente para comparar y contrastar diferencias fundamentales en matrices cardíacas de diferentes etiologías de enfermedades cardíacas (en explantes humanos), para examinar corazones de cerdos postinfartados tratados con la isoforma del factor de crecimiento glial (GGF) de neuregulina-1β, en relación con animales no tratados ⁴³, y para sondear diferencias en las matrices de tejidos cardíacos de MDX ratones (un modelo animal comúnmente utilizado de distrofia muscular de Duchenne) a diferentes edades y en comparación con los controles de tipo salvaje. Esta técnica fue introducida por primera vez por los doctores Caulfield y Borg en 1979 ⁴⁴, pero pocos estudios han empleado desde entonces esta poderosa técnica ^45-47, reintroducida aquí con sólo ligeras modificaciones. Esta metodología es una valiosa herramienta de investigación, ya que proporciona información cualitativa sobre la ultraestructura de la matriz extracelular que, de otro modo, podría pasarse por alto al medir simplemente el contenido de componentes de la matriz y/o el nivel de fibrosis.

Protocol

Declaración de Ética: Los protocolos para el manejo de animales fueron aprobados por el Vanderbilt Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC, protocolos número M / 10/117 (porcina) y M / 10/219 (ratones) y llevado a cabo de acuerdo con las normas de AAALAC-International. el uso de tejidos cardíacos humanos peraltadas fue aprobado por la Universidad de Vanderbilt Medical Center IRB (número de protocolo 100887).

1. Recolección de muestras y almacenamiento

1. Hacer fresco glutaraldehído 4% en solución tampón de fosfato 0,1 M (PB).
   PRECAUCIÓN: El glutaraldehído es tóxico, lleve guantes y el trabajo en una campana de humos.
   1. Hacer una solución 0,2 M social de PB, pH 7,4 usando 21,8 g de Na ₂ HPO ₄ y 6,4 g NaH ₂ PO _4. Quantum satis (Qs) a 1.000 ml _{de dH2O}
   2. Añadir 400 l de 50% de glutaraldehído a 2,5 ml de solución madre de PB y 2,1 ml _{de dH2O}
2. Sumergir un trozo (no más de 2 cm ²⁾ de tejido en la solución de glutaraldehído al 4%. Nota: Las piezas más pequeñas se pueden utilizar también, pero deberían ser de tamaño suficiente (no más pequeña que 5 mm ²⁾ para ser fácilmente visualizado por el ojo a fin de facilitar los pasos posteriores del protocolo.
3. Se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora, a continuación, almacenar indefinidamente a 4 ° C.

2. Descelularización de tejido cardíaco

1. Hacer una solución de NaOH acuoso al 10% fresco usando 10 g de lentejas de NaOH / 100 ml de dH ₂ O.
   PRECAUCIÓN: soluciones de NaOH son corrosivos y pueden causar quemaduras a los álcalis, usar guantes.
2. Enjuague el tejido en _dH2O
3. Se incuba en una solución de NaOH al 10% a temperatura ambiente durante 6 - 10 días (hasta que los cambios de tejido de color marrón rojizo a grisáceo o blanco).
4. Enjuague con _H2O destilada hasta que el tejido se vuelve transparente.
5. Sumergir el tejido en ácido tánico al 1% durante 4 horas a temperatura ambiente. Use 1 ml 5% solución de reserva por 4 ml _{de dH2O}
   PRECAUCIÓN: El ácido tánicoes un fuerte irritante, use guantes.
6. Enjuague en _dH2O durante la noche.

3. Osmication y deshidratación de los tejidos del corazón (en la campana de humos para la Seguridad)

1. Hacer una solución 0,2 M de stock de tampón de cacodilato de sodio utilizando 21,4 g de cacodilato de sodio, cloruro de calcio 10,0 g y 450 ml dH ₂ O. Mezcla, a continuación, añadir ácido clorhídrico como sea necesario para ajustar el pH a 7,4. Qs a 500 ml con _dH2O
   PRECAUCIÓN: cacodilato de sodio y ácido clorhídrico son tóxicos, usar guantes y el trabajo en una campana de humos.
2. Hacer solución madre acuosa al 2% de tetróxido de osmio en campana de humos para la seguridad disolviendo 1 g de cristal de tetróxido de osmio en 50 ml _{de dH2O}
   PRECAUCIÓN: El tetróxido de osmio es un grave peligro de inhalación; la fijación de vapor de las membranas mucosas o los ojos es posible, por lo tanto, manejar sólo en la campana de humos con guantes. Se recomienda utilizar un protector contra salpicaduras.
3. Enjuague el tejido en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (de la mezcla de la solución 1: 1 con dH _{2 O) durante 5 min en los rotadores (o agitación suave).}
4. Repita el paso anterior dos veces, para un total de tres enjuagues de amortiguamiento.
5. Sumergir el tejido en el 1% tetróxido de osmio en tampón cacodilato de sodio 0,1 M (de la mezcla de cacodilato de sodio social y acciones de tetróxido de osmio 1: 1) en el rotador durante 1 hora.
6. Enjuague el tejido en tampón cacodilato 0,1 M de sodio 3 veces durante 5 minutos cada uno en los rotadores.
7. Enjuague tejido usando concentraciones crecientes de etanol (30%, 50%, 75%, 85%, 95%, y, finalmente, 100%) durante 15 minutos cada uno en los rotadores.

4. Corte transversal preparación de superficies para SEM

1. Transferir el tejido en etanol al 100% a un plato poco profundo de Petri que contiene también 100% de etanol.
2. Mantenga dos cuchillas de afeitar muy afilados de tal manera que los planos de los lados están en contacto uno con el otro y la cruz bordes de corte para formar dos lados de un triángulo equilátero por encima de la muestra. Para lograr esto, usar la mano izquierda para colocar una cuchilla en el extremo derecho de la muestra ycorte hacia la izquierda. Al mismo tiempo, usar la mano derecha para colocar la segunda hoja en el extremo izquierdo de la muestra y la rebanada hacia la derecha. Por lo tanto, las cuchillas se deslizan uno contra el otro desde direcciones opuestas para hacer un solo corte suave.
3. Deslizar los lados de hoja plana uno contra el otro para hacer un corte muy limpio de la muestra con una distorsión mínima o fuerza de desgarro, preferiblemente exponiendo tan grande un área de superficie como sea posible sin dañar la muestra.
4. Repita este procedimiento para cada muestra para exponer las posibles superficies de sección transversal más limpias para su examen en el SEM.

5. El punto crítico de secado (CPD) de tejido cardíaco

1. Utilice una espátula o pinzas para transferir tejido para el soporte de muestra de la secadora punto crítico (CPD), asegurando que el tejido se mantiene en etanol al 100% en todo momento. Asegúrese de que el soporte se sumerge en etanol y que la transferencia se consigue con el tejido expuesto al aire durante no más de unos pocos segundos.
2. Operar CPD por nosotrosmanual del er 3 para completar la purga y relleno para reemplazar los ciclos de etanol con dióxido de carbono líquido.
3. CPD operar según el manual del usuario para lograr un secado punto crítico de las muestras y devolverlos a la presión atmosférica con ventilación controlada de _CO2.

6. Montaje de muestras de tejido del corazón para SEM

1. Preparar un trozo de muestra SEM para cada muestra, adhiriendo una lengüeta adhesiva de carbono a la superficie superior del tramo de aluminio.
2. Con la ayuda de un microscopio estereoscópico, se adhieren cuidadosamente la muestra para el precinto adhesivo con la superficie de la sección transversal de interés hacia arriba (lejos de la pestaña, visible), y lo más cerca posible de manera paralela con el plano de la superficie de la muestra trozo. No introduzca ni toque la superficie de interés.
3. Romper un aplicador de madera para lograr un cepillo cónico, ideal para la aplicación de pintura. Aplicar pintura de plata o de carbono en la base y los lados de la probeta, para mejorar la adherencia al trozo.
4. Extender una línea muy fina de plata o de carbono pintar hasta un borde de la superficie de interés, para proporcionar un camino de carga de la superficie de interés a tierra.
5. Aplicar 2 o 3 pequeños toques de plata o pintura de carbono alrededor del perímetro de la pestaña de carbono, para proporcionar una ruta conductora de la superficie de la aleta de carbono para el talón de metal y por lo tanto a tierra.
6. Deje que se seque la pintura conductora durante dos horas.
7. Operar revestidor de bombardeo iónico por el manual del usuario para aplicar un recubrimiento relativamente pesado (intervalo objetivo de 30 - 40 nm) de aleación de oro-paladio u oro. Bomba cámara de muestras a aproximadamente 0,1 mbar; programar el temporizador de 40 segundos. Conjunto de válvula abierta al (flujo de gas argón moderada) 08:00 posición. Pulse Iniciar para iniciar el revestimiento por bombardeo iónico a 30 mA. descarga luminiscente púrpura debe ser visible en la cámara de muestra.

7. SEM El examen de muestras de tejido del corazón

1. Realizar microscopía electrónica de barrido relativamente bajo voltaje de aceleración para minimizar la formación de imágenes pos problemas asociados con la mala disipación de la carga en la muestra (carga). Sugerido condición de imagen inicial son: 5 kV voltaje de aceleración, distancia de trabajo de 10 mm.
2. Con la asistencia de un operador con experiencia, empleo aumenta la distancia de trabajo para ampliar la profundidad de campo en condiciones de formación de imágenes que requieren foco de fibras en múltiples planos focales, o fibras que se extienden de considerable longitud en la dimensión z.
   1. Para el microscopio usado aquí (véase la Tabla de Materiales), en el acceso a la interfaz de usuario en la pestaña de navegación arriba a la derecha.
   2. Acceder a la ficha Coordenadas del menú escenario. Para aumentar la distancia de trabajo, introduzca un valor mayor en milímetros para la coordenada z continuación, haga clic en la pestaña Ir a la etapa de mover la muestra a la distancia de trabajo introducido.
3. Con la ayuda de un operador experimentado, emplear inclinación espécimen y rotación para posicionar la superficie de ortogonal interés para el haz de electrones. la inclinación adicional de 10 a 30 grado dees de esta posición puede mejorar la observación y documentación de la estructura de la matriz.
   1. Para el microscopio usado aquí (véase la Tabla de Materiales), en la interfaz de usuario, haga clic y mantenga pulsado el botón derecho del ratón, a continuación, deslice hacia la izquierda o hacia la derecha para enfocar la muestra cerca de la periferia del plano de la superficie preparada de interés, teniendo en cuenta la distancia de trabajo enfocado .
   2. Navegar con el mando de control de interfaz de usuario Manual de moverse cerca del borde opuesto de la superficie y repita el enfoque. Si la distancia de trabajo no es aproximadamente igual a la primera posición, la muestra de inclinación para lograr la aproximación de acuerdo en ambos lugares mediante la ficha Coordenadas del menú de la etapa (véase el apartado 7.2) e introduzca un valor de inclinación en el T de coordenadas.
   3. Girar noventa grados espécimen (Anotar el valor en R Coordinar campo) y repetir el proceso hasta que todas las posiciones se concentran aproximadamente a la misma distancia de trabajo.
      Nota: presión variable SEM se puede emplear para mejorar la disipación de la cargasi está disponible. De alto vacío es el modo de funcionamiento estándar para la microscopía electrónica de barrido.

Results

La técnica resaltado se aplicó a los tejidos cardíacos de un donante de trasplante de corazón humano no utilizado (Figura 1), tejidos explantados de los receptores de trasplante, los corazones de tipo salvaje y ratones distróficos (Figura 3), y en muestras de corazón post-infarto de miocardio de un cerdo modelo de lesión del corazón (Figura 2). Como se muestra en la Figura 1, la matriz cardíaco humano es un intrincado te...

Discussion

Cruz preparación sección de superficie es el paso más crítico durante el protocolo. Para preservar la estructura fina, las muestras deshidratadas deben permanecer en etanol al 100% en todo momento hasta introducido en el proceso de secado de punto crítico. Por lo tanto el corte en lonchas de los especímenes para lograr superficies de exploración EM deben hacerse mientras las muestras se sumergieron en etanol en un plato poco profundo. También es fundamental que la superficie expuesta no se toca o sondeó durante la manip...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloruro de calcio	Microscopía electrónica Ciencias	12340 100	g
Adhesivo de carbono	Microscopía electrónica Ciencias	12664	30 g
Lengüetas adhesivas de carbono	Ciencias de la microscopía electrónica	77825	Orden para encajar los talones
Hojas de afeitar de doble filo Acero inoxidable	Ted Pella, Inc	121-6	250/pkg
	Etanol Electrón Ciencias de la Microscopía	15055	450 ml
Gluteraldehído, Solución al 50%	Ciencias de la Microscopía Electrónica	16310	Grado EM, purificado por destilación
Ácido clorhídrico	Ciencias de la Microscopía Electrónica	16760 o 16770	100 ml
Fosfato monosódico NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9251-250G	250 g
Osmio Tetróxido	Microscopía Electrónica Ciencias	19100	1 g
Adhesivo conductor de plata	Ciencias de la Microscopía Electrónica	12686-15	15 g
Hidróxido de sodio (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045-1KG	1 kg
Fosfato de sodio Dibásico (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S3264-500G	500 g
Ácido tánico, 5% Acuoso	Ciencias de la Microscopía Electrónica	21702-5	500 ml
Cacodilato de Sodio Trihidrato	Ciencias de la Microscopía Electrónica	12300	100 g
Aleación de oro-paladio o	Sistemas de refinación de oro, Inc.	varía	según la marca y el modelo del recubridor por pulverización catódica
Secador de punto crítico	Microscopía electrónica Sciences	850
Aplicadores de madera lisa	Fisher Scientific	23-400-102
Quanta 250 SEM ambiental	FEI	Q250 SEM
Recubrimiento por pulverización catódica	Cressington Scientific Instruments Ltd.	Modelo 108
Aluminio SEM Sample Stubs	Electrónica Microscopy Sciences	75220-12	específico para el miscroscopio