Los xenoinjertos derivados del paciente de glioblastoma multiforme pueden miniaturizarse en microtumores vivos utilizando un sistema de cultivo de biogel humano en 3D. Este ensayo tumoral 3D de tipo in vivo es adecuado para las pruebas de respuesta a fármacos y la elaboración de perfiles moleculares, incluido el análisis cinómico.
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Artículo de método
Generación de microtumores Uso Humano 3D Biogel sistema de cultivo y las células de glioblastoma derivados de los pacientes para Kinomic de perfiles y pruebas de respuesta a los fármacos
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Resumen
Resumen
El uso de xenoinjertos derivados de pacientes para modelar cánceres ha proporcionado información importante sobre la biología del cáncer y la capacidad de respuesta a los fármacos. Sin embargo, requieren mucho tiempo, son costosos y requieren mucha mano de obra. Para superar estos obstáculos, muchos grupos de investigación han recurrido a cultivos esferoides de células cancerosas. Si bien son útiles, los esferoides tumorales o agregados no replican las interacciones célula-matriz como se encuentran in vivo. Como tal, los enfoques de cultivo tridimensional (3D) que utilizan un andamio de matriz extracelular proporcionan un sistema de modelos más realista para la investigación. A partir de xenoinjertos subcutáneos o intracraneales, el tejido tumoral se disocia en una suspensión de una sola célula similar a las neuroesferas de células madre cancerosas. A continuación, estas células se incrustan en una matriz extracelular derivada del ser humano, el biogel humano 3D, para generar un gran número de microtumores. Curiosamente, los microtumores se pueden cultivar durante aproximadamente un mes con alta viabilidad y se pueden utilizar para pruebas de respuesta a fármacos mediante ensayos de citotoxicidad estándar como el bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) y la obtención de imágenes de células vivas mediante Calcein-AM. Además, pueden analizarse mediante inmunohistoquímica o recolectarse para la elaboración de perfiles moleculares, como el perfil cinómico de alto rendimiento basado en matrices, que también se detalla aquí. Por lo tanto, los microtumores 3D representan un sistema modelo versátil de alto rendimiento que puede replicar más de cerca la biología tumoral in vivo que los enfoques tradicionales.
Introducción
Los tumores cerebrales primarios más comunes intracraneales malignos son astrocitomas de grado III y grado IV glioblastoma multiforme (glioblastoma). Estos tumores se ofrecen con peor pronóstico de supervivencia a un año de media entre 12 - 15 meses, con las terapias actuales para GBM en el 1-3 de Estados Unidos. terapias multimodales son la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia que incluye temozolomida (TMZ) y agentes quinasa específica. la señalización de la quinasa con frecuencia se desregula en GBM, incluyendo subgrupos de tumores con amplificación o la activación de mutaciones en el factor de crecimiento epidérmico (EGFR), el aumento de....
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Protocolo
NOTA: Todas las evaluaciones de terapia de xenoinjertos se realizaron utilizando un modelo de tumor ortotópico para el glioblastoma en un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional.
1. Aislamiento de células GBM xenoinjertos derivados de los pacientes
- Preparación de los reactivos
- Re-constituir colagenasa-I en agua estéril a una concentración de 5 mg / ml de filtro y estéril. Almacenar en alícuotas de 1 ml a -20 ° C (concentración final es de 50 mg / ml en solución de enzima 100 ml).
- Disolver 100 g Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) en 2 ml estéril tamponad....
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Resultados
Hemos demostrado que el sistema de cultivo Biogel 3D apoya el crecimiento a largo plazo y la función de múltiples tipos de células. En este proyecto de colaboración, xenolines GBM derivadas del paciente (PDX) se utilizan para la producción de cientos de microtumores. Células disociadas (3 x 10 5) o neuroesferas (40 - 50) fueron incorporados en los granos Biogel (2 mm) y después de la gelificación rápida que se cultivan en un biorreactor de encargo NB-media llena. Se determinar.......
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Discusión
Los pasos críticos en el protocolo predominantemente refieren a microtumor generación, así como la dosificación del fármaco y el mantenimiento. Debido a que las cuentas microtumor son frágiles y fácilmente desgarrado, es necesario tener cuidado extremo en ambas etapas de desarrollo de un ensayo y mantenimiento. Si se produce un error durante cualquiera de estos procesos, la interpretación experimental puede verse comprometida, provocando la extensión o la repetición innecesaria de los experimentos o incluso la exclusión.......
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Divulgaciones
R.S. y R.S.S. son empleados de Vivo Biosciences. J.C.A. está parcialmente financiado por UAB Kinome Core.
Agradecimientos
Apoyado por el NIH subvención R21 (PI: C. Willey, CA185712-01), Brain Tumor premio de esporas (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) y el contrato SBIR (PI: R. Singh, N43CO-2.013 a 00.026).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Colagenasa-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Tripsina EDTA (10x) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Suplemento | Life Technologies | 17502-048 | 1x concentración final |
| B-27 Suplemento sin Vitamina A | Life Technologies | 12587-010 | 1x concentración final |
| FGF humano recombinante-básico | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng/ml concentración final |
| EGF humano recombinante | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/ml concentración final |
| L-Glutamina | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM concentración final |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 µ concentración final g/ml |
| Penicilina Estreptomicina | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/ml Penicilina G, 100 y micro; g/ml Concentración final de estreptomicina |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/ml concentración final |
| MTT | Life Technologies | M6494 | preparado a 5 mg/ml en PBS y filtrado estéril, 1 mg/ml en pocillo |
| SDS | Fisher | BP166 | para tampón de lisis MTT, preparado al 10% en 0,01 M HCl, 5% en el pozo |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | para tampón de lisis MTT, preparado para 0.01 M con SDS, 5 mM en pozo |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM en stock DMSO, 2 y micro; M en solución de tinción PBS, 1 y micro; M en pozo |
| Halt' s Cóctel de inhibidores de la proteína fosfatasa | Pierce ThermoScientific | 78420 | Relación 1:100 en MPER |
| Inhibidor de la proteasa proteasa de Halt | Pierce ThermoScientific | 87786 | Proporción 1:100 en MPER |
| Reactivo de extracción de proteínas de mamíferos (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Azul de tripano | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | para la disolución de calceína AM y compuestos |
| Solución salina tamponada con fosfato sin Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluido a 1x con agua ultrapura MiliQ y filtrado estéril (para cultivo celular) |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco con Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluida a 1x con agua ultrapura MiliQ (para lavado previo a la fijación) |
| 10% Protocolo de formalina tamponada neutra | 032-060 | ||
| Azul Trypan | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| Hubiogel de alta densidad | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Inhibidor de la proteína fosfatasa de Halt | Pierce | 78420 | |
| Inhibidor de la proteasa de Halt | Pierce | 87786 | |
| Reactivo de extracción de proteínas de mamíferos (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Matriz de proteína tirosina quinasa (PTK) Chip de perfilado | PamGene | 86312 | |
| Tampón de quinasa PTK | PamGene | 36000 | 300 µ l 10x PK stock de reserva en 2.7 ml dH2O, número de catálogo para el kit de reactivos PTK |
| ATP | PamGene | 36000 | para el kit de reactivos PTK |
| PY20- Anticuerpo conjugado con FITC Número de | PamGene | 36000 | para kit de reactivos PTK |
| Aditivo PTK | PamGene | 32114 | |
| Tubo PTK-MM1 (10x BSA)Número de | PamGene | 36000 | para kit |
| de reactivos PTKMatriz de serina/treonina quinasa (STK) Chip de perfilado | PamGene | 87102 | |
| Tampón de quinasa STK | PamGene | 32205 | para kit de reactivos STK |
| Mezcla de anticuerpos primarios STK (tubo DMAB) | PamGene | 32205 | para kit de reactivos STK |
| Anticuerpo secundario conjugado con FITC | Tubo PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 (100x BSA) | PamGene | 32205 | Número de catálogo para el kit de reactivos STK |
| Tampón de anticuerpos STK | PamGene | 32205 | Número de catálogo para el kit de reactivos STK |
| Equipo | |||
| #11 Cuchillas, estériles | Fisher | 3120030 | |
| #3 mangos de bisturí, estériles | Fisher | 08-913-5 | |
| Placas de Petri de vidrio de 100 mm | Fisher | 08-748D | |
| Pinza semicurvada | Fisher | 12-460-318 | |
| Matraz tripsinizante | Fisher | 10-042-12B | |
| Agitador magnético | Fisher | 14-490-200 | |
| 3/4" | Fisher | 14-512-125 | |
| B-D colador de celdas | Fisher | #352340 | |
| B-D 50 ml Tubo de centrífuga | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 software de análisis cinómico | |||
| PamGene | |||
| UpKin (predicción de quinasa aguas arriba) | PamGene | ||
| gentleMACS Disociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Sistema de cultivo celular rotatorio (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | con HARV desechable de 10 ml |
Referencias
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults.....
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Reimpresiones y permisos
