Multienzimático de detección sistemática mediante un sistema de cribado genético de la enzima de alto rendimiento

Resumen

Este trabajo presenta un método de cribado de alto rendimiento utilizando un sistema universal de cribado genético de enzimas que teóricamente puede aplicarse a más de 200 enzimas. En este caso, el sistema de cribado único identifica tres enzimas diferentes (lipasa, celulasa y fosfatasa alcalina) simplemente cambiando el sustrato utilizado (acetato de p-nitrofenilo, p-nitrofenil-β-D-celobiósido y fosfato de fenilo).

Resumen

El reciente desarrollo de una técnica de ensayo unicelular de alto rendimiento permite el cribado de nuevas enzimas basadas en actividades funcionales a partir de una biblioteca metagenómica a gran escala¹. Anteriormente propusimos un sistema de cribado genético de enzimas (GESS) que utiliza un regulador de dimetilfenol activado por fenol o p-nitrofenol. Dado que una gran cantidad de reacciones enzimáticas naturales producen estos compuestos fenólicos a partir de sustratos derivados del fenol, este sistema de cribado genético único puede aplicarse teóricamente para cribar más de 200 enzimas diferentes en la base de datos BRENDA. A pesar de la aplicabilidad general de GESS, la aplicación del proceso de cribado requiere un procedimiento específico para alcanzar las máximas señales de citometría de flujo. Aquí, detallamos el proceso de cribado desarrollado, que incluye el preprocesamiento del metagenoma con GESS y el funcionamiento de un clasificador de citometría de flujo. Se utilizaron tres sustratos fenólicos diferentes (acetato de p-nitrofenilo, p-nitrofenil-β-D-celobiósido y fosfato de fenilo) con GESS para el cribado y la identificación de tres enzimas diferentes (lipasa, celulasa y fosfatasa alcalina), respectivamente. Las actividades enzimáticas metagenómicas seleccionadas se confirmaron solo con la citometría de flujo, pero la secuenciación del ADN y diversos análisis in vitro se pueden utilizar para una mayor identificación de genes.

Introducción

Un alto rendimiento de técnica de ensayo de una sola célula recientemente desarrollado permite nuevas enzimas que se proyectarán partir de una biblioteca genética a gran escala en base a sus actividades funcionales ^1. En el nivel de células individuales, se emplean las proteínas que regulan la transcripción para activar la expresión de genes reportero mediante la detección de moléculas pequeñas que se producen como resultado de una actividad de la enzima objetivo. Un enfoque temprano implicado el aislamiento de un operón de fenol-degradante de Ralstonia eutropha E2 utilizando la expresión genética sustrato inducida método (SIGEX), en el que el sus....

Protocolo

1. Preparación de la biblioteca metagenómica con PNP-GESS

1. Construir una biblioteca metagenómica en E. coli con un vector fosmid utilizando un kit de producción biblioteca fosmid de acuerdo con el protocolo del fabricante ^5.
2. Alícuota de 100 l de la biblioteca para almacenamiento a -70 ° C, que es una fuente de células de la biblioteca metagenomic.
   Nota: La densidad óptica de una muestra medida a una longitud de onda de 600 nm (OD ₆₀₀₎ de esta biblioteca de valores es aproximadamente 100.
3. Descongelar 100 l de la biblioteca de la metagenomic en hielo y inocular en un matraz de 500 ml que contiene 50 ml....

Resultados

Se examinaron los tres sustratos fenólicos para identificar nuevas enzimas metagenomic de una biblioteca de metagenome de sedimentos planas de alta mar de las mareas en Taean, Corea del Sur, siguiendo el protocolo propuesto. Para la construcción de la biblioteca, promedio 30 - 40 kb secuencias metagenome se insertaron en fosmids, que se basan en la E. coli F factor de replicón y se presenta como una sola copia en una celda. Tenga en cuenta que fosmids han sido ampliamente utiliz.......

Discusión

El aumento de la eficiencia de producción de biocatalizadores es una clave para el éxito de la bio-químico basado en la industria de metagenome ⁹ y está considerada como una de las mejores fuentes de enzimas naturales. En este sentido, es esencial para el cribado de nuevas enzimas metagenoma donde la mayoría de los recursos genéticos no se han explorado ^10. Varios métodos de detección se han desarrollado que detectan directamente los productos de enzimas utilizando activadores de la transcripción <.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
CopyControl	Epicentre	CCFOS110	Fosmid
Solución de inducción CopyControl	Epicentre	CCIS125	Fosmid Solución de inducción de copia
EPI300	Epicentro	EC300110	Célula electrocompetente
pCC1FOS	Epicentro	CCFOS110	vector Fosmid
Gene Pulser Mxcell	Bio-Rad		Sistema de electroporación y electroporación
FACSAria III	Becton Dickinson		Citometría de flujo (máquina FACS)
Nikon		AZ100M
UltraSlim	Iluminador LED	Maestrogen
tubo cónico de 50 ml	BD Falcon
tubo de fondo redondo de 14 ml	BD Falcon
Tubo de 5 ml de fondo redondo	BD Falcon
p-nitrofenilo fosfato	Sigma-Aldrich	N7653	Sustrato
p-nitrofenilo β-D-celobiósido	Sigma-Aldrich	N5759	Sustrato
p-butilato de nitrofenilo	Sigma-Aldrich	N9876& nbsp;	sustrato
Luria-Bertani (LB)	BD Difco	244620	Triptona 10 g/L, Extracto de levadura 5 g/L, Cloruro de sodio 10 g/L
Caldo súper óptimo (SOB)	BD Difco	244310	Triptona 20 g/L, Extracto de levadura 5 g/L, Cloruro de sodio 0,5 g/L, Sulfato de magnesio 2,4 g/L, Cloruro de potasio 186 mg/L
Caldo súper óptimo con represión de catabolito (SOC)		SOB, 0,4 % de glucosa
2x Extracto de levadura Triptona (2xYT)	BD Difco	244020	Digestión pancreática de caseína 16 g/L, Extracto de levadura 10 g/L, Extracto de levadura 5 g/L
Medios			2x Caldo YT, 15% Glicerol, 2% Glucosa
pGESS(E135K)			Un vector de ADN que contiene dmpR, genes egfp con sus promotores apropiados, RBS y terminator. Véase la referencia 5 en el manuscrito para Más detalles.
Cloranfenicol	Sigma	C0378
Ampicilina	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		Software de citometría de flujo versión 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0,8 % NaCl, 0,02 % KCl, 0,0144 % Na2HPO4, 0,024 % KH2OP4, pH 7,4