Se presenta un ejemplo de terapia génica adenoviral en las córneas diabéticas humanas cultivadas con órganos para la normalización de la cicatrización tardía de heridas y la expresión marcadamente reducida de marcadores de células madre epiteliales en estas córneas. También se describe la optimización de este proceso en cultivos epiteliales limbales enriquecidos con células madre.
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Artículo de método
Terapia génica adenoviral para Diabetic Queratopatía: Efectos en la curación de heridas y Stem Cell expresión del marcador en córneas de órganos cultivados humanos y células epiteliales Limbal
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Resumen
Resumen
El objetivo de este protocolo es describir las alteraciones moleculares en las córneas diabéticos humanos y demostrar cómo pueden ser aliviados mediante terapia génica adenoviral en córneas cultivadas de órganos. La enfermedad de la córnea diabética es una complicación de la diabetes con anomalías frecuentes de los nervios corneales y la curación de heridas epiteliales. También hemos documentado la expresión alterada de manera significativa de varios marcadores de células madre epiteliales putativos en córneas humanas diabéticos. Para aliviar estos cambios, la terapia génica adenoviral se aplicó con éxito el uso de la regulación al alza de la expresión de proto-oncogén c-met y / o la regulación a la baja de la matriz metaloproteinasa-proteinasas 10 (MMP-10) y la catepsina F. Esta terapia acelerado la cicatrización de heridas en diabéticos córneas incluso cuando fue transducida sólo el compartimento de células madre del limbo. Los mejores resultados se obtuvieron con el tratamiento combinado. Para el trasplante posible paciente de las células madre normalizadas, un ejemplo se presenta también de la optimizatien la transducción de genes en cultivos enriquecidos con células madre utilizando potenciadores policatiónicos. Este enfoque puede ser útil no sólo para los genes seleccionados, sino también para los otros mediadores de la cicatrización de la herida corneal epitelial y la función de células madre.
Introducción
La enfermedad de la córnea diabética se debe principalmente en el epitelio degenerativa (queratopatía) y cambios nerviosas (neuropatía). A menudo se manifiesta por las alteraciones de la cicatrización de heridas del epitelio y la reducción de nervio corneal 1-4. Se estima que 60-70% diabéticos tienen diversos problemas corneales 1,3. Nuestros estudios han identificado varias proteínas marcadoras con expresión alterada en las córneas diabéticos humanos, incluida la regulación a la baja de los proto-oncogén (receptor del factor de crecimiento de hepatocitos) c-met y la regulación al alza de la metaloproteinasa de matriz 10 (MMP-10) y la catepsina ....
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Protocolo
Investigación de Enfermedades Intercambio Nacional (ISRND, Filadelfia, PA) suministra post mortem ojos humanos sanos y diabéticos con autorización y córneas. protocolo de recogida de tejido humano de ISRND es aprobado por el comité directivo y sujetos a los Institutos Nacionales de Salud de supervisión. Esta investigación se ha llevado a cabo bajo la Junta aprobó el Cedars-Sinai Medical Center de Revisión Institucional (IRB) de protocolo exentos EX-1055. Colaborador de los cirujanos de córnea, los Dres. E. Maguen e Y. Rabinowitz, suministran llantas corneoesclerales de descarte para el aislamiento de cultivos epiteliales de la córnea enriquecida de células madre. Esta investigación se ha....
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Resultados
Hemos demostrado previamente que en los cultivos de órganos de la córnea, las diferencias en la expresión de marcadores de la diabetes (por ejemplo, proteínas de la membrana basal y α3β1 integrina) y la cicatrización de heridas entre las córneas normales y diabéticos se conservan. Este sistema de cultivo se sometió a la terapia génica dirigida a la normalización de los niveles de marcadores de la diabetes alterado, c-Met, MMP-10, y catepsina F.
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Discusión
La córnea parece ser un tejido ideal para la terapia génica debido a su ubicación superficie en la que la entrega de genes, así como la evaluación de la eficacia y efectos secundarios, son fáciles. Sin embargo, una traducción clínica de este enfoque poderoso sigue siendo lento debido a la escasa información sobre las causas genéticas de las enfermedades de la córnea y los objetivos de terapia génica 24. Complicaciones diabéticas, incluyendo alteraciones de la córnea pueden ser en gran parte epigenética en la .......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses financieros.
Agradecimientos
Agradecemos el apoyo financiero de NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), la subvención CTSI UL 1RR033176 (AVL) y las subvenciones del Instituto de Medicina Regenerativa, Centro Médico Cedars-Cedars.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| medio esencial mínimo | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
| ABAM mezcla de antibióticos y antimicóticos | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| colágeno de piel de ternero | Sigma-Aldrich | Agar C9791 | |
| , grado de cultivo de tejidos | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| n-heptanol | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
| O.C.T. compuesto | VWR International | 25608-930 | |
| Dispasa II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
| medio libre de suero de queratinocitos (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
| medio EpiLife con calcio | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
| N2 suplemento de medio, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| B27 suplemento medio, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
| tripsina 0,25% - EDTA 0,02% con rojo fenol | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| tripsina 0,25% con rojo fenol | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
| inhibidor de tripsina de soja | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| suero fetal bovino | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| suplemento de insulina-transferrina-selenito (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| anticuerpo contra la queratina 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| anticuerpo contra la queratina 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
| anticuerpo contra la queratina 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
| anticuerpo contra Δ Np63 y alfa; | sc-8609 | Santa Cruz Biotechnology | |
| contra PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| anticuerpo contra nidogen-1 | R& D Systems | MAB2570 | |
| anticuerpo a la integrina y alfa; 3 y beta; 1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| fibronectina humana | BD Biosciences | 354008 | |
| laminina humana | Sigma-Aldrich | L4445 | |
| colágeno humano tipo IV | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
| adenovirus que expresa MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | a medida | |
| que expresa catepsina F shRNA | Capital BioSciences | hecho | |
| que expresa shRNA revuelto y GFP | Capital BioSciences | hecho | |
| que expresa c-met | OriGene (plásmido) | SC323278 | |
| adenovirus que expresa GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
| citrato de sildenafil, 25 mg | Pfizer | de farmacia | |
| factor de crecimiento epidérmico | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| polibreno | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | ibidi, Alemania | 50301 | |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Espátula de extremo redondo Corning | Dow Corning | 3005 | |
| 60 mm Placas de Petri | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek II portaobjetos de cámara multipocillo | Sigma-Aldrich | C6807 | |
| 200 μ l puntas de pipeta | Bioexpress | P-1233-200 | otros proveedores disponibles |
| microscopio invertido | Nikon | Diaphot | otros proveedores/modelos disponibles |
| incubadora de CO2 humidificada | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | otros proveedores/modelos disponibles |
| microscopio fluorescente | Olympus, Japón | BX-40 | otros proveedores/modelos disponibles |
| microscopio estereoscópico de disección | Leica, Alemania | S4 E | otros proveedores/modelos disponibles |
Referencias
- Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S. Corneal changes in diabetes mellitus. Curr Diabetes Rev. 8 (4), 294-302 (2012).
- Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2....
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Reimpresiones y permisos
