Promoción de 3-D agregación de células epiteliales del timo FACS purificada con EAK 16-II / EAKIIH6 auto-montaje de hidrogel

Resumen

Este video muestra un protocolo para enriquecer células epiteliales tímicas (TEC) con gradiente de densidad para el aislamiento de FACS. También muestra el uso de péptidos EAK16-II/EAKIIH6 para promover la formación de agregados TEC. Los microambientes del hidrogel EAK16-II/EAKIIH6 proporcionan la configuración 3D necesaria para mantener la supervivencia y la función de los TEC.

Resumen

La involución del timo, asociada con el envejecimiento o lesiones patológicas, resulta en una disminución de la producción de células T maduras. Restaurar la función de un timo defectuoso es crucial para mantener una respuesta inmunitaria adquirida mediada por células T eficaz contra los patógenos invasores. Sin embargo, la regeneración y revitalización del timo resultó ser un desafío, en gran parte debido a las dificultades de reproducir el microambiente 3D único del estroma tímico que es fundamental para la supervivencia y la función de las células epiteliales tímicas (TEC). Desarrollamos un novedoso sistema de hidrogel para promover la formación de agregados TEC, basado en la propiedad de autoensamblaje de los oligopéptidos anfifílicos EAK16-II y su análogo histidinilado EAKIIH6. Las TEC se enriquecieron a partir de células tímicas aisladas con gradiente de densidad, se clasificaron con clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y se marcaron con anticuerpos anti-molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM) que se anclaron, junto con IgG anti-His, en los complejos adaptadores de proteína A/G. La formación de agregados celulares se promovió mediante la incubación de TEC con EAKIIH6 y oligopéptidos EAK16-II, y luego mediante el aumento de la concentración iónica del medio para iniciar la gelificación. Los agregados de TEC incrustados en el hidrogel EAK pueden promover eficazmente el desarrollo de células T funcionales in vivo cuando se trasplantan a ratones desnudos atímicos.

Introducción

El timo es el órgano linfoide primario responsable de la generación de una población diversa de células T a patógenos reactiva, la auto-tolerancia que es esencial para la función del sistema inmune adquirido. Es un órgano dinámico en el que los timocitos en desarrollo, emigraron de la médula ósea como células de linfocitos progenitoras, migran a través del tridimensional (3-D) de la matriz de tipo esponja del estroma tímico, someterse a linaje de especificación y diferenciación, y, finalmente emigrar como células T maduras. El éxito de este proceso bien programada depende en gran medida de la diafonía entre los timocitos que migran y las células epiteliales del timo ....

Protocolo

Todos los animales utilizados en los experimentos fueron alojados en las instalaciones de animales en Allegheny-Singer Research Institute bajo el protocolo revisado y aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del / Allegheny cantante Instituto de Investigación de la Red de Salud de Allegheny.

1. Digerir el timo con colagenasa

1. timo cosecha.
   1. La eutanasia a los ratones de 3-5 semanas de edad C57BL6 / J en un dióxido de carbono (CO ₂₎ de cámara para cosechar timo. En detalle, colocar los ratones en la cámara bajo CO ₂ de inducción para 3-5 min y confirmar la muerte mediante la ....

Resultados

Para examinar la eficacia de la utilización del protocolo de separación por gradiente de densidad para enriquecer las células del estroma CD45-, las células cosechadas a partir de la interfaz y los gránulos de linfocitos precipitados se tiñeron con anticuerpos anti-EpCAM anti-CD45 y. Tanto anti-Ulex europaeus aglutinina 1 (UEA1) y anticuerpos anti-MHC de clase II también se incluyeron en el cóctel de tinción para identificar mejor los subconjuntos ctec y Mtec. Como se muestra en la

Discusión

Mientras TEC son la población predominante del estroma del timo y desempeñan papeles esenciales para la estructura y función de las glándulas del timo, que representan sólo alrededor del 0,1-0,5% de la celularidad del timo total. También son células frágiles como se observan ocasionalmente altos porcentajes de muerte de las células después de la digestión de la colagenasa, es decir, el tratamiento para disociar TECs de la matriz extracelular (ECM). Su rareza (~ 200.000 por el timo del ratón) y la fragilidad hiz.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
TEC Isolation
70% Ethanol	Decon Laboratories	2701 (1 galón)	Etanol 200 a prueba, agua desionizada
Tijeras de disección, rectas	Fine Science Tools, Inc.	91460-11
Pinzas Graefe, rectas	Fine Science Tools, Inc.	11053-10
Pinzas Graefe, curvadas	Fine Science Tools, Inc.	11052-10
Solución			1x PBS, 0.1% BSA, 2  mM EDTA
1x PBS (solución salina tamponada con fosfato)	Gibco	10010-023
BSA (Albúmina sérica bovina)	Sigma	A1470-100G
EDTA (ácido etilendiaminotetraacético)	Invitrogen	15575-038
Solución			9 ml RPMI-1640, 0,025  mg/ml Liberase TM Grado de investigación, 10  mM HEPES, 0,2  mg/ml DNaseI
RPMI-1640	Gibco	11879-020
Liberase TM Grado de investigación	Roche	05 401 127 001	denominado "colagenasa purificada"
1  M HEPES	Lonza	17-737E
Dnase I	Roche	10 104 159 001
50  ml Tubo de centrífuga	Corning	430290
60  placa de cultivo de tejidos en mm	Falcon	353002
1/2  cc U-100 Jeringa de insulina 28  1/2  G	Becton Dickinson	329461
5  ml Tubo de poliestireno de fondo redondo	Falcon	352058
5  ml pipeta de vidrio	Fisher Healthcare	13-678-27E	Úselo para enjuagar los fragmentos tímicos. Los fragmentos tímicos tienden a adherirse a la pared con pipetas de plástico.
Rotador de tubos MACSmix	Miltenyi	130-090-753
100  y micro; m Filtro de células	Falcon	352360
Medio de gradiente de densidad: OptiPrep	Axis-Shield
Cell Sorting
5  ml Tubo de polipropileno de fondo redondo	Falcon	352063
Anti-ratón CD16/CD32 (Fc Block)	BD Biosciences	553142	Usar sin diluir, 2  y micro; l por muestra
Anti-ratón CD45-PercpCy5.5	eBioscience	45-0451-80	Uso a 1:150, 10  y micro; l por muestra
Anti-ratón CD326 (EpCAM)-PE	eBioscience	12-5791-82	Uso a 1:100, 10  y micro; l por muestra
BD Influx	BD Biosciences Software de análisis de
célula única	FlowJo
EAK Gel Assembly
Anti-His-Tag	AnaSpec	29673	"anti-His-Tag IgG"
Anti-ratón CD326 (EpCAM)	BioLegend	118202	"anti-EpCAM IgG"
Proteína recombinante A/G	Pierce Biotechnology
1.5  ml Tubos Safe-Lock, Biopur, estéril	Fisher Healthcare	05-402-24B	denominado "1.5  ml tubo de microcentrífuga"
96 pocillos, Placa de cultivo de tejidos, Fondo redondo con tapa de baja evaporación	BD Falcon	353917
Plataforma oscilante: Mezclador Nutator n.º 1105	BD Clay Adams
10% sacarosa	Sigma	S0389	Preparar con agua destilada estéril
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAAKAK-CONH2)	American Peptide Company& nbsp;		sintetizado personalizado, 10  mg/ml
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAEAEAEAAKAKHHHHHH-CONH2)	Compañía Americana de Péptidos		sintetizado personalizado, 7.5  mg/ml
Medio			RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Estreptococo, 1% L-glutamina, 1% NEAA, 5  mM HEPES, 50  y micro; M 2-Mercaptoetanol
RPMI-1640	Gibco	11879-020
FBS (Suero fetal bovino)	Atlanta Biologicals	S11150	Calor inactivado antes de usar
Pluma/Estreptococo	Gibco	15140-122
L-glutamina 200  mM (100x)	Gibco	25030-081
NEAA (aminoácido no esencial) 100x	Gibco	11140-050
1  M HEPES	BioWhittaker	17-737E
2-Mercaptoetanol (100x)	Millipore	ES-007-E
Agitador de plataforma: The Belly Dancer	Stovall Life Sciences Inc.	modelo: USBDbo

de lavado de digestión completo