El aislamiento y la generación de perfiles de exosomas de la bilis humana que contiene microRNA

Resumen

El líquido biliar es una valiosa fuente de vesículas/exosomas extracelulares que contienen biomarcadores potencialmente importantes. Este protocolo representa un método sólido para aislar exosomas de la bilis humana para análisis posteriores, incluido el perfil de miARN.

Resumen

exosome la investigación en los últimos tres años ha ampliado considerablemente el alcance hacia la identificación y caracterización de biomarcadores y sus usos terapéuticos.

Los exosomas han sido recientemente demostrado que contienen microRNAs (MIR). MIRS mismos han surgido como biomarcadores valiosos para fines de diagnóstico. Como la recogida de muestras en clínicas y hospitales es bastante variable, miARN aislamiento de la bilis toda varía sustancialmente. Para lograr perfiles de miARN robustos, precisos y reproducibles de muestras de bilis recogidos de una manera sencilla requerido el desarrollo de un protocolo de alta calidad para aislar y caracterizar los exosomas de la bilis. El método requiere varias centrifugaciones y una etapa de filtración con una etapa de ultracentrifugación final para sedimentar las exosomas aisladas. La microscopía electrónica, transferencias Western, citometría de flujo y análisis óptico de nanopartículas de múltiples parámetros, si están disponibles, son pasos cruciales para validar la caracterización de la calidad del correoxosomes. Para el aislamiento de los genes miARN de estos exosomas, Rematar el lisado con una, miRNA sintético no específica de una especie como Caenorhabditis elegans, es decir, Cel-miR-39, es importante para la normalización de la eficacia de la extracción de ARN. El aislamiento de exosomas del líquido biliar siguiendo este método permite que el éxito miARN perfiles de las muestras de bilis acumulada durante varios años a -80 ° C.

Introducción

Al igual que otros fluidos biológicos, es decir, la leche materna, plasma u orina, bilis contiene lípidos exosomas, vesículas ricas ^1-4. Los exosomas pueden inducir o alterar las funciones biológicas en células receptoras ^{5, 6,} una forma de comunicación célula-célula que podría ser parte de su función normal ^{4, 7-9.} Los exosomas pueden contener especies miARN que pueden proporcionar una valiosa fuente de biomarcadores para el diagnóstico ^10. perfiles de miRNAs han ganado considerable atención en los últimos años como marcadores de diagnóstico y pronóstico para una variedad de enfermedades ^11-14.

sí miARN puede encontrarse en fluidos biológicos, posiblemente liberada por las células muertas y la cantidad de células que se desprenden pueden ser influenciados en gran medida por una enfermedad subyacente. El perfil de miARN de exosomas no refleja necesariamente el perfil de miRNA de las células originarias ^{6, 10, 15-17,} sin embargo, puede llevar a exosomas firmas de miARN que podrían ser característico de la CE de los padreste gusta una célula tumoral. Exosomas derivado de un tumor se han identificado en el plasma de pacientes con adenocarcinoma de pulmón, cáncer de próstata y otros tumores ^{8, 16, 18.}

El objetivo de este método es el aislamiento fiable y robusto de exosomas de muestras biliares humanos, en gran parte independientes de sus procedimientos de manipulación anteriores. Fue desarrollado para utilizar bilis como una fuente fiable de miARN para el diagnóstico potencial de las enfermedades de las vías biliares tales como colangiocarcinoma ^19. Consta de varias etapas de centrifugación con el aumento de las velocidades de aislar exosomas y podría ser aplicable a otros fluidos biológicos.

Protocolo

La obtención de la bilis de pacientes por la colangiopancreatografía retrógrada endoscópica (CPRE) requiere la aprobación de un protocolo de estudio los sujetos humanos por la Junta de Revisión Institucional. Todo el trabajo que aquí se presenta ha sido aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Johns Hopkins.

1. Aislamiento de exosomas de la bilis

1. Realizar la colangiopancreatografía retrógrada endoscópica (CPRE). Colocar al paciente en posición supina y intubar.
   1. Pasar un duodenoscopio a través de la boca del paciente y la inserta en la segunda parte del duodeno e identificar la papila mayor.
   2. Selectivamente canular el conducto biliar común mediante la inserción de un triple lumen esfinterotomo pre-cargado con una guía hidrofílica 0,035 pulgadas (0,9 mm).
   3. Avanzar la guía bajo guía fluoroscópica con el conducto hepático izquierdo ya que en ocasiones puede ser difícil diferenciar el conducto cístico desde el conducto hepático derecho, a continuación, hacer avanzar elesfinterótomo 5 cm en el conducto biliar para adquirir una posición estable.
   4. Retire el alambre guía, acople una jeringa de 10 ml al puerto de alambre guía a través del cierre Luer y aspirar la bilis utilizando 10 ml de presión negativa.
   5. Retire la jeringa que contiene la bilis para proceder con la CPRE volviendo a insertar el alambre de guía y el agente de contraste a través de la inyección de la abertura de inyección para opacificar el árbol biliar.
   6. La transferencia de la bilis recogido en un tubo de 15 ml en hielo y mantener en hielo hasta que esté listo para proceder con la etapa de centrifugación.
      Precaución: Use guantes para protegerse y proteger a las muestras! El tratamiento de la bilis como una fuente potencial de infección, ya que puede contener partículas virales de hepatitis A!
   7. Mantenga la muestra (s) en hielo. Cualquiera de proceder con el paso 1.2 o centrifugar a 500 xg a 4 ° C durante 10 min y luego se congelan a -80 ° C hasta su uso posterior.
      Nota: Las muestras almacenadas de esta manera durante varios años de forma rutinaria se han utilizado con buenos resultados ^19.
2. Transferencia de 400 l de bilis en un tubo de microcentrífuga y recoger las células y los restos celulares por centrifugación a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
3. Eliminar el sobrenadante con la pipeta, transferir a un tubo de microcentrífuga fresco y centrifugar la muestra (s) a 16.500 xg durante otros 20 min a 4 ° C para borrar el sobrenadante de desechos adicionales. Desechar los tubos en los residuos de riesgo biológico. Como alternativa, girar las muestras en una ultracentrífuga lugar.
4. Recoger el sobrenadante y filtrar en una cabina de bioseguridad con una jeringa a través de un filtro de membrana de 0,2 micras de polietersulfona (PES) que tiene buenas tasas de flujo y baja en proteínas de unión para eliminar las partículas más grandes que 200 nm fue.
5. Pipetear el sobrenadante se filtró para ultracentrífuga tubos y añadir PBS de modo que los tubos son más de 2/3. Si los tubos contienen menos líquidos que eso, los tubos se derrumbará durante la centrifugación! Los tubos pueden ser lavados, en autoclave y volver a utilizar varias veces.
6. Pelly los exosomas mediante ultracentrifugación a 120.000 xg durante 70 min a 4 ° C. Después de la centrifugación mirada en la parte inferior del tubo de ultracentrífuga para ver a veces pequeñas bolitas amarillas; estos son los exosomas.
7. Eliminar el sobrenadante por decantación con cuidado y desinfectar los residuos mediante la adición de cloro para una concentración final de 10% v / v y se deja reposar durante 20 minutos.
8. Para los experimentos de aguas abajo, o bien procesar la pastilla (s) en un pequeño volumen de la solución apropiada (es decir, ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) tampón para el aislamiento de proteínas, tampón de lisis de ARN para el aislamiento MIR) o resuspender en 50 a 150 l de fosfato tamponada de solución salina (PBS) que puede ser almacenado, ya sea a -80 ° C para su uso futuro (reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) o la extracción de proteínas etc.) o se utiliza para la caracterización de la preparación exosome por TEM o análisis óptico de nanopartículas .

2. Identificación por exosomeMicroscopía Electrónica de Transmisión (TEM) o cryoEM

1. Volver a suspender las vesículas extracelulares en 100 l de PBS con la pipeta. Lo ideal es utilizar exosomas que no han sido almacenadas a -20 ° C o -80 ° C, especialmente cuando se realiza el aislamiento por primera vez.
2. Adsorber una alícuota de 20 l (aproximadamente 2 g) a 400 rejillas de cobre Parlodion recubiertas de carbono de malla durante 2 minutos y dejar secar a temperatura ambiente.
3. Fijar el exosoma en 1% (v / v) de glutaraldehído (EM-grado) durante 5 min a RT mediante la colocación de gotas cuidadosamente sobre la preparación seca.
4. Lavar las rejillas dos veces con agua durante 5 min y luego contrastar EVs mancha con ácido fosfotúngstico al 1% (PTA) durante 30 s.
5. Adquirir imágenes con un microscopio electrónico con un voltaje de aceleración de 80 kilovoltios a partir de las ampliaciones de 20.000X y se eleva a 100,000X al determinar el tamaño de las partículas.
   Nota: Otras preparaciones como capas en 200 rejillas de malla de carbono recubiertos con Formvar de cobre o níquel y li contraste tinciónke 1% o 2% de acetato de uranilo durante 10-15 min también son posibles.
6. Para cryoEM, mezclar una parte alícuota de 20 l (aproximadamente 2 g) con 60 l de proteína G de oro 10 nm (relación 1: 3). Esto ayudará a determinar el diámetro de exosomas.
7. La transferencia de las muestras sobre rejillas de carbón perforado descargada resplandor-C-plana y eliminar el exceso de líquido mediante secado. Congelar las rejillas sumergiéndolos inmediatamente en etano líquido.
8. Montar las rejillas en un cryoholder en nitrógeno líquido.
9. Adquirir las imágenes en 200 kV con magnificaciones de 20.000X y 100,000X.

3. Identificación por exosome multiparámetros de nanopartículas análisis óptico

1. Volver a suspender los exosomas aislados en 100 l de PBS con la pipeta.
2. Diluir exosomas en 600 l de PBS en varias proporciones diferentes (como 1:50, 1: 100, 1: 300, 1: 600 y 1: 1200).
3. Visualizar los exosomas por dispersión de luz láser con el instrumento y el software adecuado en tiempo real de acuerdo con la fabriel protocolo del RER ^20.
4. Aumentar el nivel de la cámara en el modo de captura hasta que las partículas se hacen visibles, a continuación, ajustar el enfoque para hacer que las partículas se vean sin problemas.
5. Mientras que en el modo estándar, disminuir la cámara al nivel más bajo que las partículas todavía pueden verse, si es necesario ajustar obturador de la cámara y la ganancia para lograr esto.
6. una inspección visual para asegurarse de 20-100 partículas son visibles en la pantalla, si no eliminar la unidad y ajustar la dilución en PBS.
7. A continuación, ajuste la duración de captura de entre 30-60 seg. Después de que se capturó el vídeo, ajustar los parámetros de proceso hasta que todas las partículas se clasifican en la pantalla y procesar el archivo de vídeo.

4. Caracterización de exosomas por Western Blot

1. Lyse gránulos de exosoma de 2-5 ml de bilis en 100 l de ensayo de radioinmunoprecipitación enfriado con hielo (RIPA) tampón con un inhibidor de la proteasa pipeteando arriba y abajo a fondo y mezclar lisados ​​vigorosamente durante 30 secen un vórtice para solubilizar las proteínas de manera eficaz.
2. Mientras que la mayoría de las veces no es necesario, utilizar pulsos de sonicación de las muestras en hielo con 2 impulsos de 10 segundos cada uno para asegurar la lisis completa.
3. Se precipitan material insoluble por centrifugación a 15.000 xg a 4 ° C durante 5 min y transferir el sobrenadante a un tubo limpio.
4. Determinar la concentración de proteína con un método de elección (es decir, el ácido bicinconínico (BCA), Coomassie, Lowry modificado, 660 nm de ensayo de proteínas, etc.) según el protocolo del fabricante. El método no es tan importante como el tiempo que se utiliza el mismo método consistente para lograr los resultados que se pueden comparar a través de experimentos.
5. Cargar 50 g de proteína por muestra en tampón de Laemmli después de calentar la muestra a 95 ° C durante 5 min en un pozo de un gel de poliacrilamida para electroforesis (PAGE).
6. La electroforesis de las muestras en los geles PAGE durante 1,5 horas y transferir las proteínas separadas a una membrana de nylon.
7. segundobloquear la membrana (s) con 5% de leche sin grasa en solución salina tamponada con Tris con 0,1% de Tween 20 (TBS-T) durante 1 h, después se incuba con anticuerpos de exosoma específica como anti-CD63 y anti-TSG-101 a una dilución de 1: 500, preferiblemente O / N a 4 ° C.
8. Lavar las membranas con TBS-T 3 x 10 min, a continuación se incuba con un apropiado, búsqueda de anticuerpo secundario conjugado con HRP en 5% de leche sin grasa en TBS-T durante 1-2 horas a temperatura ambiente.
9. Lavar la membrana (s) 3 x 5 min con TBS-T y detectar las proteínas específicas con reactivos de quimioluminiscencia de acuerdo con el protocolo del fabricante.
10. Image las membranas con película o un sistema de imagen digital de acuerdo con el protocolo del fabricante.

5. El microARN aislamiento de los exosomas aislados

Nota: El aislamiento de los genes miARN de exosomas biliares se lleva a cabo utilizando un aislamiento de los genes miARN modificado basado en un kit disponible en el mercado, pero cualquier otro método de aislamiento de ARN puede utilizarse o adaptarse.

1. Añadir 300 y# 181; l tampón de lisis / edificio al sedimento de exosomas (aislado de la bilis 400 l), vórtice, pipeta o pasar a través de una aguja / jeringa para lisar completamente los exosomas para obtener un lisado homogénea.
2. Añadir 1/10 (30 l) volumen de miARN homogeneizado aditivo, y mezclar bien por agitación o invirtiendo el tubo varias veces.
3. Incubar la mezcla durante 10 min en hielo.
4. Añadir un volumen de ácido-fenol: cloroformo igual al homogeneizado inicial (300 l).
5. Añadir 5 l de 5 fmol / l cel-MIR 39 y agitar durante 30-60 segundos.
6. Centrifugar durante 5 min a 10.000 xg a la temperatura ambiente para separar la fase acuosa (superior) y las fases orgánicas (inferiores).
7. aspirar con cuidado la fase superior con la pipeta y transferir a un tubo nuevo al tiempo que observa el volumen transferido. Descartar la fase orgánica en el contenedor de residuos orgánico apropiado.
8. Para enriquecer a los pequeños ARN añaden 1/3 volumen de etanol al 100% a la fase acuosa recuperada y mezclar mediante agitación o invirtiendo muchísimo de la maser varias veces.
9. Pipetear la mezcla de lisado / etanol en el cartucho de filtro, hasta 700 l a la vez.
10. Centrifugar los cartuchos de 15 segundos a un máximo de 10.000 xg o aplicar vacío para pasar la mezcla a través del filtro.
11. Recoger el filtrado y si la mezcla de lisado / etanol es superior a 700 l, transferir el flujo a través de un tubo nuevo y repita el procedimiento para recoger todos los filtrados. Estos filtro contiene fracciones de ARN desprovistos de ARN pequeños y se puede utilizar para recuperar estos ARN de mayor tamaño.
12. Añadir 2/3 volumen de RT 100% de etanol al filtrado total y mezclar bien con un vórtex.
13. Pipetear la mezcla de filtrado / etanol en un segundo cartucho de filtro. Al igual que antes de que el volumen máximo que se puede aplicar a la vez es de 700 microlitros.
14. Centrifugar durante 15 segundos a 10.000 xg o aplicar vacío como se describe en el paso 5.10.
15. Desechar el flujo continuo, y repetir hasta que todos mezcla de filtrado / etanol ha sido filtrada.
16. aplicar 70081; l miARN solución de lavado 1 al cartucho de filtro, se centrifuga durante 5-10 segundos o aplicar vacío y deseche el flujo continuo.
17. Lavar el filtro con 500 l de solución de lavado 2/3 como se hizo en el paso 5.16.
18. Repetir el lavado por segunda vez con 500 l de solución de lavado como en el paso 2/3 5.16, desechar el flujo a través y colocar el filtro en el tubo de recogida.
19. Girar el cartucho de filtro durante 1 min a 10.000 xg para eliminar todo el fluido residual desde el filtro.
20. Transferir el cartucho de filtro en un tubo de recogida fresco y aplicar 100 l de agua libre (95 ° C) nucleasa caliente para el centro del filtro.
21. Girar los montajes de 20-30 segundos a la máxima velocidad para recuperar el ARN.
22. Recoger el eluido y utilizar inmediatamente o almacenar a -80 ° C.

Resultados

Desde exosomas son demasiado pequeños para ser detectados por microscopía regular o citometría de flujo, microscopía electrónica o análisis óptico de nanopartículas tiene que ser realizada. El análisis óptico de nanopartículas tiene la ventaja sobre la microscopía electrónica que también es cuantitativa y proporciona distribución de tamaño y la concentración. El instrumento presenta un haz de láser finamente enfocada a través de un prisma de cristal en la muestra. El movimiento browniano...

Discusión

Para utilizar de forma fiable exosomas aisladas de la bilis, es importante emplear los métodos de aislamiento de alta calidad consistentes para obtener muestras de alta calidad a cambio. La metodología definida en este trabajo es una manera bien establecida para aislar los exosomas y miARN de la bilis humana. En él se destacan varios pasos cruciales en la caracterización de los exosomas aisladas que como mínimo deberían formar parte de microscopía electrónica de análisis óptico o de nanopartículas y transferencias de We...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,2 y micro; m Filtro de membrana de polietersulfona (PES)	Corning	431229
tubos ultracentrífugos de polialómero de pared delgada	Rotor Beckman Coulter	331374
SW40Ti	Beckman Coulter
LM10-HS	Software de
	Nanosight
mirVANA	Life Technologies	AM1560
Inhibidor completo de la proteasa	Roche distribuido por Sigma-Aldrich	4693116001
Immobilon PSQ	Millipore, Bedford MA	ISEQ00010
Anticuerpo anti-CD63	Abcam	ab59479
Anti-Tsg101	Abcam	ab30871