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Artículo de método

La purificación del ARN intracelularmente Grown

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DOI:

10.3791/54044

⸱

4 de junio de 2016

 ,  , 
1The Department of Molecular Microbiology and Biotechnology, The George S. Wise Faculty of Life Sciences, Tel Aviv University

En este artículo

Resumen

Aquí describimos un método para el aislamiento de ARN bacteriano de la bacteria Listeria monocytogenes que crece dentro de macrófagos murinos. Esta técnica se puede utilizar con otros patógenos intracelulares y células huésped de mamíferos.

Resumen

El análisis del transcriptoma de patógenos bacterianos durante la infección en mamíferos es una herramienta valiosa para estudiar genes y factores que median la infección. Sin embargo, aislar el ARN bacteriano de las células o tejidos infectados es una tarea difícil, ya que el ARN de los mamíferos domina principalmente los lisados de las células infectadas. Aquí describimos un método optimizado para el aislamiento de ARN de la bacteria Listeria monocytogenes que crece dentro de células de macrófagos derivadas de la médula ósea. Tras la infección, las células se lisan ligeramente y se filtran rápidamente para descartar la mayoría de las proteínas y el ARN del huésped, al tiempo que conservan las bacterias intactas. A continuación, se aísla el ARN bacteriano mediante extracción de fenol-SDS en caliente seguida de un tratamiento con DNasa. El ARN extraído es adecuado para el análisis de transcripción de genes mediante múltiples técnicas. Este método se emplea con éxito en nuestros estudios de la regulación génica de Listeria monocytogenes durante la infección de células de macrófagos 1-4. El protocolo se puede modificar fácilmente para estudiar otros patógenos bacterianos y tipos de células.

Introducción

Patógenos bacterianos intracelulares ─ bacterias causantes de enfermedades infecciosas y capaz de crecer y reproducirse dentro de las células del huésped humano ─ son un importante problema de salud en todo el mundo 5. Para invadir y replicarse dentro de una célula de mamífero, patógenos intracelulares han adquirido sofisticados mecanismos de virulencia y factores. Aunque estos mecanismos son fundamentales para la capacidad de causar una enfermedad, se sabe poco acerca de su regulación y dinámica. Desde los perfiles de expresión de genes de bacterias cultivadas en medio líquido no reflejan el entorno real dentro de células huésped, hay una necesidad creciente de transcriptoma análisis de bacterias cultivadas en sus nichos intracelulares. Estos análisis permitirán al desciframiento de adaptaciones específicas bacterianas provocadas por el anfitrión y le ayudará a identificar nuevas dianas para el diseño terapéutico. El análisis del transcriptoma de bacterias que crecen de forma intracelular es muy difícil, puesto que superan en número a ARN de mamífero ARN bacteriano por lopor lo menos diez veces. En este manuscrito, se describe un método experimental para aislar el ARN bacteriano de Listeria monocytogenes bacterias que crecen dentro de las células de macrófagos murinos. El ARN extraído se puede utilizar para estudiar las adaptaciones intracelulares y mecanismos de virulencia de las bacterias patógenas por diversas técnicas de análisis de la transcripción, tales como RT-PCR, el ARN-Seq, microarrays y otras tecnologías basadas en hibridación.

L. monocytogenes es el agente causante de la listeriosis en humanos, una enfermedad con manifestaciones clínicas dirigidas principalmente a los individuos inmunocomprometidos, ancianos y mujeres embarazadas 6. Eso es un patógeno intracelular facultativo Gram-positiva que invade una amplia gama de células de mamíferos que se han utilizado durante décadas como modelo en las interacciones huésped-patógeno estudia 7. Tras la invasión, que reside inicialmente en una vacuola o fagosoma (en el caso de las células fagocíticas), de la que debe escapar en tque acogerá citosol de la célula con el fin de replicar. Varios factores de virulencia han demostrado mediar en el proceso de escape, principalmente la hemolisina de formación de poros, listeriolisina O (LLO) y dos fosfolipasas adicionales 8. En el citosol las bacterias utilizan el anfitrión maquinaria polimerización de la actina para impulsarse en los filamentos de actina dentro de la célula y propagarse de célula a célula (Figura 1). Todos los principales factores de virulencia de L. monocytogenes involucrados en la invasión, la supervivencia intracelular y la replicación, son activados por el regulador de la transcripción de virulencia principal, PrfA. 8-10.

En la última década, varios estudios realizados por nosotros y otros han métodos para el análisis del transcriptoma de bacterias que crecen de forma intracelular aplicado con éxito dentro de las células anfitrionas 2,11-15. Dos enfoques principales se utilizan para separar el ARN bacteriano de host-RNA que se basan en: 1) el enriquecimiento selectivo de ARN bacteriana y 2) el aislamiento de ARN por difelisis celular rential. El primer enfoque se basa en la hibridación de sustracción de extractos de ARN total de las moléculas de ARN de mamífero (por ejemplo, utilizando kits disponibles en el comercio) o la captura selectiva de secuencias transcritas bacterianas (escoceses) 11. El segundo enfoque se basa en la lisis diferencial de bacterias y células huésped, en el que se lisan las células huésped mientras que las células bacterianas se mantienen intactos. Las células bacterianas se separan a continuación a partir del lisado de la célula huésped, generalmente por centrifugación, y el ARN se extrae usando técnicas estándar. El principal problema con este enfoque es que, junto con las bacterias intactas, también se aíslan células huésped núcleos, por lo tanto las preparaciones de ARN todavía contienen ARN de mamífero. Una forma de superar este problema es separar bacterias intactas de células huésped núcleos utilizando centrifugación diferencial, aunque este procedimiento por lo general toma tiempo el aumento de la preocupación de los cambios en el perfil de la expresión génica durante la extracción. En este artículo presentamos un ba mejorada y rápidaprotocolo de extracción de ARN cteria, que se basa en el enfoque de lisis diferencial de células. En primer lugar, L. monocytogenes células de macrófagos infectados se lisan con agua fría. A continuación, los núcleos de los macrófagos se eliminan mediante una breve centrifugación y bacterias intactas se recogen rápidamente en los filtros, de la que el ARN se aísla usando caliente extracción con fenol-SDS de los ácidos nucleicos bacterianos.

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Protocolo

Nota: Durante todo el experimento, las células de macrófagos se incubaron a 37 ° C en un incubador de CO2 de aire forzado 5% y sacados de la incubadora sólo para las manipulaciones experimentales, que se llevan a cabo en una cabina de seguridad biológica de Clase II. Trabajar con L. bacterias monocytogenes es de acuerdo al nivel de seguridad biológica 2 regulaciones.

1. Preparación de células y la infección bacteriana (Día 1 y 2)

  1. Día 1
    1. Células de semillas 2,0 x 10 7 de médula ósea derivadas de macrófagos (BMDM) en un plato de 145 mm en 30 ml BMDM + medios de Pen-Strep (Tabla 2). Seed 3 placas para cada cepa bacteriana a ser analizados. Incubar toda la noche a 37 ° C en una incubadora de CO2 de aire forzado 5%.
    2. Iniciar un cultivo bacteriano durante la noche de tipo salvaje (WT) L. monocytogenes 10403S cepa en 10 ml de medio de cerebro y corazón de infusión (BHI), a 30 ° C en un incubador estándar. Coloque los tubos de cultivo inclinados sin agitación. Nota:Estas condiciones de crecimiento hasta de regular la expresión de los genes flagelos, que promueve la infección eficiente.
  2. Dia 2
    1. Medio Pre-caliente BMDM (sin antibióticos Pen-Strep) (Tabla 2) y solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 ° C.
    2. Lavar monocapa de macrófagos dos veces con 25 ml de PBS precalentado para eliminar los antibióticos. Añadir 30 ml de medio fresco BMDM.
    3. Lavar 1,5 ml de cultivo bacteriano durante la noche con PBS por centrifugación las bacterias a> 14.000 xg durante 1 min, desechar el sobrenadante, y resuspendiendo las bacterias suavemente en 1,5 ml de PBS mediante pipeteo. Repetir dos veces.
    4. Infectar a los macrófagos cada placa con 0,5 ml de un cultivo de una noche de lava de tipo salvaje de L. monocytogenes. Si el uso de múltiples placas, infectar a cada placa de 15 minutos de diferencia. Este intervalo de tiempo permitirá la cosecha de cada placa individualmente al final de la infección.
      Nota: La multiplicidad de infección (MOI) se ensaya mediante siembra de diluciones en series de cultivo bacteriano usado para la infección en placas de BHI agar y contando las unidades formadoras de colonias (CFU) después de 24 hr de incubación de las placas a 37 ° C. Usando 0,5 ml de WT L. monocytogenes cepa 10403S resultados en una MOI de ~ 100 (100 UFC de bacterias por célula macrófagos). Al analizar los mutantes bacterianos defectuosos en el crecimiento intracelular, un MOI más alto debe ser considerado.
    5. Después de 0,5 horas de incubación a 37 ° C, se lavan las células infectadas dos veces con PBS, para eliminar las bacterias no unidas, y añadir 30 ml pre-calentado medio BMDM. bacterias adheridas internalicen durante el próximo 0,5 horas.
    6. A 1 h después de la infección, añadir 30 l de gentamicina (1: 1.000 para alcanzar una concentración final de 50 mg / ml) para matar las bacterias extracelulares.
    7. Montar el aparato de filtración mediante la colocación de una cabeza de filtro en un matraz de recogida de líquido con un puerto de salida de vacío. A continuación, coloque un filtro (0,45 micras) en una cabeza de filtro, seguido de un embudo de cilindro y asegurar las diferentes partes con un metal clámpara. Preparar agua libre de RNasa helada.
    8. A las 6 horas después de la infección, las bacterias de la cosecha de las células infectadas de la siguiente manera. Tratar a cada placa individual.
      Nota: Por lo general, L. monocytogenes completa 1-log de ​​crecimiento durante 6 h de infección en células de macrófagos. incubaciones más largas podrían dar lugar a la proliferación bacteriana y la muerte celular de los macrófagos, mientras que los períodos de incubación más cortos podrían resultar en cargas bacterianas considerablemente inferiores. El MOI y el tiempo de la infección pueden ser modificados para alcanzar condiciones óptimas.
      1. Lavar las células infectadas con PBS una vez. Añadir 20 ml de agua libre de RNasa enfriado con hielo para lisar células macrófagos. El uso de un rascador de células, raspar las células de la placa rápidamente, pero con cuidado.
      2. Recoger las células lisadas a un tubo cónico de 50 ml. Vortex durante 30 segundos. Centrifugar a 800 xg durante 3 min a 4 ° C.
      3. Pasar el sobrenadante a través del aparato de filtro usando un sistema de vacío. Usando las pinzas, el rollo de filtro y rápidamente la transferencia a un 15 ml CONItubo de cal. Snap-congelar los tubos con los filtros en nitrógeno líquido.
      4. Montar el aparato de filtración con un filtro nuevo para la siguiente muestra, como se describe en 1.2.7.
      5. Almacenar los filtros congelados a -80 ° C para el día siguiente. Como alternativa, proceder directamente a la extracción de ácidos nucleicos.

2. Ácidos nucleicos extracción (día 3)

Nota: Realice todas las manipulaciones con las soluciones de fenol y cloroformo en una campana de humos.

  1. Preparar una mezcla 1: 1 de fenol acidificado: cloroformo, 400 l para cada muestra. Mezclar en tubos separados, y luego retirar la capa acuosa resultante por aspiración. Añadir 40 l de 10% SDS.
  2. Descongelar los tubos que contienen filtros-en hielo para mantenerlos fríos. A cada tubo que contiene filtro de añadir 650 l de acetato-EDTA (AE) (Tabla 2).
  3. Realice los siguientes pasos lo más rápido posible.
    1. Vigorosamente vórtice el tubo que contiene el filtro paraque el filtro bate a la periferia del tubo y el tampón se lava completamente el filtro. Siempre mantenga el tubo frío colocándolo de nuevo en hielo. Nota: puede ser necesario vórtice, además, el tubo mientras invertida para lavar completamente las bacterias fuera del filtro.
    2. Repita este procedimiento para todos los tubos. Puede ser útil para hacer girar hacia abajo la suspensión en breve (1 min a 120 xg) al final del proceso.
  4. Transferir el tampón de bacterias que contienen a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene el SDS y la mezcla de fenol / cloroformo (como se preparó en 2,1). Repita este procedimiento para todos los tubos. Puede que sea necesario para hacer girar los tubos de filtro que contiene (1 min a 120 xg) de nuevo para obtener tampón residual del filtro.
  5. Coloque todos los tubos de 1,5 ml en un dispositivo de vórtice de tubos múltiples, y vórtice a velocidad máxima durante 10 min.
  6. Incubar los tubos en un bloque de calor C 65 ° durante 10 min. Centrifugar a máxima velocidad (> 14.000 xg) durante 5 min.
  7. La transferencia de la capa acuosa (aproximadamente 400 l) de cada uno tUbe a un nuevo tubo de 1,5 ml que contiene 40 l de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y 1,0 ml de etanol al 100%. Vortex cada tubo a fondo.
    Nota: El glucógeno se puede añadir en esta etapa para mejorar la visualización de la pastilla precipitado.
  8. Incubar las muestras a -80 ° C durante 1 hr. Alternativamente, se incuban las muestras a -20 ° C durante la noche. A continuación, centrifugar las muestras a 4 ° C durante 20 min a la velocidad máxima (> 14.000 xg).
  9. aspirar cuidadosamente el etanol (capa superior) de cada tubo. Añadir etanol 500 l frío 70% a cada muestra y mezclar bien. Centrifugar a 4 ° C durante 20 min a la velocidad máxima (> 1 4.000 xg).
  10. aspirar cuidadosamente el etanol a partir de cada tubo. Secar las muestras durante aproximadamente 2 minutos usando un evaporador al vacío sin calor. No sobre-secar las muestras.
  11. Añadir 25 l de agua libre de RNasa a cada muestra. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min. Con cuidado vórtice y spin-down.
  12. Medir la concentración de ARN en tél muestras usando un microtomo UV-Vis. Esperar a extraer aproximadamente 0,5 - 1 mg de ácidos nucleicos por placa.
    Nota: Técnico repeticiones se pueden combinar en esta etapa.

3. El tratamiento de DNasa

  1. Configurar la reacción de acuerdo con la Tabla 1 en un tubo de microcentrífuga. Incubar a 37 ° C durante 45 min. Añadir 450 l de agua libre de RNasa y 500 l de fenol-cloroformo-IAA mezcla (Tabla 2), fases separadas por centrifugación durante 2 minutos a velocidad máxima (> 14.000 xg).
  2. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo y añadir 500 l de cloroformo-IAA mezcla (Tabla 2), mezclar y fases separadas por centrifugación de 2 minutos a velocidad máxima (> 14.000 xg).
  3. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo y añadir 1 ml de etanol y 50 l de acetato de sodio 3 M (pH 5,2). Vórtice.
    Nota: El glucógeno se puede añadir en esta etapa para mejorar la visualización de la pastilla precipitado.
  4. incubar durante 1 hora a -80 ° C. Alternativamente, se incuban las muestras a -20 ° C durante la noche. Centrifugar a 4 ° C durante 20 min a velocidad máxima.
  5. aspirar cuidadosamente el etanol a partir de cada tubo. Añadir etanol 500 l frío 70% a cada muestra y mezclar bien. Centrifugar a 4 ° C durante 20 min a velocidad máxima. aspirar cuidadosamente el etanol a partir de cada tubo.
  6. Secar las muestras durante aproximadamente 2 minutos usando un evaporador al vacío sin calor. No sobre-secar las muestras.
  7. Añadir 12 l de agua libre de RNasa, se incuba durante 2 minutos a temperatura ambiente, vórtice, y spin-down. Las muestras contienen ARN purificado, los mantienen en hielo. Como alternativa, disolver ARN en RNasa libre de H 2 O con EDTA 0,1 mM o tampón TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM).
  8. Medir las concentraciones de ARN usando un microtomo UV-Vis. Esperar ~ 100 ng de RNA por muestra (si se combinan técnica repeticiones).
    Nota: el ARN extraído de acuerdo con este protocolo es adecuado for análisis de transcripción génica mediante múltiples técnicas. Por lo general, empleamos el análisis RT-qPCR para estudiar L. monocytogenes la transcripción de genes durante la infección de las células de macrófagos 1-4.

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Resultados

El sistema modelo se muestra en la Figura 1 e incluye células de macrófagos infectados con L. monocytogenes bacterias, que se replican en el citoplasma de los macrófagos. La figura 2 representa el esquema experimental. La figura 3 representa los resultados típicos de tales análisis de RT-qPCR de genes de virulencia durante WT L. monocytogenes en los macrófagos en comparación con el crecimiento en medio rico laboratorio ...

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Discusión

El protocolo descrito aquí representa un método optimizado para el aislamiento de ARN bacteriana de L. monocytogenes bacterias que crecen intracelularmente en células de macrófagos. Este protocolo se basa en la lisis diferencial de células e incluye dos pasos principales para el enriquecimiento de ARN bacteriano: sedimentación núcleos de macrófagos utilizando centrifugación y una rápida acumulación de bacterias por filtración. Estos pasos son seguidos por un procedimiento de extracción de ARN estándar. Si bien ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

La investigación en el laboratorio de Herskovits está respaldada por 335400 subvenciones ERC y R01A/109048 NIH.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Listeria monocytogenes 10403S20
Macrófagos derivados de la médula ósea preparados a partir de ratones21
H2O, libre de ARNasaSepuede utilizar agua tratada con DEPC
DMEMGibco41965039
Gibco25030081
Piruvato de sodioGibco11360-088
β-MercaptoetanolGibco31350010
Pen/EstreptococoGibco15140-122
GentamicinaSigma-AldrichG1397
FBSGibco10270106
Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato-PBSSigma-AldrichD8537
Infusión cerebro-corazón (BHI)Merckmillipore1104930500
Fenol saturado pH 4.3FisherBP1751I-400
CloroformoFisherBP1145-1
Alcohol isoamílicoSigma-AldrichW205702
Acetato de sodioSigma-Aldrich
EDTASigma-AldrichEDS
DNaseIFermentasEN0521
SDS 10%Sigma-AldrichL4522
Etanol absolutoMerck Millipore1070174000
37 ° C, 5% CO2 incubadora de aire forzadoThermo Scientificmodelo 3111
Rascadores de celdasNunc179693
Kontes portavasos para filtros de 45 mmFisherK953755-0045
MF-Millipore filtros 45  mm, 0,45 y nbsp; y micro; mMerck MilliporeHAWP04700
sistema SpeedVacThermo ScientificSPD131DDA
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesModelo G560E
NanoDrop Thermo Scientific
Placas de cultivo celular de 145 mmGreiner639 160
Tubos de 1,7 ml, sin RNasaAxygenMCT-175-C
30 ° Incubadora CThermo Scientific
65 ° Bloque de calor CThermo Scientific
4 ° Centrífuga de mesa CEppendorf5417R
Pipetas estériles, 25 mlTubos Greiner
Falcon, 50 mlGreiner
Nitrógeno
hembra C57B/6W302406 líquido

Referencias

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