El líquido biliar es una valiosa fuente de vesículas/exosomas extracelulares que contienen biomarcadores potencialmente importantes. Este protocolo representa un método sólido para aislar exosomas de la bilis humana para análisis posteriores, incluido el perfil de miARN.
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Artículo de método
El aislamiento y la generación de perfiles de exosomas de la bilis humana que contiene microRNA
En este artículo
Resumen
Resumen
exosome la investigación en los últimos tres años ha ampliado considerablemente el alcance hacia la identificación y caracterización de biomarcadores y sus usos terapéuticos.
Los exosomas han sido recientemente demostrado que contienen microRNAs (MIR). MIRS mismos han surgido como biomarcadores valiosos para fines de diagnóstico. Como la recogida de muestras en clínicas y hospitales es bastante variable, miARN aislamiento de la bilis toda varía sustancialmente. Para lograr perfiles de miARN robustos, precisos y reproducibles de muestras de bilis recogidos de una manera sencilla requerido el desarrollo de un protocolo de alta calidad para aislar y caracterizar los exosomas de la bilis. El método requiere varias centrifugaciones y una etapa de filtración con una etapa de ultracentrifugación final para sedimentar las exosomas aisladas. La microscopía electrónica, transferencias Western, citometría de flujo y análisis óptico de nanopartículas de múltiples parámetros, si están disponibles, son pasos cruciales para validar la caracterización de la calidad del correoxosomes. Para el aislamiento de los genes miARN de estos exosomas, Rematar el lisado con una, miRNA sintético no específica de una especie como Caenorhabditis elegans, es decir, Cel-miR-39, es importante para la normalización de la eficacia de la extracción de ARN. El aislamiento de exosomas del líquido biliar siguiendo este método permite que el éxito miARN perfiles de las muestras de bilis acumulada durante varios años a -80 ° C.
Introducción
Al igual que otros fluidos biológicos, es decir, la leche materna, plasma u orina, bilis contiene lípidos exosomas, vesículas ricas 1-4. Los exosomas pueden inducir o alterar las funciones biológicas en células receptoras 5, 6, una forma de comunicación célula-célula que podría ser parte de su función normal 4, 7-9. Los exosomas pueden contener especies miARN que pueden proporcionar una valiosa fuente de biomarcadores para el diagnóstico 10. perfiles de miRNAs han ganado considerable atención en los últimos años como marcadores de diagnóstico y pronóstico para una variedad de enfermedades 11-14.
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Protocolo
La obtención de la bilis de pacientes por la colangiopancreatografía retrógrada endoscópica (CPRE) requiere la aprobación de un protocolo de estudio los sujetos humanos por la Junta de Revisión Institucional. Todo el trabajo que aquí se presenta ha sido aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Johns Hopkins.
1. Aislamiento de exosomas de la bilis
- Realizar la colangiopancreatografía retrógrada endoscópica (CPRE). Colocar al paciente en posición supina y intubar.
- Pasar un duodenoscopio a través de la boca del paciente y la inserta en la segunda parte del duodeno e identificar la papila mayor.
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Resultados
Desde exosomas son demasiado pequeños para ser detectados por microscopía regular o citometría de flujo, microscopía electrónica o análisis óptico de nanopartículas tiene que ser realizada. El análisis óptico de nanopartículas tiene la ventaja sobre la microscopía electrónica que también es cuantitativa y proporciona distribución de tamaño y la concentración. El instrumento presenta un haz de láser finamente enfocada a través de un prisma de cristal en la muestra. El movimiento browniano.......
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Discusión
Para utilizar de forma fiable exosomas aisladas de la bilis, es importante emplear los métodos de aislamiento de alta calidad consistentes para obtener muestras de alta calidad a cambio. La metodología definida en este trabajo es una manera bien establecida para aislar los exosomas y miARN de la bilis humana. En él se destacan varios pasos cruciales en la caracterización de los exosomas aisladas que como mínimo deberían formar parte de microscopía electrónica de análisis óptico o de nanopartículas y transferencias de We.......
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Divulgaciones
Ninguno de los autores tiene intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este estudio fue respaldado por un Premio K08 (DK090154-01) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH; a F.M.S.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,2 y micro; m Filtro de membrana de polietersulfona (PES) | Corning | 431229 | |
| tubos ultracentrífugos de polialómero de pared delgada | Rotor Beckman Coulter | 331374 | |
| SW40Ti | Beckman Coulter | ||
| LM10-HS | Software de | ||
| Nanosight | |||
| mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
| Inhibidor completo de la proteasa | Roche distribuido por Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
| Anticuerpo anti-CD63 | Abcam | ab59479 | |
| Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |
Referencias
- Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
- Aushev, V. N., et al. Comparisons of microRNA patterns in plasma before ....
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Reimpresiones y permisos
