Artículo de método

Verificación rápida de Terminators Uso de la PGR-Blue plásmido y montaje de puerta de oro

DOI:

10.3791/54064

⸱

25 de abril de 2016

 ,  , 
1Department of Biology, Ouachita Baptist University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo utiliza Golden Gate Assembly y el plásmido pGR-blue para cuantificar rápidamente la fuerza de los terminadores encontrados in silico.

Resumen

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El objetivo de este protocolo es permitir la verificación rápida de terminadores identificados bioinformáticamente. Además, el plásmido (pGR-Blue) está diseñado específicamente para este protocolo y permite cuantificar la eficiencia del terminador. Como prueba de concepto, se identificaron bioinformáticamente seis terminadores en el micobacteriófago Bernal13. Una vez identificados, los terminadores se convirtieron en oligonucleótidos con los extremos pegajosos apropiados y se recocieron juntos. Usando Golden Gate Assembly (GGA), los terminadores se clonaron en pGR-Blue. Bajo luz visible, las colonias de falsos positivos aparecen de color azul y las colonias transformadas positivamente son de color blanco/amarillo. Después de la inducción de un promotor inducible de arabinosa (pBad) con arabinosa, la fuerza de la colonia se puede determinar midiendo la proporción de proteína verde fluorescente (GFP) producida y proteína fluorescente roja (RFP) producida. Con pGR-Blue, el protocolo se puede completar en tan solo tres días y es ideal en un entorno educativo. Además, los resultados muestran que este protocolo es útil como medio para comprender in silico las predicciones de la eficiencia del terminador relacionadas con la regulación de la transcripción.

Introducción

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Los grandes proyectos de biología sintética necesitan el uso de terminadores de transcripción altamente efectivos para ayudar a regular la expresión génica. La identificación de nuevos terminadores requiere el análisis bioinformático de nuevos genomas. Sin embargo, a medida que se desarrollan cantidades cada vez mayores de software bioinformático, cada uno con un algoritmo único utilizado para la predicción, se producen más discrepancias entre los resultados putativos. Debido a que este proceso es algo subjetivo y se realiza in silico, estas predicciones necesitan confirmación biológica. 1 Además, el volumen de terminadores putativos identificados a través del análisis in silico requiere el uso de estrategias de clonación que pueden completarse en un período de tiempo relativamente corto.

El plásmido PGR-Blue es una modificación del plásmido PGR que ha sido rediseñado para utilizar el Ensamblaje Golden Gate (GGA) para simplificar el procedimiento de clonación al permitir que todos los pasos de reacción se realicen simultáneamente en un tubo de microcentrífuga. 2,3 La selección de color se incorporó en el plásmido para aumentar la facilidad de identificación de colonias positivas. Una ligadura exitosa debe ser de color blanco/amarillo con luz visible y verde fluorescente bajo luz azul (450 nm) o ultravioleta (UV) cuando se cultiva en placas que contienen arabinosa. Debido a que el pGR-azul sin cortar contiene una proteína cromosómica azul (amilCP), las colonias que contienen un plásmido no modificado son azules bajo la luz visible. Esta simplificación, junto con el protocolo simplificado, permite a los investigadores pasar de la identificación bioinformática a la confirmación biológica en tres o cuatro días. La naturaleza del diseño de este sistema puede ser beneficiosa tanto en el laboratorio de investigación como en entornos educativos.

El plásmido pGR-Blue permite cuantificar la fuerza del terminador. 4 Se utiliza un único promotor inducible de arabinosa para producir proteína verde fluorescente (GFP) y proteína roja fluorescente (RFP). El terminador se clona en el plásmido después de la secuencia GFP pero antes de la secuencia RFP, deteniendo así la transcripción de la proteína RFP. La resistencia del terminador está determinada por la relación entre GFP producido y RFP producido.

El informe Visión y Cambio5 sugirió que la educación en Ciencia, Tecnología, Ingeniería y Matemáticas (STEM, por sus siglas en inglés) incorpore experiencias basadas en la investigación en el aula. 6 Sin embargo, esto requiere el desarrollo de protocolos que puedan ser realizados por estudiantes con habilidades limitadas en un período de tiempo definido. Si bien el protocolo se puede lograr en tan solo tres días, también se diseñó para que cada paso principal se pudiera realizar en un período de laboratorio semanal (2-3 horas) separado para crear una Experiencia de Investigación del Curso (CRE). Cuando se utiliza de esta manera, el procedimiento durará entre tres y seis semanas y es apropiado tanto para cursos introductorios como avanzados en Genética, Biología Celular o Bioinformática.

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Protocolo

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1. Diseñar y oligonucleótidos pedidos con las apropiadas pegajosas Final

  1. Identificar posibles terminadores rho-independientes a través del análisis genómico utilizando programas que están disponibles gratuitamente en línea. 7
  2. Cuando se trabaja con ADN de doble cadena, determinar la orientación del terminador a ensayar. 7 El plásmido PGR-azul sólo verifica terminadores ligados en el 5 'a 3' en la parte superior (capítulo adelante).
    1. Convertir una cadena de terminador inferior (hacia atrás) con su complemento invertido para reorientar la secuencia para realizar pruebas en PGR-Azul uso de software libre en línea, por ejemplo, mono.
  3. Después de la orientación se determina que es correcta, añadir el extremo cohesivo "5'-CGAC-3 '" al extremo 5' de la cadena superior. Añadir el extremo pegajoso "5'-CCGC-3 '" al extremo 5' de la cadena inferior. 8 Esto asegurará que inserto se ligó se insertará en la apropiadaorientación usando GGA.
  4. Una vez que se determinan las secuencias, la orden como oligonucleótidos de cadena simple vista comercial.

2. El recocido oligonucleótidos (sólo se aplica a liofilizada ADN)

  1. Vuelva a suspender los oligonucleótidos individuales en agua libre de nucleasa a una concentración de 100 mM.
  2. Hacer 10x tampón de hibridación: 1 M NaCl y Tris-HCl pH 7,4 100. tampón de reasociación se puede almacenar a 4 ° C durante varias semanas. Una vez que se hace tampón de reasociación y los oligonucleótidos se resuspendió, comenzar el recocido 8.
  3. Para cada terminador a ensayar, añadir 16 l de agua ultra pura a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  4. Añadir 2 l de 10x tampón de reasociación a cada tubo de microcentrífuga.
  5. Añadir 1 l de oligonucleótido cadena superior (100 m) desde el terminador deseada.
  6. Añadir 1 l de oligonucleótido cadena inferior (100 mM) de el terminador deseado.
  7. Crear un punto de ebullición de agua baTH utilizando un vaso de precipitados de 1000 ml que contenía aproximadamente 400 ml de agua del grifo y colocar en un plato caliente.
  8. Coloque los tubos de microcentrífuga de la etapa 2.6 en un flotador y hervir durante 4 minutos. Después de 4 minutos, apagar la placa de calor, pero dejar el tubo y flotar en el baño de agua fría para O / N (18 h) 8 lentamente. Almacenar los terminadores recocidas a -20 ° C.

3. Montaje de Golden Gate (Standard Mix - Costo Eficiente)

  1. Hacer una dilución 40 nM de los terminadores recocidos. Añadir 124 l de agua libre de nucleasa a 1 l de recocido mezcla terminadores (100 M).
    1. Centrifugar las muestras durante 30 segundos a 10.000 xg y almacenar en hielo.
  2. Siendo utilizado en un nuevo tubo apropiado para el termociclador, añadir 6 l de agua libre de nucleasa.
  3. Añadir 1 l de ADN comercial Ligase Buffer [300 mM Tris-HCl (pH 7.7 hasta 7.8), 100 mM MgCl 2 mM, DTT 100 mM, y 10 ATP]. Realizar todos los pasos subsiguientes en el hielo.
  4. Añadir1 l de PGR-azul (35-50 ng / l) plásmido destino al tubo de microcentrífuga.
  5. Añadir 1 l de los 40 nm terminadores recocidos al tubo de microcentrífuga.
  6. Añadir 0,5 l de endonucleasa de restricción comercial de alta fidelidad BsaI al tubo de microcentrífuga.
  7. Añadir 0,5 l de ADN ligasa comercial al tubo de microcentrífuga.
  8. Centrifugar la mezcla de reacción a 10 000 xg durante 120 seg. A continuación, coloque el tubo directamente en el termociclador.
  9. Ejecutar el programa del termociclador: 20 ciclos de 1 min a 37 ° C, seguido de 1 min a 16 ° C, seguido de 1 ciclo de 15 minutos a 37 ° C. Use muestras inmediatamente o congelación y la conservación a -20 ° C. 8

4. Asamblea Golden Gate (Master Mix Comercial - Tiempo Eficiente)

  1. Añadir 124 l de agua libre de nucleasa a 1 l de los 100 M terminadores creado en el paso 2. Esto diluye la concentración de ADN terminador de 40 nM recocidos.Realice este paso en una nueva, marcada 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
  2. En un nuevo tubo apropiado para el termociclador, añadir 14 l de agua libre de nucleasa. Asegúrese de que el nuevo tubo está etiquetado en consecuencia.
  3. Añadir 2 l de Tampón Comercial Master Mix al tubo de microcentrífuga.
  4. Añadir 1 l de PGR-azul plásmido (35-50 ng / l) al tubo de microcentrífuga.
  5. Añadir 2 l de los 40 nm terminadores recocidos al tubo de microcentrífuga.
  6. Añadir 1 l de Master Mix Comercial al tubo de microcentrífuga.
  7. Centrifugar el tubo de 40 nM a 10.000 xg durante 120 seg. A continuación, coloque el tubo directamente en el termociclador.
  8. Ejecutar el programa del termociclador: 1 ciclo de 60 minutos a 37 ° C seguido de 1 ciclo de 15 min a 55 ° C. Use muestras inmediatamente o congelación y la conservación a -20 ° C.

5. Transformación y selección de colonias

  1. Preparar la base de Luria (LB) placas de Petri que contenían agar concentrat 1 mMion de ampicilina (Amp) y una concentración 10 mM de arabinosa (ARB). Preparar al menos 10 ml de 1 M L solución de reserva -arabinose porque esta solución madre se usará en pasos posteriores.
  2. Utilizar cualquier de alta eficiencia (10 8 - 10 9 transformantes / mg) E. químicamente competentes coli (JM109) las células para la transformación. 9 Para obtener los mejores resultados, agregue 3-5 l de la reacción de ligación a 50 l de células competentes. Al utilizar células competentes químicos, siga el protocolo de transformación específica a las células que se utilizan.
  3. Extienda la mitad (25 l) de las células transformadas en LB precalentado (Amp / ARB) placas de agar utilizando un "palo de hockey" en forma de L estéril y se incuba O / N a 37 ° C. Debido a la rápida velocidad de descomposición de la ampicilina, no se incuba a 37 ° C durante 24 hr.
  4. Realizar selección de colonias basada en el color mediante inspección visual. Una ligadura exitosa debe ser de color blanco / amarillo a la luz visible y fluorescencia verde under azul (450 nm) o la luz UV. Una ligadura sin éxito producirá una colonia que es de color azul bajo luz visible después de 18 - 20 h.

6. Verificación y cuantificación de Terminator

  1. Preparar tubos de 5 ml de caldo de LB-ampicilina estériles con 1 mM y 10 mM arabinosa. El número de tubos necesarios depende de la cantidad de terminadores que se están probando más controles (células con resistencia a la ampicilina que no emiten fluorescencia y las células que contienen el plásmido PGR-azul sin cortar).
  2. Bajo la luz visible recoger 2-3 colonias de color blanco / amarillo (paso 5.4) utilizando un asa estéril. Permitir que las muestras de incubar en caldos en un agitador a 37 ° C y 160 rpm durante 16 a 18 hr. No incubar las muestras durante más de 24 horas.
    1. Opcionalmente, utilizar un espectrofotómetro para determinar la densidad celular óptica a 600 nm (OD 600) para asegurar el crecimiento celular adecuado. En general, una DO 600 de ~ 0,8-1,0 se observa después de 16-18 h de crecimiento.
  3. Utilizaruna placa de 96 pocillos estéril para los pasos restantes. Llevar a cabo estos pasos en un ambiente aséptico y por triplicado. Añadir 199 l de caldo estéril LB + Amp / arabinosa (ampicilina 1 mM / arabinosa 10 mM) a cada pocillo. Incluir piezas en la placa por tres controles separados.
    1. Utilice los tres controles siguientes: solamente un pozo (1) que contiene el caldo / arabinosa LB + Amp y un pozo (2) para células competentes transformadas (en blanco) para servir como un espacio en blanco. Para la cuantificación (3) de la resistencia de terminación, las células que contienen pGR original, sin cortar o contiene PGR-azul se ligó con una secuencia no de terminación deben ser incluidos (control de referencia para cuantificación). Véase la Figura 1 para el diseño lector de placas.
  4. Pipetear 1 l de la solución de células de la O / N caldos en pocillos individuales de la placa de 96 pocillos.
  5. placas de sellado con una cubierta transpirable y agitar durante 18-20 horas a 37 ° C y 160 rpm.
  6. El uso de un lector de placas, determinar OD 600 mediante la lecturala absorbancia a 600 nm. Medir la fluorescencia de GFP de la siguiente manera: 395 de excitación y emisión de fluorescencia de RFP 509. Medida de la siguiente manera: 575 de excitación y emisión 605. Después de 18-20 horas, el OD 600 debe ser de aproximadamente 0,5.
  7. Para normalizar la variación en el crecimiento, utilizar la ecuación: figure-protocol-1 tanto para GFP y RFP.
  8. Después de la normalización, determinar la resistencia de terminación relativa usando la ecuación figure-protocol-2

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Resultados

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Este protocolo va a producir células que contienen PGR-azul con un terminador ligaron entre GFP y RFP usando oro conjunto de corredera (Figura 2). Las colonias positivas que contienen inserto se ligó se pueden seleccionar sobre la base de color. En luz visible colonias positivas serán de color blanco / amarillo y falsos positivos producirán colonias azules después de 18-20 horas de incubación a 37 ° C (Figura 3).

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Discusión

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El paso más importante en este protocolo es adecuado diseño de oligonucleótidos antes de ordenar. Los oligonucleótidos deben tener los extremos cohesivos apropiados añadidos a los extremos 5 'de la parte superior e hilos de fondo para asegurar que GGA incorporación es posible. Además, es importante para cambiar la orientación de los interruptores de frente a la izquierda (Terminator que impiden la transcripción de la cadena inferior) a la de la derecha frente (termina la transcripción en la cadena superior) terminad...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean reconocer Malcolm Campbell y Todd Eckdahl con el Consorcio del Genoma de la enseñanza activa (GCAT) y la Alianza de Educación HHMI-Ciencia - Programa de cazadores de fagos que subieron Genómica Evolutiva y Ciencia (SEA-FAGOS).

Este proyecto fue apoyado por becas de la National Center for Research Resources (P20RR016460) y el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (P20GM103429) de los Institutos Nacionales de Salud. Esta investigación fue financiada en parte por la National Science Foundation bajo la subvención # IIA-1457888. (Ouachita Baptist University) los fondos institucionales, además, se proporcionan a través de la JD Patterson verano beca de investigación.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
pGR-Plásmido azulAddgene68374
pGR-PlásmidoAddgene46002
AeraSeal-(Hojas estériles)Excel ScientificBS-25Hojas estériles solo
10x Tampón de ADN ligasa T4NEB
BsaI-HFNEBR3535SLa enzima no HF funcionará pero es menos estable al calor.
NEB Golden Gate Assembly MixNEBE1600SCommerial Master Mix al que se hace referencia en el protocolo.
T4 ADN ligasaNEBM0202S
Microcentrífuga redonda Bastidor flotanteNova Tech InternationalF18875-6401
Ampicilina sal sódicaSigma AldrichA9518
L-(+)-ArabinosaSigma AldrichA-3256D-Arabinose no inducirá el promotor pBAD
Luria Base (LB) - Caldo, MillerSigma AldrichL1900
Luria Base (LB) - Agar, MillerSigma AldrichL2025
Tecan-Infinite M200 Lector de PlacasTecan
Mix & Ir a las células competentes - Cepa JM109Zymo ResearchT3005Utilice el protocolo de transformación recomendado por la empresa
ApE: Un software editor de plásmidos http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
Tris-HCl, Grado MolecularPromegaH5121
Cloruro de sodio (cristalino/biológico, certificado)Fisher ChemicalS671
Síntesis de oligonucleótidosADN (IDT)http://www.idtdna.com/site
Microtest Placas de cultivo de tejidos - 96 pocillos (estériles)Falcon35-3072
micobacteriófago "Bernal13"Banco de germoplasmaKJ510413
Nucleasa Librede agua Tecnologías de ADN integradas (IDT)IDT004
Estéril, en forma de L Espectrómetro UV-Vis Hockey-Stick CellScience Products6444-S1
Nano-Drop 2000c UV-VisThermo Scientific2000c
ARNold: una herramienta web para la predicción de terminadores de transcripción independientes de Rho.
Tecnologías integradas de Life http://rna.igmors.u-psud.fr/

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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