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Summary

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount β-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

Abstract

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

Introduction

Over the past few years, there has been a widening appreciation for the influence of nerves on diseases not typically regarded as classical neuropathies^1-4. In the skin, recent experimental evidence has suggested that sensory nerves can modulate diverse pathologies ranging from psoriasis to cancer^5-9. This has been demonstrated using techniques such as surgical denervation and pharmacological inhibition of neural function in rodents. In the case of psoriasis, these studies have provided a mechanistic framework for understanding why human psoriatic plaques regress following loss of neural function^7,10-12.

Cutaneous nerves can also affect gene expression^13,14 and are critical for mechanosensing in normal skin¹⁵. In particular, touch dome (TD) epithelia are comprised of a patch of columnar epidermal cells in juxtaposition with neuroendocrine Merkel cells innervated by slowly adapting type 1 (SA1) nerve fibers^16-18. TDs mediate light touch sensation and have been shown to display Hedgehog pathway activity^5,19. TD maintenance depends on innervation^20,21, as nerves secrete Hedgehog ligands to sustain normal TDs and their associated Merkel cells¹⁹. In addition, innervation promotes Hedgehog-dependent tumor formation from TD epithelia⁵. Together, these studies reinforce the notion that intricate molecular interactions occurring between nerves and the surrounding cells in their niche are crucial for normal TD physiology as well as disease.

To interrogate the nature of these interactions, we describe here a series of in vivo techniques for manipulating gene expression in the TD, as well as for harvesting skin biopsies for TD visualization after lineage tracing. Finally, we describe procedures for performing unilateral surgical denervation, wherein nerves are removed from one side of the mouse dorsal skin, while leaving the contralateral side intact as a sham internal control. Several weeks after surgery, denervated and sham control skin are compared to assess changes that occur when nerves are ablated. Although these techniques are described in the context of normal TDs, the denervation procedure has been used to examine the requirement for nerves in mouse models of psoriasis⁶, wound healing¹³ and tumorigenesis⁵. Finally, since the skin is amenable to repeated biopsies, this provides an opportunity to monitor the long-term fates of labeled cells or to assess disease progression over multiple time points.

Protocol

Todos los procedimientos descritos en este protocolo se realizaron de acuerdo con las normas establecidas por la Universidad de Michigan Unidad de Medicina de Laboratorio Animal. 1. Inducir la recombinación genética en ratones Nota: El Gli1 TM3 (CRE / ERT2) Alj / J cepa de ratón (Gli1-CreERT2) 13 permite la orientación de la recombinación genética inducida por tamoxifeno a TD epitelios. Cruzar esta cepa con B6.129S4-Gt (ROSA) reportero ratones 26Sor tm1Sor / J (LacZ) 22 para generar Gli1; ​​LacZ animales para visualizar las células TD por todo el montaje en la tinción de abajo. Preparar la solución de tamoxifeno a una concentración de 12,5 mg / ml en aceite de maíz. En un tubo de 1,5 ml, añadir hasta 20 mg de tamoxifeno cristalinas, y luego 1 ml de aceite de maíz. Firmemente con cinta adhesiva el tubo a un mezclador de vórtice, y agitar de forma continua a la configuración más alta a temperatura ambiente hasta que el tamoxifeno se ha disuelto completamente (2-4 h), comoconfirmado mediante el examen del tubo en un microscopio de disección por la ausencia de partículas tamoxifeno. Transferir la solución a un tubo de 15 ml y diluir el tamoxifeno a una concentración final de 12,5 mg / ml con aceite de maíz adicional. Mezclar mediante agitación la solución viscosa durante 30 sec adicional. Almacenar esta solución durante un máximo de 1 semana a 4 ° C en la oscuridad. Se inyecta la solución tamoxifeno por vía intraperitoneal en Gli1; ​​ratones lacZ, en un volumen de 200 l por 20 g de peso corporal de ratón, para una dosis eficaz de tamoxifeno 2,5 mg por 20 g de peso del ratón. 2. Cosecha biopsias de piel Nota: Dependiendo del experimento, las biopsias de piel cosecha de varios días o semanas después de la inducción tamoxifeno. Para todas las cirugías, seguir los protocolos estándar para la cirugía de roedores, incluyendo el uso de guantes estériles, con una máscara quirúrgica o el pelo red, y que cubre al animal con un paño quirúrgico estéril durante el procedimiento. Preparar la solución madre 10x anestesia mediante la mezcla de 90 mg / ml de ketamina y 6,5 mg / ml en agua xilacina. Diluir esta solución madre 1:10 en PBS estéril justo antes de su uso, y almacenar a temperatura ambiente en la oscuridad durante un máximo de 8 meses. Alternativamente, anestesiar los ratones por inhalación de isoflurano, comenzando con una concentración de gas de 4% con el oxígeno para anestesiar completamente el animal, y, posteriormente, la reducción de este a 1-2% durante la duración del procedimiento. Se inyecta la solución anestésica por vía intraperitoneal a una dosis de 200 l por 20 g de peso corporal del ratón. Compruebe que el animal ha alcanzado el plano adecuado de sedación mediante el ensayo del dedo del pie de presión, y confirme que ritmo cardíaco y respiratorio son normales (aproximadamente 600 latidos y 160 respiraciones por minuto, respectivamente). Utilice una maquinilla eléctrica para eliminar el vello desde el sitio de la biopsia en la piel dorsal de nuevo, teniendo cuidado de no cortar ni dañar la piel subyacente. Preparar la zona quirúrgica limpiando la afeitadazona d en una dirección anterior-a-posterior utilizando Betadine y alcohol toallitas. Asegurar que todos los recortes de pelo se retiran del sitio. Esquema de la zona de la biopsia usando un marcador negro, colocar al animal en un cojín de calentamiento en un área quirúrgica aséptica, y cubrir con un paño quirúrgico estéril (con fines de demostración, se omitió campo estéril para aumentar la visibilidad). Nota: Para obtener secciones longitudinales de los folículos pilosos, el borde más largo de la biopsia (el borde que se seccionó para histología, ~ 1 cm) debería correr en una dirección anterior-posterior (paralelo a la dirección de los folículos pilosos), parasagital a la línea media dorsal (Figura 1A). Use un estéril # 11 bisturí para realizar una escisión de espesor total a lo largo del área marcada sin dañar la fascia muscular de subyacente. Nota: El tejido de piel extirpada incluye la epidermis, dermis, grasa subcutánea y panículo carnoso. El sangrado suele ser mínima. Acoplar tse escindió muestra de piel en una toalla de papel seca, la dermis lado negativo, recortar el exceso de papel de cocina, y almacenar la muestra en PBS frío para un máximo de 1 hora si otras muestras tienen que ser recogidos. Cuando esté listo, continúe con los pasos 3.1 o 3.2 para procesar las muestras para histología, o el paso 4 para β-galactosidasa tinción de todo el montaje (LacZ). Sutura cerrar el sitio de la biopsia usando suturas de nylon 6-0, en un patrón interrumpido sencilla espaciadas más o menos 3 mm. No devuelva los ratones que se han sometido a una cirugía en la misma jaula como los otros animales hasta después de la recuperación completa. Observar a los animales inmediatamente después de la cirugía hasta recuperar la conciencia, y también todos los días hasta el área quirúrgica se ha curado, por lo general dentro de 1 semana. Utilizar analgésicos de acuerdo con pautas para el cuidado y uso de animales institucionales designados si ratones muestran signos de dolor o angustia. Retirar las suturas dentro de 7-10 días después de la cirugía. Nota: Si es necesario, preparar la solución analgésica mediante la dilución de carprofeno (50 mg / ml de solución madre solution) 1: 100 en agua estéril. Se inyecta la solución por vía subcutánea entre los omóplatos, cerca de la piel del cuello, a una dosis de 200 l por cada 20 g de peso corporal (5 mg / kg de peso corporal del ratón). 3. Las muestras de proceso para Histología Nota: para fijar y procesar el tejido extirpado, utilice uno de estos métodos dependiendo de la aplicación. Para generar muestras histológicas embebidas en parafina, fijar la piel en el 3,7% de formalina en PBS O / N a temperatura ambiente y almacenar en un 70% de etanol durante un máximo de 2 semanas. Retire la toalla de papel antes de clavarse en parafina. Para la generación de muestras histológicas congeladas, sumergir el tejido en frío de paraformaldehído al 4% en PBS y agitar suavemente durante 1 hora. Retire la solución y se lava la muestra con 3 cambios de PBS, más o menos 5 minutos cada uno. A continuación, sumergir la muestra en 30% de sacarosa en PBS para cryoprotect el tejido ( "hundimiento sacarosa"). Incubar con agitación suave O / N a 4 ° C. Al día siguiente, retire el papel o toallaEL y recorte el exceso de tejido adiposo de la cara dérmica de la piel. Incrustar el tejido directamente en PTU y almacenar el bloque congelado a -80 ° C. Nota: Después de seccionar, ya sea de parafina o las muestras congeladas se pueden teñir mediante técnicas de inmunohistoquímica para identificar anotaciones, las células de Merkel y los nervios usando anticuerpos contra queratina 17, queratina 8 y neurofilamentos, respectivamente, como se describió previamente 5,19. 4. Las muestras Visualizar por Todo el montaje lacZ La tinción Preparar la solución de tinción X-gal. Combinar 0,94 g fosfato de sodio monobásico, y 2,6 g de fosfato de sodio dibásico en 250 ml de agua estéril. Ajustar el pH a 7,3. A esto, añadir 0,5 ml de cloruro de 1 M de magnesio, 0,528 g de ferrocianuro de potasio, y 0,412 g de ferricianuro de potasio. Añadir 250 ml de glicol de polietileno-octilfenılico y 125 mg de desoxicolato. La solución de base se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de 6 meses en la oscuridad. Preparar 50x acciones soluti X-galen mediante la adición de dimetilformamida a la botella de X-gal de stock para generar una solución 50 mg / ml. Almacenar esta solución a -20 ° C en la oscuridad. Justo antes de usar, diluir la solución madre de X-gal 1:50 en solución de base X-gal para generar solución de tinción. Para biopsias más pequeños (<1 cm 2), alícuotas 1-2 ml de solución de tinción por muestra. Fijar la muestra de piel obtenidos en la etapa 2.7 en una solución que contiene 2% de paraformaldehído / 0,2% de glutaraldehído en PBS frío durante 30 minutos, agitando suavemente en hielo. Para biopsias más pequeños (<1 cm 2), utilizar 1-2 ml de solución de fijación por muestra. Nota: Como alternativa, fijar las muestras en 2-4% de paraformaldehído solamente, o sólo en glutaraldehído al 0,5%. condiciones de fijación óptima dependen del tejido, el grado de expresión de LacZ y aplicación. Eliminar la solución de fijación, y enjuagar las muestras con 3 cambios de PBS, 5 minutos cada uno, en un agitador a temperatura ambiente. Retire la toalla de papel debajo de la muestra y cortar exces tejido adiposo de la cara dérmica de la piel agarrando la grasa con unas pinzas romas y el recorte con las tijeras de disección. Sumergir la muestra en solución de tinción X-gal, y se incuba a 37 ° CO / N. La expresión de LacZ será visible como una mancha azul debajo de un microscopio de disección (Figura 1B). Nota: Si la intensidad de la señal es débil, reemplace la solución de tinción al día siguiente y repetir la incubación O N /. Si la tinción de fondo es demasiado intenso, reducir el tiempo de tinción, o incubar la muestra a temperatura ambiente en lugar de 37 ° C. Eliminar la solución de tinción y lavar las muestras en 3 cambios de PBS que contenía 3% de DMSO durante aproximadamente 5 min, agitando suavemente a TA. muestras de lavado de 2-3 cambios de etanol al 70% durante 5 minutos cada uno. Almacenar las muestras en etanol al 70%. 5. La denervación quirúrgica Anestesiar al animal como en el paso 2.2 y afeitar toda la piel dorsal. Preparar el área quirúrgica of la piel de la espalda usando Betadine y toallitas con alcohol, y cubrir al animal con un paño quirúrgico estéril (con fines de demostración, se omitió campo estéril para aumentar la visibilidad). Mantenga el animal caliente utilizando una almohadilla caliente mientras se opera en un área quirúrgica aséptica. Hacer una incisión con un escalpelo estéril # 11 a lo largo de la línea media dorsal de la base del cuello a aproximadamente 0,5 cm por encima de la cola. El uso de pinzas romas, reflejar suavemente la piel en el lado izquierdo de distancia desde el flanco de visualizar el tejido subyacente de las almohadillas de grasa escapular cerca del cuello a justo por encima de la extremidad posterior. Nota: los nervios cutáneos dorsales aparecen como hebras blancas que viajan en sentido caudal a través de la fascia de la pared translúcida tronco antes de hacer curvas cerradas y entrar en el tejido conectivo suelto debajo de la piel (Figura 2). El uso de pinzas ultrafinas con un microscopio de disección luz, quitar los nervios exclusivamente desde el lado izquierdo del ánimal situados en sitios anatómicos T3-12 Desplumando desde donde los segmentos de curva en la pared del tronco a sus sitios de entrada en la piel (Figura 2). Fórceps Orient verticalmente y eliminar los nervios agarrando aproximadamente 0,5 cm por debajo de sus sitios de flexión y tirando hacia arriba, haciendo que el nervio para estirar y separar del tejido circundante (Figura 2C – E). Tenga cuidado para evitar la ruptura de los vasos sanguíneos adyacentes. Continuar hasta que se eliminen todos los nervios que se extienden desde la pared del tronco a la piel. No alterar los nervios dentro de la densa fascia de la pared del tronco. Mantenga el tejido húmedo durante todo el procedimiento mediante la aplicación periódicamente gotas de solución salina estéril al 0,9%. Como alternativa, retire los nervios sujetando sus extremos proximal cerca de la pared del tronco con unas pinzas y cortando con unas tijeras finas. Después, cortar los extremos distales cerca de la piel (Figuras 2F – H). Por último, retire el intervening segmentos de nervio (figura 2I). Retire cualquier nervios del colgajo de piel expuesta en el paso 5.4. Estas fibras comprenden las ramas distales de los nervios cutáneos dorsales y aparecen como blancos hebras de ramificación situados de forma esporádica dentro del tejido conectivo en el lado dérmico de la tapa de piel (figuras 2J – K). Para eliminar estas ramas finas, se posicionan las pinzas finas más o menos paralelos a la superficie dérmica, agarran los nervios y arrancar hacia arriba para evitar la interrupción de los vasos sanguíneos y punción de la piel. Continúe hasta que todos los nervios visibles han sido eliminados. Utilizando disección roma, reflejar la piel en el lado derecho de la incisión en la línea media dorsal, pero no quite los nervios. Esto servirá como el control contralateral con operación simulada. Sutura a lo largo de la línea media dorsal en un patrón interrumpido sencilla para cerrar la incisión. Vigilar el animal durante la recuperación y post-opertivamente como se ha demostrado anteriormente (Pasos 2,8-10). Retirar las suturas dentro de 7-10 días después de la cirugía. Para evaluar funcionalmente estables denervación hasta varias semanas después de la cirugía, eliminar el vello de la piel dorsal usando una maquinilla eléctrica. pinchar suavemente la zona de piel denervado mediante una aguja hipodérmica, y tenga en cuenta si el animal responde, por lo general estremeciéndose o girar la cabeza. Si el área de la piel se ha denervado de forma estable, el animal exhibir poca o ninguna respuesta. El uso de un marcador negro, delinear el área de no respuesta, así como un área de tamaño y ubicación similar en el lado contralateral sham. Recoger las biopsias de estos sitios que en los pasos 2.1-2.9 para el análisis. Nota: Como alternativa, toda la espalda dorsal de la piel, incluyendo las regiones sin nervios y con operación simulada, se puede quitar como una sola hoja para todo el montaje de la tinción, similar a como se describe en el paso 4.

Representative Results

Por ratones que expresan la generación de tamoxifeno inducible Gli1-CreERT2 y un alelo reportero LacZ, es posible visualizar los epitelios TD y rastrear el destino de estas células en el tiempo. Todo el procedimiento de denervación normalmente se puede completar en 1 hr por ratón y debe causar angustia mínimo para el animal. Nuestros estudios previos han indicado que los nervios son cruciales para el man…

Discussion

Los nervios sirven para funciones cruciales no sólo en la sensación, sino también en el desarrollo de órganos de mamíferos, mantenimiento y regeneración ^13,24-27. Como nervios recientemente se han implicado en diversos trastornos de la piel, las técnicas descritas aquí se pueden utilizar para estudiar el requisito de inervación en una variedad de modelos de enfermedad animal. De hecho, la técnica de denervación unilateral permite la comparación directa de la piel, ya sea con nervios intactos o alt…

Materials

Alcohol prep pads	PDI	B339
AnaSed (Xylazine)	Lloyd	NADA 139-236
Antibody, anti-Keratin 8	Developmental Studies Hybridoma Bank	TROMA-I	rat antibody, use at 1:500 concentration
Antibody, anti-Keratin 17	Cell Signaling	#4543	rabbit antibody, use at 1:1,000 concentration
Antibody, anti-Neurofilament	Cell Signaling	C28E10	rabbit antibody, use at 1:500 concentration
Betadine prep pads	Medline	MDS093917
Carprofen (Rimadyl)	Zoetis
Cordless rechargable clipper	Wahl	trimmer model 8900
Corn Oil	Sigma-Aldrich	C8267
Cryostat	Leica	CM1860
DAPI	ThermoFisher Scientific	D1306	use at 1:1000 concentration
Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
Depilatory Cream	Nair	N/A
Dimethylforamide	Sigma-Aldrich	319937
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
ImmEdge Pen	Vector Laboratories	H-4000
Ketamine HCl	Hospira	NDC 0409-2051-05
Magnesium chloride	Sigma	M8266
Micro cover glass	VWR	48404-454
Micro Slides	VWR	48311-703
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	BDH0502-4LP
6-0 nylon sutures	DemeTECH	NL166012F4P
Octylphenyl-polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	I8896
O.C.T. Compound	Sakura Tissue-Tek	4583
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Pottasium ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P9387
Pottasium ferricyanide	Sigma-Aldrich	702587
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S5136
Sucrose	Sigma-Aldrich	84097
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648-1G
Ultra fine forceps	Dumont	0103-5-PO
Vectashield	Vector Laboratories	H1000
X-gal	Roche	10 651 745 001	Disolve in dimethylforamide to create 50x stock prior to use