Multicolor detección por fluorescencia de la gotita de microfluídica el uso de fibras ópticas

Summary

La detección de fluorescencia multicolor en microfluídica de gotas suele implicar sistemas de detección basados en microscopio de epifluorescencia voluminosos y complejos. Aquí describimos un esquema de detección multicolor compacto y modular que utiliza una matriz de fibras ópticas para codificar temporalmente los datos multicolor recopilados por un solo fotodetector.

Abstract

Los ensayos de fluorescencia son las lecturas más comunes utilizadas en la microfluídica de gotas debido a sus señales brillantes y su rápida respuesta temporal. Aplicaciones como los ensayos múltiples, la evolución de enzimas y la clasificación celular mejorada en biología molecular requieren la detección de dos o más colores de fluorescencia. Los sistemas de detección multicolor estándar que acoplan láseres de espacio libre a microscopios de epifluorescencia son voluminosos, caros y difíciles de mantener. En este artículo, describimos un esquema para realizar la detección multicolor mediante la excitación de regiones discretas de un canal microfluídico con láseres acoplados a fibras ópticas. La luz emitida es recogida por una fibra óptica acoplada a un único fotodetector. Debido a que la excitación ocurre en diferentes ubicaciones espaciales, la identidad de la luz emitida se puede codificar como un cambio temporal, lo que elimina la necesidad de esquemas de filtrado de luz más complicados. El sistema se ha utilizado para detectar poblaciones de gotas que contienen cuatro combinaciones únicas de colorantes y para detectar concentraciones subnanomolares de fluoresceína.

Introduction

Microfluídica Droplet proporcionan una plataforma para alta biología rendimiento por compartimentar experimentos en un gran número de gotitas acuosas suspendidas en un aceite portador ^1. Las gotitas se han utilizado para aplicaciones tan diversas como el análisis de células individuales ^2, reacción en cadena de la polimerasa digital (PCR) ^3, y la enzima evolución ^4. ensayos fluorescentes son el modo estándar de detección para microfluidos de gotitas, ya que sus señales luminosas y tiempo de respuesta rápido son compatibles con la detección de volúmenes de gotitas sub-nanolitros a tasas kilohercios. Muchas aplicaciones requieren la detección de fluorescencia de al menos dos colores simultáneamente. Por ejemplo, nuestro laboratorio realiza comúnmente PCR activadas por la clasificación de gotitas experimentos que utilizan un canal de detección para el resultado de un ensayo, y se utiliza un colorante de fondo secundario para hacer gotita ensayo negativo contable ^5.

estaciones de detección típicos para microfluidos de gotas son based en los microscopios de epifluorescencia, y requieren complicados esquemas de manipulaciones de luz para introducir luz de excitación de láseres de espacio libre en el microscopio estar centrado en la muestra. Después de fluorescencia es emitida desde una gota, la luz fluorescente emitida se filtra de modo que cada canal de detección utiliza un tubo fotomultiplicador (PMT) centrada en una banda de longitud de onda. Los sistemas de detección óptica de epifluorescencia a base de microscopio proporcionan una barrera a la entrada, debido a su costo, la complejidad y requieren mantenimiento. Las fibras ópticas proporcionan los medios para la construcción de un esquema de detección simplificada y robusta, ya que las fibras se pueden insertar manualmente en los dispositivos de microfluidos, eliminando la necesidad para el enrutamiento de la luz a base de espejo, y permitir trayectorias de la luz para ser interconectados mediante conectores de fibra óptica.

En este trabajo se describe el montaje y validación de un sistema compacto y modular para realizar la detección de fluorescencia multicolor mediante la utilización de una matriz de fibras de una ópticada fotodetector solo ^6. Las fibras ópticas están acopladas a los láseres individuales y se insertan normal a un canal de flujo en forma de L en desplazamientos espaciales regulares. Una fibra de captación de fluorescencia está orientado paralelo a las regiones de excitación y está conectado a un único PMT. Debido a que una gota pasa a través de los haces de láser en diferentes momentos, los datos registrados por el PMT muestra un desplazamiento temporal que permite al usuario distinguir entre la fluorescencia emitida después de la gotita es excitado por cada haz de láser distinto. Este cambio temporal elimina la necesidad de separar la luz emitida a PMT separados utilizando una serie de espejos dicroicos y los filtros de paso de banda. Para validar la eficacia del detector, que cuantificar la fluorescencia en las poblaciones de gotitas que encapsulan tintes de diferente color y la concentración. La sensibilidad del sistema se investiga para la detección de un solo color de fluoresceína, y muestra la capacidad de detectar gotitas con concentraciones de hasta 0,1 nM, un impr sensibilidad 200xovement en comparación con los enfoques basados ​​en fibra recientes en la literatura ^7.

Protocol

Fabricación 1. Maestro SU8

1. Diseñar las estructuras de microfluidos para la fabricación de tres capas utilizando software de diseño y tienen los diseños impresos por un proveedor en la película placa de circuito con 10 micras de resolución. Los detalles del diseño del dispositivo se dan en una referencia vinculada ⁶ y las geometrías del canal se muestra en la Figura 1. Las capas deben incluir marcas de alineación para ayudar a collocate características de cada capa de la fabricación ^8.
2. Coloque una oblea de silicio de diámetro previamente limpiadas de 3 pulgadas en una recubridora de rotación y encienda el vacío para pegarla en el mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3050 en el centro de la oblea y centrifugado durante 20 segundos a 500 rpm, a continuación, 30 segundos a 1750 rpm, proporcionando un espesor de capa de 80 micras.
3. Retire la oblea y hornear en una placa de cocción de 135 ° C durante 30 minutos. Dejar que la oblea de enfriar a ta antes de pasar a la siguiente etapa.
4. Exponer el disco recubierto con la capa de máscara 1 ^st bajo un colimado 190 mW, 365 nm LED durante 3 min. Después de la exposición, colocar la oblea en una placa de cocción C 135 ° durante 1 min, después se enfría a RT, antes de proceder al siguiente paso.
5. Colocar la oblea en la recubridora de rotación y encienda el vacío para pegarla en el mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3050 en el centro de la oblea y centrifugado durante 20 segundos a 500 rpm, a continuación, 30 segundos a 5000 rpm, lo que resulta en una capa que proporciona un espesor adicional de 40 micras.
6. Retire la oblea y hornear en una placa de cocción de 135 ° C durante 30 minutos, dejar enfriar a temperatura ambiente antes de pasar al siguiente paso.
7. Alinear la máscara de capa 2 ^o en la geometría modelada en 1.3 y exponer la oblea recubierta a un colimado 190 mW, 365 nm LED durante 3 min. Después de la exposición, colocar en un 135 ° C placa de 4 min 30 seg, y luego se enfría hasta TA antes de proceder al siguiente paso.
8. Colocar la oblea en la recubridora de rotación y encienda el vacío para pegarla en el mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3050 en el centro de la oblea y centrifugado durante 20 segundos a 500 rpm, a continuación, 30segundos a 1000 rpm, lo que resulta en una capa que proporciona un espesor adicional de 100 micras.
9. Retire la oblea y hornear en una placa de cocción de 135 ° C durante 30 minutos, dejar enfriar a temperatura ambiente antes de pasar al siguiente paso.
10. Alinear la máscara de capa 3 ^rd en la geometría modelada en 1.3 y exponer la oblea recubierta a un colimado 190 mW, 365 nm LED durante 3 min. Después de la exposición, colocar en un 135 ° C placa de cocción para 9 min, después se enfría a RT, antes de proceder al siguiente paso.
11. Desarrollar las máscaras por inmersión en un baño de agitación de propileno glicol monometil éter acetato durante 30 minutos. Lavar la oblea en isopropanol y se cuece al horno en una placa caliente a 135 ° C durante 1 min. Coloque el maestro desarrollado en una placa de Petri de 100 mm para el moldeo de polidimetilsiloxano (PDMS).

2. PDMS fabricación de dispositivos

1. Preparar 10: 1 PDMS mediante la combinación de 50 g de base de silicona con 5 g de agente de curado en un vaso de plástico. Mezclar el contenido con una herramienta rotativa dotada de una varilla de agitación. degcomo la mezcla dentro de un desecador durante 30 min, o hasta que todas las burbujas de aire se eliminan.
2. Verter el PDMS para dar un espesor de 3 mm sobre el maestro y colocar de nuevo en el desecador durante más de desgasificación. Una vez que se eliminan todas las burbujas, hornear el dispositivo a 80 ° C durante 80 minutos.
3. Cortar el dispositivo del molde utilizando un bisturí y el lugar sobre una superficie limpia con el lado estampado y perforar las entradas y salidas de fluidos con un punzón de biopsia de 0,75 mm. El dispositivo debe ser cortada de manera que las 120 micras y 220 micras geometrías altos son accesibles desde el lado del dispositivo.
4. Plasma trata a un dispositivo, con la cara hacia arriba función, junto con un pre-limpiadas 2 pulgadas por 3 pulgadas portaobjetos de vidrio a 1 mbar plasma de _O2 durante 20 segundos en un limpiador de plasma de 300 W. Unir el dispositivo de PDMS colocando el lado estampado del dispositivo de PDMS en el lado tratado con plasma de la lámina de vidrio. Coloque el dispositivo en un horno a 80 ° C y hornear el dispositivo montado durante 40 minutos.
5. Prestar los canaleshidrófoba mediante el uso de una jeringa para enjuagar el dispositivo con un fluido de tratamiento de superficie fluorada. Inmediatamente hornear el dispositivo a 80 ° C durante 10 min para evaporar el disolvente.

3. Preparación de los componentes ópticos

1. Preparar la fibra láser de excitación mediante la eliminación del aislamiento de la última 5 mm de un 105 micras núcleo, revestimiento 125 m, NA = 0,22 fibra óptica.
2. Preparar el color de láser de fibra de excitación ^2º repitiendo 3.1 para una fibra idéntica ^2º.
3. Preparar la fibra para recoger la señal de fluorescencia mediante la repetición de un 3,1 por 200 micras núcleo, revestimiento 225 m, NA = 0,39 fibra óptica.
4. Inspeccionar las puntas de todas las fibras - si la punta no terminan en una superficie plana, vuelva a escindir los extremos con un escriba fibra.
5. Adjuntar un acoplador de fibra láser a un 50 mW, 405 nm láser y adjuntar una de las 105 micras fibras del núcleo al láser. Dirigir el extremo pelado en el sensor de la potencia del lásermetro, y el uso de los ajustes finos del acoplador de láser para maximizar la potencia del láser.
6. Repita 3,5 para un láser de 50 mW, 473 nm.
7. Montar una 446/510/581/703 filtros de paso de banda cuádruple nm en el PMT utilizando tubos de lentes para bloquear la luz láser y transmitir la fluorescencia emitida. Adjuntar acoplador de fibra de modo que la luz viaja a través de los filtros antes de golpear el PMT.
8. Coloque la fibra de 3,3 a la unidad ensamblada en 3.7.

4. Fuera de línea mixta Generación Emulsión

1. Obtener un dispositivo de microfluidos dropmaker flujo foco con un 60 micras x 60 micras orificio.
2. Llene una jeringa de 1 ml con HFE 7500 aceites con 2% fluorado iónica ^9.
3. Llene una serie de jeringas de 1 ml con las siguientes combinaciones de fluoresceína (FITC) y tintes de color azul de dextrano conjugado (CB) en PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM CB, y 10 nM FITC / 100 nM CB.
4. Montar el dispositivo dropmaker en el escenario de un micros invertidashacer frente y las jeringas acuosas y de aceite en bombas de jeringa. Acoplar las jeringas a los dispositivos que utilizan PE-2 tubos.
5. Ejecución de bombas de jeringa a 500 l / h para el aceite y 250 l / h para las soluciones acuosas, crear una mezcla de 80 micras gotitas que contienen las soluciones de 4,3. Para cada tipo de muestra acuosa, utilice un dispositivo dropmaker fresca para eliminar la contaminación cruzada. Recoger ~ 200 l de emulsión de cada combinación de medio de contraste en una jeringa vacía.
6. Después de los 4 tipos de las gotitas se han recogido en una sola jeringa colección, mezclar la emulsión por repetidamente la rotación de la jeringa.
7. Repetir los pasos 4.2 a 4.6 con las soluciones acuosas que contienen 0,1, 1, 10, y 100 nM FITC en PBS.

5. La inserción de fibra óptica

1. Coloque el chip de microfluidos fabricado en el paso 2 en el escenario de un microscopio invertido, junto con una cámara digital capaz de <100 microsegundos velocidades de obturación.
2. Trabajar con cuidado desde el lado, inseta la fibra acoplado al láser 473 nm en el canal 120 micras más alejado aguas arriba, teniendo cuidado de no perforar a través de al canal de flujo principal.
3. Insertar la fibra acoplado al láser 405 nm en el canal micras alta lado más alejado aguas abajo 120, proporcionando espaciamiento fibra de 300 micras.
4. Insertar la fibra acoplado a PMT en el canal de altura 220 micras normal a las dos fibras de excitación láser.

6. Detección de la fluorescencia de las emulsiones mixtas

1. Montar una jeringa de 5 ml lleno de HFE 7500 con tensioactivo fluorado iónico 2% a la entrada de aceite espaciador del dispositivo de detección con PE-2 tubos.
2. Montar la jeringa que contiene la emulsión mixta / CB FITC en una bomba de jeringa orientada verticalmente y la pareja a la entrada de gotas de reinyección del dispositivo mediante PE-2 tubos. Conectar un tramo de tubo PE-2 de la salida de dispositivo a un recipiente de residuos.
3. El primer dispositivo mediante la ejecución de cada una de las bombas a 1.000 l / h hasta tantoaceite y las gotitas se observa que son la combinación de regularidad en el dispositivo y que fluye aguas abajo.
4. Ajustar los caudales de tal manera que el aceite espaciador ejecuta a 6.000 l / hr y las gotas en 100 l / h, proporcionando separación significativa entre las gotas que viajan a través de la región de detección.
5. Encienda el láser, inicie el programa de adquisición de datos, y ajustar la ganancia del PMT para proporcionar señales que son más de 100 veces el ruido de la línea de base. Ajustar la potencia del láser de modo que todos los picos doblete son claramente visibles en un solo timetrace, linealmente a escala.
6. Adquirir 60 seg de la timetrace voltaje PMT en al menos 20 kHz. Importar los datos en el programa de computación tales como Matlab y medir las alturas de los picos de los dobletes grabados utilizando la secuencia de comandos del programa de computación personalizado.
   NOTA: Esto se proporciona como información complementaria.
7. Repita los pasos 6.2 a 6.7 utilizando la única FITC-emulsión mixta creada en 4.7, con el láser de 405 nm apagado.

Results

La fabricación de un dispositivo de PDMS que permite la inserción de fibras ópticas requiere un procedimiento de fotolitografía de varios pasos para crear canales de altura variable (Figura 1). En primer lugar, un 80 micras de altura de capa de SU-8 se hace girar sobre una oblea de silicio y se modela usando una máscara para crear la geometría de manejo de fluidos. A continuación, un 40 micras capa adicional de SU-8 se hace girar sobre la oblea, y se modela mediante una ...

Discussion

detección de fibra óptica requiere la alineación de las fibras ópticas con respecto a los canales de fluido. Debido a que nuestro dispositivo utiliza canales de guía fabricados con múltiples capas de fotolitografía, la colocación de máscaras con respecto a la otra es de gran importancia. Si los canales de guía de la fibra son demasiado cerca del canal de fluido, existe un potencial de fugas de fluido; Si los canales de guía se encuentran demasiado lejos o mal alineados, la señal de fluorescencia recogida por la fibra de...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fotomascarillas	CadArt Servcies Obleas de silicona
de 3", tipo P, virgen grado de prueba	University Wafers	447
SU-8 3035	Microchem	Y311074
SU-8 2050	Microchem	Y111072
Sylgard 184 kit de elastómero de silicona	Krayden 4019862
jeringas de 1 ml	BD
Jeringas de 10 ml	BD	309604
27 agujas de gaga	BD	305109
PE 2 tubo de polietileno	Scientific Commodities, Inc.	B31695-PE/2
Novec 7500	Fisher Scientific	98-0212-2928-5	Comúnmente conocido como HFE 7500
Ionic Krytox Surfactant			Instrucciones de síntesis en ref #10
Colorante azul en cascada conjugado con dextrano	Life Technologies	D-1976
Fluoresceína sal	Sigma	28803
Filtro	de paso de banda cuádrupleSemrock	FF01-446/510/581/703-25
PMT	Thorlabs	PMM02
Puerto de fibra	Thorlabs	PAFA-X-4-A
tubo de lente	Thorlabs	SM1L05
Cable de conexión con 200 μ m núcleo / 225 μ m revestimiento de fibra óptica con un extremo pelado y un conector FC/PC	Thorlabs	Cable
con 105 μ m núcleo / 125 μ m revestimiento de fibra óptica con un extremo pelado y un conector FC/PC	Thorlabs	Custom
125 μ m peladora	de fibra Thorlabs	T08S13
225 μ m herramienta de pelado de fibra	Thorlabs	T10S13
adaptador de fibra láser	OptoEngine	FC/PC Adaptador
405 nm CW láser a 50  mW	OptoEngine	MDL-III-405	Distribuidor para láseres CNI
473 nm CW láser a 50  mW	OptoMotor	MLL-FN-473-50