Los xenoinjertos derivados del paciente de glioblastoma multiforme pueden miniaturizarse en microtumores vivos utilizando un sistema de cultivo de biogel humano en 3D. Este ensayo tumoral 3D de tipo in vivo es adecuado para las pruebas de respuesta a fármacos y la elaboración de perfiles moleculares, incluido el análisis cinómico.
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Artículo de método
Generación de microtumores Uso Humano 3D Biogel sistema de cultivo y las células de glioblastoma derivados de los pacientes para Kinomic de perfiles y pruebas de respuesta a los fármacos
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Resumen
Resumen
El uso de xenoinjertos derivados de pacientes para modelar cánceres ha proporcionado información importante sobre la biología del cáncer y la capacidad de respuesta a los fármacos. Sin embargo, requieren mucho tiempo, son costosos y requieren mucha mano de obra. Para superar estos obstáculos, muchos grupos de investigación han recurrido a cultivos esferoides de células cancerosas. Si bien son útiles, los esferoides tumorales o agregados no replican las interacciones célula-matriz como se encuentran in vivo. Como tal, los enfoques de cultivo tridimensional (3D) que utilizan un andamio de matriz extracelular proporcionan un sistema de modelos más realista para la investigación. A partir de xenoinjertos subcutáneos o intracraneales, el tejido tumoral se disocia en una suspensión de una sola célula similar a las neuroesferas de células madre cancerosas. A continuación, estas células se incrustan en una matriz extracelular derivada del ser humano, el biogel humano 3D, para generar un gran número de microtumores. Curiosamente, los microtumores se pueden cultivar durante aproximadamente un mes con alta viabilidad y se pueden utilizar para pruebas de respuesta a fármacos mediante ensayos de citotoxicidad estándar como el bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) y la obtención de imágenes de células vivas mediante Calcein-AM. Además, pueden analizarse mediante inmunohistoquímica o recolectarse para la elaboración de perfiles moleculares, como el perfil cinómico de alto rendimiento basado en matrices, que también se detalla aquí. Por lo tanto, los microtumores 3D representan un sistema modelo versátil de alto rendimiento que puede replicar más de cerca la biología tumoral in vivo que los enfoques tradicionales.
Introducción
Los tumores cerebrales primarios más comunes intracraneales malignos son astrocitomas de grado III y grado IV glioblastoma multiforme (glioblastoma). Estos tumores se ofrecen con peor pronóstico de supervivencia a un año de media entre 12 - 15 meses, con las terapias actuales para GBM en el 1-3 de Estados Unidos. terapias multimodales son la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia que incluye temozolomida (TMZ) y agentes quinasa específica. la señalización de la quinasa con frecuencia se desregula en GBM, incluyendo subgrupos de tumores con amplificación o la activación de mutaciones en el factor de crecimiento epidérmico (EGFR), el aumento de crecimiento derivado de plaquetas receptor del factor de plaquetas (PDGFR) de señalización, el aumento de la fosfatidil-inositol-3-quinasa (PI3K) y tumor de soporte de señalización angiogénica a través de crecimiento endotelial vascular Factor receptor (VEGFR), así como otras vías de quinasa impulsado 4-6. Current in vitro y en modelos in vivo con frecuencia pierden estas alteraciones representativos 7. Además, el perfil genético no ha ofrecido los beneficios anticipados que pueden reflejar el hecho de que los cambios genéticos y epigenéticos no siempre predicen cambios en el nivel de actividad de la proteína, donde la mayoría de quinasa agentes de direccionamiento actúan directamente, y donde las terapias con otros mecanismos de acción pueden actuar indirectamente.
La línea celular inmortalizada tradicional que puede ser pasado hasta el infinito ha sido durante mucho tiempo el estándar para las pruebas de drogas debido a su facilidad de mantenimiento y reproducibilidad. Sin embargo, este modelo sufre de un entorno de crecimiento alta de nutrientes (y artificial) que selecciona las células que se diferencian en gran medida del tumor original de rápido crecimiento. Como tal, ha habido un considerable interés en el desarrollo de sistemas de modelo más realista que reflejan un sistema biológico tumor más complejo como está presente en el paciente. xenoinjertos de tumores desarrollan directamente de un tumor primario crecido en ratones ( "xenoline," xenoinjerto derivado del paciente o PDX) provide un sistema de modelo más reflectante, en particular en el contexto de la terapéutica del cáncer, ya que se sienten de predecir de manera más fiable el éxito clínico. 8 A pesar de la biología más reflexivo, estos modelos son caros y son difíciles de establecer y mantener. Además, no son susceptibles de alto rendimiento estudios. La necesidad de desarrollar mejores modelos biológicos que reflejan con mayor precisión las alteraciones moleculares en los tumores primarios, y al perfil y probar estos modelos a través de medidas directas de la actividad quinasa, no subrogarse marcadores genéticos, está claro.
Es bien sabido que a diferencia de dos dimensiones cultivos en monocapa (2D), los modelos de ensayo multicelulares 3D o pueden proporcionar más fisiológicamente puntos finales pertinentes 9-11. cultura 3D enfoques comunes implican microvehículos recubiertos de matriz y la formación de esferoides de células. esferoides tumorales se pueden generar a través de la agregación celular usando matraz de agitación, placa pHEMA y colgando técnicas de caída. Limitaciones para tenfoques stos incluyen: la incapacidad de algunas células para formar esferoides estables, la variabilidad en el crecimiento y desafíos con los tipos de células mixtas. Alternativamente, muchos sintético (hidrogel, polímero) y animal derivados de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matriz de sarcomas de ratón, colágeno bovino) matrices se han desarrollado para el cultivo 3D estudia 12-14. Matriz de ratón EHS se utiliza ampliamente pero conocido por promover el crecimiento y la diferenciación celular in vitro e in vivo 15.
Con el fin de replicar la biología del tumor 3D, un sistema de biomatriz humana fue desarrollado por el Dr. Raj Singh et al. 16. El Biogel humana sin factor natural, el crecimiento de cultivo permite andamios 3D (perlas, discos), que apoyan el cultivo a largo plazo de varios tipos de células. Se establecen una serie de diseños de cultivo Biogel humana 3D para el estudio de las propiedades del crecimiento tumoral, la adhesión, la angiogénesis y la invasión. Ventajas y propiedades de Biogel humano en comparación con comúngeles ratón EHS se resumen en la Tabla 1 y la Tabla 2.
| Fuente: | Amnios humano (tejido agrupado) Libres de patógenos, IRB-exentos / aprobado |
| Naturaleza ECM: | Biogel no desnaturalizado (GLP-producción) |
| Llave componentes: | Col-I (38%), laminina (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), entactina y HSPG (<3%) |
| GF-libre: | Indetectable EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-angiogénico, no tóxico) |
Tabla 1: Propiedades de Biogel humano en comparación con geles de EHS comunes.
| Biogel humana | geles de EHS |
| matriz humana natural | matriz de ratón reconstituido |
| el crecimiento y la diferenciación celular controlada | Puede promover el crecimiento celular y la diferenciación |
| la expresión de genes fisiológica | la expresión de genes Variable |
| 3D modelo de cultivo de tejido similar | modelo de cultivo basado en placas |
Tabla 2: Ventajas de Biogel humano en comparación con geles de EHS comunes.
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Protocolo
NOTA: Todas las evaluaciones de terapia de xenoinjertos se realizaron utilizando un modelo de tumor ortotópico para el glioblastoma en un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional.
1. Aislamiento de células GBM xenoinjertos derivados de los pacientes
- Preparación de los reactivos
- Re-constituir colagenasa-I en agua estéril a una concentración de 5 mg / ml de filtro y estéril. Almacenar en alícuotas de 1 ml a -20 ° C (concentración final es de 50 mg / ml en solución de enzima 100 ml).
- Disolver 100 g Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) en 2 ml estéril tamponada con fosfato salino (PBS). Almacenar en 100 l (5 g / 100 l) alícuotas a -20 ° C para una concentración final de 10 ng / ml.
- Disolver 100 g FGF-β en 2 ml de PBS estéril. Almacenar en 100 l (5 g / 100 l) alícuotas a -20 ° C para una concentración final de 10 ng / ml.
- Añadir la botella siguiendo a uno 500 ml de Neurobasal Medi bis (NBM) para preparar completa NBM: 10 ml B-27 suplemento sin vitamina A, 5 ml de suplemento de N2, 100 l 100 l EGF, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) Básicas, 5 ml de anfotericina B, gentamicina 0,5 ml, 5 ml L-glutamina.
- Preparar la solución de enzima fresco mediante la combinación de: 98,5 ml de PBS, 1 ml de colagenasa-1, 0,5 ml de 10x de tripsina / EDTA y esterilizar por filtración a través de 0,22 micras de poro de filtro.
- Preparar u obtener un pequeño volumen estéril de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) / medio de cultivo celular F12 con 7% de suero bovino fetal (FBS) y 1 x PBS sin calcio o magnesio.
- La desagregación del tumor
NOTA: atímicos ratón nu / nu previamente inyectados con células tumorales en el flanco derecho y se permite que una masa de tumor palpable es necesario para este procedimiento. En los ejemplos que se muestran aquí, hemos utilizado células GBM xenoinjertos derivados del paciente, JX10 y JX12 17.- Esterilizar área de trabajo mediante pulverización clorhexidina al 2% y configurar el ingenio área de trabajoh / instrumentos necesarios suministros, incluyendo mandril desechable, pinzas, bisturí, vidrio plato Petri, solución de enzima, PBS, y clorhexidina (Véase la Figura 2A).
- La eutanasia de ratón / ratones que albergaban un tumor en el flanco. Apunta a una velocidad de desplazamiento / min 20% de CO 2 utilizando 30% de CO 2. Después de que el ratón muestra paro respiratorio, mantener CO 2 de flujo durante aproximadamente 1 min (típicamente 3 min total). Los ratones se retiraron de la cámara y la dislocación cervical se lleva a cabo como una confirmación de la eutanasia secundaria. Pulverizar el animal con 3% de clorhexidina para desinfectar la piel.
- Mientras sostiene el ratón constante, hacer incisión en la piel semicircular ~ 1,5 cm de masa tumoral (flanco implantado tumor) utilizando un bisturí estéril desechable con # 11 cuchillas comienzan craneal a la masa tumoral y la incisión hacia el vientre del ratón y en torno a la extremo caudal.
- Reflejar piel sobre la masa tumoral utilizando los dedos con una tracción suave sobre el extremo caudal de la incisión y luego haga clic en la piella superficie para elevar tumor para tener mejor acceso sin tocar el tumor (véase la Figura 2B).
- Utilice una disección roma con pinzas de masa tumoral libre de la pared peritoneal y de la piel (Ver Figura 2C) con suavidad.
- transferencia de masa tumoral con una pinza a vidrio estéril placa de Petri (NO use platos de plástico impide la rotura en picado) y desechar correctamente la canal y colocar estos instrumentos a un lado.
- Utilice un nuevo conjunto de instrumentos estériles (con bisturí # 11 cuchillas, pinzas de semi-curvas) para desbridar el tejido tumoral de tejido necrótico y anfitrión membranosa tejido conectivo que cubre tumoral.
- Coloque la solución 15 ml de enzima en una trypsinizing ventilado matraz estéril con una barra de agitación y comenzar a agitar lentamente en el capó.
- En un vaso placa de Petri estéril, lavar tumores recogidos 3 - 5 veces con PBS estéril para eliminar el exceso de sangre (puede verter o utilizar jeringa para enjuagarlos con el PBS). Incline suavemente el plato y la pipeta o aspirar el material de lavado. Pique la finely usando dos hojas de bisturí # 11 (Ver Figura 2D).
- Añadir 14 ml de solución de enzima de tumor triturado y pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo 2 - 3 veces. Transfiera la mezcla a ventila-trypsinizing frasco y agitar lentamente durante 20 minutos. Preparar 5 50 tubos cónicos ml mediante la adición de 1,5 ml a cada FBS con el fin de neutralizar la tripsina en el paso 1.2.11.
- Después de 20 min, recoger 14 ml de solución de células del frasco tripsinización y añadir a un tubo con FBS. Añadir solución de enzima fresca 14 ml al matraz y seguir removiendo.
- Centrifugar recogió células a 150 xg durante 8 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Añadir 45 ml de NBM completa al sedimento, mezclar suavemente, y repetir la centrifugación para enjuagar el suero. Vuelva a suspender sedimento en 5 ml de NBM completa y mantener en hielo.
- Repita los pasos de la cosecha de células para un total de 5 cosechas, combinando todas las células cosechadas en un solo tubo cónico en hielo.
- Colocar un filtro de células de 40 micras en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml. Prep tél célula colador pasando 10 ml de DMEM / F12 + 7% de FBS y luego a través de un lavado con 10 ml de PBS.
- Agregar lentamente la suspensión de células a filtro, permitiendo que gotee a través de (Ver Figura 2 M). Levantar ligeramente la lengüeta de la filtro de células entre cada nueva adición a romper cualquier vacío y permitir que las células suspendidas pasen libremente (Ver Figura 2 N).
- Centrifugar la suspensión celular se filtró como anteriormente. Vuelva a suspender en 10 ml completa NBM y contar para determinar el número total de células viables utilizando 0,04% de azul de tripano y un hemocitómetro. Mantenga células en hielo hasta que la generación microtumor.
2. Tejido alternativo Protocolo de desagregación
- Automatizada disociador de tejido y sistema de desagregación.
- Se coloca el tubo en el disociador desagregación celular, seleccionar el programa "Tumor _02_02" y pulse inicio y una duración de 32 seg. tubo de transferencia de los rotadores, lugar en el incubador a 37ºC durante 40 min.
- Centrifugar las células suspendió-a 150 xg durante 8 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Mientras centrifugación de las células, configurar los reactivos para el procesamiento de la suspensión celular. Añadir 10 ml de NBM libre de suero y la suspensión se tritura suavemente.
- Después de la centrifugación, obtener un pellet de células que contiene ~ 10 - 30 x 10 6 células viables (~ 0,3 ml). Resuspendió el sedimento en 10 ml NBM libre de suero (Ver Figura 2O). Determinar las células viables por exclusión de ensayo (véase el paso 3.2.2).
3. Generación microtumor
- Preparación de los reactivos
- Preparar completa NBM como en 1.1.4 y preparar neutralizado biogel de alta densidad humana (HuBiogel) (HDHG a 3 mg / ml) según el protocolo interno. matrices Biogel similares se pueden utilizar también.
- Microtumor Producción y Cultura
- PDX obtener células recién disociadas como suspensión de células individuales en completa NBM, en el hielo.
- Mezclar la célula suspension con un volumen igual de solución de azul de tripano (0,4% en PBS) y analizar utilizando hemocitómetro para determinar el número de células y la viabilidad mediante exclusión con azul de tripano 18. Retire volumen necesario para generar 50.000 células / microtumor donde el volumen = (50.000 células / tumor * # tumores) / (recuento de células viables / 1 ml) y se coloca en un tubo cónico fresco.
- Concentrar las células por centrifugación a 150 xg, durante 8 min, a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular con solución HDHG enfriado con hielo en una relación final de 1 células de pieza en FBS y 4 partes HDHG.
- Utilice una pipeta multicanal electrónica para dispensar 10 l por pin mezcla de células-HDHG sobre una placa de acero de 96 pines (con recubrimiento hidrófobo) para generar microtumores (2 mm perlas que contienen cada 50.000 células).
- Coloque perlas tumorales 3D dentro de la incubadora de cultivo de tejidos (37 ° C, 5% de CO 2 humidificado) durante 15 min a gelificar las perlas.
- Después de la gelificación, transferir los microtumores (10 μ; L) a una cámara de cultivo en suspensión a medida (50 ml) o placa de cultivo de gran volumen (10 cm) que contiene completa NBM usando la pipeta multicanal electrónica y la costumbre pin-dispositivo.
- Después de 1 - 2 días en una incubadora de cultivo de tejidos, transferir microtumores a placas de cultivo de 96 pocillos que contenían bien utilizando una amplia boca de dispensación de la pipeta y realizar diversos protocolos de 50 l NBM / ensayo y análisis.
- Tratamiento y Mantenimiento de microtumores
- Seleccionar concentraciones finales de las pruebas de drogas.
NOTA: Si el fármaco ha conocido la eficacia en la cultura 2D, seleccione 2x la IC50 como la concentración de dosis media y seleccionar 3 veces diluciones seriadas arriba y abajo por un total de 5 niveles de dosis. Por ejemplo, si el IC 50 es 9 mu M para el fármaco en cultivo 2D, seleccione 2 M, 6 M, 18 mM, 54 mM y 162 mM como concentración final para las pruebas de drogas. - Preparar la solución de la dosificación del fármaco 2x en completa NBM sulfoxi de dimetilode (DMSO) stock. Diluir la solución de dosificación en un medio de DMSO al 1% para preparar una dosis de 5, dilución en serie de 3 veces.
- Añadir 50 l de solución de dosificación a la microtumor pocillos que contiene 50 l en placas de ensayo para conseguir una concentración final de DMSO del 0,5%. Repita este procedimiento para cada réplica (por ejemplo, 4) en cada dosis de fármaco determinado en el apartado 3.3.1.
- Mantener los cultivos en 37 ° C, 5% de CO2, humidificado incubadora de cultivo de tejidos para 1 - 14 días. culturas de alimentación dos veces por semana mediante la actualización de los medios de comunicación y solución de fármaco como anteriormente.
- Seleccionar concentraciones finales de las pruebas de drogas.
4. morfológica y análisis fenotípico de microtumores
- Determine la morfología celular en microtumores mediante la tinción de células vivas estándar.
- Preparar 1 mM de calceína-AM en DMSO. Alícuota y almacenar a -20 ° C.
- A intervalos de cultivo deseadas (1, 7 y 14 días), agregue la solución de calceína-AM preparado en PBS (sin Ca / Mg) de placa de 96 pocillos durante 1 mM concentración final.
- Incubar20 min en un 37 ° C, 5% de CO 2, incubador humidificado, y la imagen utilizando un microscopio de fluorescencia a 2X, 4X, y 10 veces (excitación: 450 a 490 de paso de banda nm, emisión: 515 nm de largo pasa, dicroicas 500 nm) .
- Microtumor Crecimiento Ensayo / Proliferación
- Disuelva el polvo de MTT en PBS (sin Ca / Mg) para preparar de stock 12 mM. Filtro estéril, alícuota y se almacena a -20 ° C.
- A intervalos deseados de cultivo (1, 7, y 14 días), se añaden 20 l de solución de MTT a placa de 96 pocillos por 100 l de volumen de cultivo. Incubar 2 horas en una incubadora de cultivo de tejidos.
- Preparar la solución de lisis fresca de SDS al 10% en HCl 0,01 M y añadir una cantidad igual al volumen de cultivo de placas. Incubar las placas selladas durante la noche en 37 ° C incubadora.
- Leer la absorbancia a 570 nm usando un lector de placas múltiples.
- Microtumor preparación para el análisis Kinomic
- Preparar tampón de lisis por pre-refrigeración a 4 ° C y luego la adición de una proporción de 1: 100 de cada uno de 100x Proproteína fosfatasa inhibidor (PPI) y 100x proteína inhibidor de la proteasa (PI). Mezclar bien y mantener en hielo.
- Transfer 2 microtumores a cada uno de tres 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Eliminar el sobrenadante y añadir 40 l de tampón de lisis que contiene PPI y PI a cada tubo y se lisan durante 30 min a 4 ° C.
- muestras de pipeta vigorosamente para romper los granos tumorales. Centrifugar a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C las muestras y se almacena a -80 ° C hasta su análisis kinomic.
5. Kinomic perfiles de microtumores
- Proteína tirosina quinasa (PTK) de perfiles
- Reactivos Descongelar (10x proteína quinasa (PK) de amortiguación y 2% de albúmina de suero bovino (BSA)) a un tampón de 4 ° C de carga PK (300 l 10x PK reserva de estabilización en 2,7 ml dH 2 O) en la jeringa en la posición # 2 en el perfilado plataforma.
- Abra el programa de software de ensayo de quinasa y cargar el archivo de protocolo PTK y pulse "START", la anotación de las muestras dentro de softwson chips de programa después de escaneo. Coloque las fichas en la plataforma de perfiles y la carga de 25 l de 2% de albúmina sérica bovina (BSA) por matriz y luego pulse Cargar para iniciar el protocolo de software controlado por el bloqueo de paso.
- Diluir 6 M de ATP 100 mM con 54 l de dH2O para hacer 10 mM de trifosfato de adenosina (ATP). Cuando el software se inicia la 3ª y la etapa final de lavado (visible en la pantalla) poner 15 g de lisado trajo hasta 28 l con H2O destilada, mezclar y añadir a la matriz.
- Preparar PTK mezcla maestra (MM) (para un máximo de 12 muestras). Añadir 32,6 l H2O destilada para reconstituir ditiotreitol (DTT) y añadir 6 l de DTT, y 60 l de 10x PK solución, al tubo de PTK-MM1 (ya contiene 60 l de 10x BSA).
- Espere hasta pronta "Load" en el software de ensayo de quinasa aparece a continuación, añadir 126 l de PTK-MM1, 60 l aditivo PTK, y 60 l 10 mM ATP para MM2 (contiene previamente alícuotas 4,5 l de anticuerpo PY20 FITC) y mezclar.Añadir 16 l de esta mezcla maestra PTK a cada tubo de lisado de la muestra y la mezcla de pipeta de 5 veces.
- Asegúrese de cubierta de vidrio es limpio y luego añadir 35 l de lisado / mezcla maestra por matriz, cierre la tapa del carrusel, y pulse el botón LOAD.
- Serina / treonina quinasa (STK) Profiling:
- Descongelar los reactivos (10x tampón PK, 10x tampón STK, y 2% de BSA) a 4 ° C. Tampón de carga PK (300 l en 2,7 ml de dH 2 0) en su posición jeringa # 1, 1:10 y tampón STK (300 l en 2,7 ml de dH 2 0) en la jeringa posición # 2.
- Abra el programa de computadora ensayo de quinasa y cargar el archivo de protocolo STK y pulse START, la anotación de muestras dentro del programa de exploración después de virutas. Coloque las fichas en la plataforma de carga de perfiles y 25 l de BSA al 2% por matriz, y luego pulse Cargar para iniciar el protocolo de bloqueo de paso controlado por software.
- Diluir 6 M de ATP 100 mM con 54 l de dH2O Durante final (3ª) mezcla etapa de lavado2 g de lisado y llevar hasta 32,6 l con H2O destilada, mezclar y añadir a la matriz.
- Hacer STK mezcla maestra: Añadir 70 l de 10x PK al tubo STK-MM1 (contiene 7 l 100x BSA), y luego añadir 42 l de dH2O al tubo STK-MM1.
- Espere hasta pronta "Load" en el software de ensayo de quinasa a continuación: Añadir 18 l de ATP 10 mM a STK-MM1, y añadir MM1 9 l de cada lisado de la muestra. Mezclar bien.
- Asegúrese de cubierta de vidrio es limpio y añadir 35 l de lisado / mezcla maestra por matriz, cierre la tapa del carrusel y pulse CARGA.
- Durante final (3ª) Lavar Paso añadir anticuerpo secundario 1,05 l STK-FITC al tubo DMAB (contiene 3,03 l STK mezcla anticuerpo primario), añadir 39,6 l AB Buffer de DMAB, agregar 356,0 l de dH2O a DMAB, añadir 30 l de DMAB para cada matriz, y pulse CARGA .
- Análisis de datos Kinomic 19,20
- El software de análisis abierto y cargar la imagen Análisis de la aplicación. Select carpeta de imágenes que contiene imágenes de la matriz entera con código de barras y con fecha y hora para PTK o STK datos, número que coincide archivo de capa del conjunto selecto artículo (86312 para PTK y 87102 para STK), y la carga generada previamente matriz anotación de archivos.
- Verificar la correcta grillado de todas las imágenes, y correr el tiempo de exposición Escala de aplicaciones. Comparar estadísticamente los valores log2 transformado exposición / pendiente, y validar con prelavado curvas cinéticas 19-21.
- Ejecutar software de predicción de quinasa aguas arriba para consultar perfiles alterados kinomic entre las condiciones para las quinasas aguas arriba 22,23.
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Resultados
Hemos demostrado que el sistema de cultivo Biogel 3D apoya el crecimiento a largo plazo y la función de múltiples tipos de células. En este proyecto de colaboración, xenolines GBM derivadas del paciente (PDX) se utilizan para la producción de cientos de microtumores. Células disociadas (3 x 10 5) o neuroesferas (40 - 50) fueron incorporados en los granos Biogel (2 mm) y después de la gelificación rápida que se cultivan en un biorreactor de encargo NB-media llena. Se determinar...
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Discusión
Los pasos críticos en el protocolo predominantemente refieren a microtumor generación, así como la dosificación del fármaco y el mantenimiento. Debido a que las cuentas microtumor son frágiles y fácilmente desgarrado, es necesario tener cuidado extremo en ambas etapas de desarrollo de un ensayo y mantenimiento. Si se produce un error durante cualquiera de estos procesos, la interpretación experimental puede verse comprometida, provocando la extensión o la repetición innecesaria de los experimentos o incluso la exclusión...
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Divulgaciones
R.S. y R.S.S. son empleados de Vivo Biosciences. J.C.A. está parcialmente financiado por UAB Kinome Core.
Agradecimientos
Apoyado por el NIH subvención R21 (PI: C. Willey, CA185712-01), Brain Tumor premio de esporas (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) y el contrato SBIR (PI: R. Singh, N43CO-2.013 a 00.026).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Colagenasa-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Tripsina EDTA (10x) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Suplemento | Life Technologies | 17502-048 | 1x concentración final |
| B-27 Suplemento sin Vitamina A | Life Technologies | 12587-010 | 1x concentración final |
| FGF humano recombinante-básico | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng/ml concentración final |
| EGF humano recombinante | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/ml concentración final |
| L-Glutamina | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM concentración final |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 µ concentración final g/ml |
| Penicilina Estreptomicina | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/ml Penicilina G, 100 y micro; g/ml Concentración final de estreptomicina |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/ml concentración final |
| MTT | Life Technologies | M6494 | preparado a 5 mg/ml en PBS y filtrado estéril, 1 mg/ml en pocillo |
| SDS | Fisher | BP166 | para tampón de lisis MTT, preparado al 10% en 0,01 M HCl, 5% en el pozo |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | para tampón de lisis MTT, preparado para 0.01 M con SDS, 5 mM en pozo |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM en stock DMSO, 2 y micro; M en solución de tinción PBS, 1 y micro; M en pozo |
| Halt' s Cóctel de inhibidores de la proteína fosfatasa | Pierce ThermoScientific | 78420 | Relación 1:100 en MPER |
| Inhibidor de la proteasa proteasa de Halt | Pierce ThermoScientific | 87786 | Proporción 1:100 en MPER |
| Reactivo de extracción de proteínas de mamíferos (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Azul de tripano | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | para la disolución de calceína AM y compuestos |
| Solución salina tamponada con fosfato sin Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluido a 1x con agua ultrapura MiliQ y filtrado estéril (para cultivo celular) |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco con Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluida a 1x con agua ultrapura MiliQ (para lavado previo a la fijación) |
| 10% Protocolo de formalina tamponada neutra | 032-060 | ||
| Azul Trypan | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| Hubiogel de alta densidad | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Inhibidor de la proteína fosfatasa de Halt | Pierce | 78420 | |
| Inhibidor de la proteasa de Halt | Pierce | 87786 | |
| Reactivo de extracción de proteínas de mamíferos (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Matriz de proteína tirosina quinasa (PTK) Chip de perfilado | PamGene | 86312 | |
| Tampón de quinasa PTK | PamGene | 36000 | 300 µ l 10x PK stock de reserva en 2.7 ml dH2O, número de catálogo para el kit de reactivos PTK |
| ATP | PamGene | 36000 | para el kit de reactivos PTK |
| PY20- Anticuerpo conjugado con FITC Número de | PamGene | 36000 | para kit de reactivos PTK |
| Aditivo PTK | PamGene | 32114 | |
| Tubo PTK-MM1 (10x BSA)Número de | PamGene | 36000 | para kit |
| de reactivos PTKMatriz de serina/treonina quinasa (STK) Chip de perfilado | PamGene | 87102 | |
| Tampón de quinasa STK | PamGene | 32205 | para kit de reactivos STK |
| Mezcla de anticuerpos primarios STK (tubo DMAB) | PamGene | 32205 | para kit de reactivos STK |
| Anticuerpo secundario conjugado con FITC | Tubo PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 (100x BSA) | PamGene | 32205 | Número de catálogo para el kit de reactivos STK |
| Tampón de anticuerpos STK | PamGene | 32205 | Número de catálogo para el kit de reactivos STK |
| Equipo | |||
| #11 Cuchillas, estériles | Fisher | 3120030 | |
| #3 mangos de bisturí, estériles | Fisher | 08-913-5 | |
| Placas de Petri de vidrio de 100 mm | Fisher | 08-748D | |
| Pinza semicurvada | Fisher | 12-460-318 | |
| Matraz tripsinizante | Fisher | 10-042-12B | |
| Agitador magnético | Fisher | 14-490-200 | |
| 3/4" | Fisher | 14-512-125 | |
| B-D colador de celdas | Fisher | #352340 | |
| B-D 50 ml Tubo de centrífuga | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 software de análisis cinómico | |||
| PamGene | |||
| UpKin (predicción de quinasa aguas arriba) | PamGene | ||
| gentleMACS Disociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Sistema de cultivo celular rotatorio (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | con HARV desechable de 10 ml |
Referencias
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