Este protocolo utiliza Golden Gate Assembly y el plásmido pGR-blue para cuantificar rápidamente la fuerza de los terminadores encontrados in silico.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Verificación rápida de Terminators Uso de la PGR-Blue plásmido y montaje de puerta de oro
En este artículo
Resumen
Resumen
El objetivo de este protocolo es permitir la verificación rápida de terminadores identificados bioinformáticamente. Además, el plásmido (pGR-Blue) está diseñado específicamente para este protocolo y permite cuantificar la eficiencia del terminador. Como prueba de concepto, se identificaron bioinformáticamente seis terminadores en el micobacteriófago Bernal13. Una vez identificados, los terminadores se convirtieron en oligonucleótidos con los extremos pegajosos apropiados y se recocieron juntos. Usando Golden Gate Assembly (GGA), los terminadores se clonaron en pGR-Blue. Bajo luz visible, las colonias de falsos positivos aparecen de color azul y las colonias transformadas positivamente son de color blanco/amarillo. Después de la inducción de un promotor inducible de arabinosa (pBad) con arabinosa, la fuerza de la colonia se puede determinar midiendo la proporción de proteína verde fluorescente (GFP) producida y proteína fluorescente roja (RFP) producida. Con pGR-Blue, el protocolo se puede completar en tan solo tres días y es ideal en un entorno educativo. Además, los resultados muestran que este protocolo es útil como medio para comprender in silico las predicciones de la eficiencia del terminador relacionadas con la regulación de la transcripción.
Introducción
Los grandes proyectos de biología sintética necesitan el uso de terminadores de transcripción altamente efectivos para ayudar a regular la expresión génica. La identificación de nuevos terminadores requiere el análisis bioinformático de nuevos genomas. Sin embargo, a medida que se desarrollan cantidades cada vez mayores de software bioinformático, cada uno con un algoritmo único utilizado para la predicción, se producen más discrepancias entre los resultados putativos. Debido a que este proceso es algo subjetivo y se realiza in silico, estas predicciones necesitan confirmación biológica. 1 Además, el volumen de terminadores putativos identificados ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Diseñar y oligonucleótidos pedidos con las apropiadas pegajosas Final
- Identificar posibles terminadores rho-independientes a través del análisis genómico utilizando programas que están disponibles gratuitamente en línea. 7
- Cuando se trabaja con ADN de doble cadena, determinar la orientación del terminador a ensayar. 7 El plásmido PGR-azul sólo verifica terminadores ligados en el 5 'a 3' en la parte superior (capítulo adelante).
- Convertir una cadena de terminador inferior (hacia atrás) con su complemento invertido para reorientar la secuencia para realizar pruebas en PGR-Azul uso de software libre en línea....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Este protocolo va a producir células que contienen PGR-azul con un terminador ligaron entre GFP y RFP usando oro conjunto de corredera (Figura 2). Las colonias positivas que contienen inserto se ligó se pueden seleccionar sobre la base de color. En luz visible colonias positivas serán de color blanco / amarillo y falsos positivos producirán colonias azules después de 18-20 horas de incubación a 37 ° C (Figura 3).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El paso más importante en este protocolo es adecuado diseño de oligonucleótidos antes de ordenar. Los oligonucleótidos deben tener los extremos cohesivos apropiados añadidos a los extremos 5 'de la parte superior e hilos de fondo para asegurar que GGA incorporación es posible. Además, es importante para cambiar la orientación de los interruptores de frente a la izquierda (Terminator que impiden la transcripción de la cadena inferior) a la de la derecha frente (termina la transcripción en la cadena superior) terminad.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean reconocer Malcolm Campbell y Todd Eckdahl con el Consorcio del Genoma de la enseñanza activa (GCAT) y la Alianza de Educación HHMI-Ciencia - Programa de cazadores de fagos que subieron Genómica Evolutiva y Ciencia (SEA-FAGOS).
Este proyecto fue apoyado por becas de la National Center for Research Resources (P20RR016460) y el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (P20GM103429) de los Institutos Nacionales de Salud. Esta investigación fue financiada en parte por la National Science Foundation bajo la subvención # IIA-1457888. (Ouachita Baptist University) los fondos institucion....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| pGR-Plásmido azul | Addgene | 68374 | |
| pGR-Plásmido | Addgene | 46002 | |
| AeraSeal-(Hojas estériles) | Excel Scientific | BS-25 | Hojas estériles solo |
| 10x Tampón de ADN ligasa T4 | NEB | ||
| BsaI-HF | NEB | R3535S | La enzima no HF funcionará pero es menos estable al calor. |
| NEB Golden Gate Assembly Mix | NEB | E1600S | Commerial Master Mix al que se hace referencia en el protocolo. |
| T4 ADN ligasa | NEB | M0202S | |
| Microcentrífuga redonda Bastidor flotante | Nova Tech International | F18875-6401 | |
| Ampicilina sal sódica | Sigma Aldrich | A9518 | |
| L-(+)-Arabinosa | Sigma Aldrich | A-3256 | D-Arabinose no inducirá el promotor pBAD |
| Luria Base (LB) - Caldo, Miller | Sigma Aldrich | L1900 | |
| Luria Base (LB) - Agar, Miller | Sigma Aldrich | L2025 | |
| Tecan-Infinite M200 Lector de Placas | Tecan | ||
| Mix & Ir a las células competentes - Cepa JM109 | Zymo Research | T3005 | Utilice el protocolo de transformación recomendado por la empresa |
| ApE: Un software editor de plásmidos http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ | |||
| Tris-HCl, Grado Molecular | Promega | H5121 | |
| Cloruro de sodio (cristalino/biológico, certificado) | Fisher Chemical | S671 | |
| Síntesis de oligonucleótidos | ADN (IDT) | http://www.idtdna.com/site | |
| Microtest Placas de cultivo de tejidos - 96 pocillos (estériles) | Falcon | 35-3072 | |
| micobacteriófago "Bernal13" | Banco de germoplasma | KJ510413 | |
| Nucleasa Libre | de agua Tecnologías de ADN integradas (IDT) | IDT004 | |
| Estéril, en forma de L Espectrómetro UV-Vis Hockey-Stick Cell | Science Products | 6444-S1 | |
| Nano-Drop 2000c UV-Vis | Thermo Scientific | 2000c | |
| ARNold: una herramienta web para la predicción de terminadores de transcripción independientes de Rho. |
Referencias
- Li, J., Zhang, Y. Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression. Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
