Un Enfoque para Mejorar la alineación y la mielinización de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal

Resumen

Este protocolo describe el aislamiento de neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) aisladas de ratas y el cultivo de neuronas DRG en un sistema de cultivo celular estático preestirado para mejorar la alineación de los axones, con el posterior cocultivo de células de Schwann (SC) para promover la mielinización.

Resumen

La regeneración de axones es un proceso caótico debido en gran parte a la alineación desorganizada de los axones. Por lo tanto, para que un número suficiente de axones regenerados puentee el sitio de la lesión, se requiere una alineación axonal adecuadamente organizada. Dado que la desmielinización después de una lesión nerviosa afecta fuertemente la capacidad conductora de los axones supervivientes, la remielinización es fundamental para el funcionamiento exitoso de los nervios regenerados. Anteriormente, demostramos que las células madre mesenquimales (MSC) alineadas en una superficie anisotrópica inducida por preestiramiento porque las células pueden detectar una rigidez efectiva mayor en la dirección estirada que en la perpendicular. También demostramos que una superficie anisotrópica que surge de una superficie mecánica preestirada afecta de manera similar a la alineación, así como al crecimiento y mielinización de los axones. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la preparación de una superficie anisotrópica preestirada, el aislamiento y cultivo de neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) en una superficie preestirada, y mostramos el comportamiento de mielinización de un cocultivo de neuronas DRG con células de Schwann (SC) en una superficie preestirada.

Introducción

En las lesiones nerviosas, los muñones proximal y distal del nervio a menudo no pueden realineación directa de fascículos nerviosos debido a la zona de la lesión ^1-2. Normalmente, los tractos de axones se componen de haces altamente ordenados y alineados de los axones, que forman redes complejas de conectividad. Sin embargo, la regeneración nerviosa es un proceso caótico debido a la alineación del axón mal organizada ^3-4. Por lo tanto, para generar un número suficiente de regeneración de los axones que unen el sitio de la lesión, es necesario para inducir la alineación axonal bien organizado. Además, desmielinización acompaña a lesiones del nerv....

Protocolo

Todos los procedimientos para el aislamiento de las células fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad del Estado de Michigan.

1. Preparación de pre-estirado superficial anisotrópico

1. Mezclar un 10: 1 solución de base y agente de curado y se vierte la mezcla en una placa de cultivo tisular (12 cm de diámetro). Utilice 4,900 mg de base y 490 mg de agente de curado de la mezcla total de reticulación.
2. Mantener la mezcla de gel a vacío durante 20 min para eliminar las burbujas de aire.
3. Colocar la mezcla de gel en el horno para el curado durante la noche a 60 ° C.
4. Después de q....

Resultados

El sistema de cultivo celular pre-estirada promovido DRG alineación axón ^10. DRG neuronas se cultivaron sobre superficies pre-estiradas y sin estirar durante 12 días. Los axones fueron teñidos para β-III-tubulina para demostrar su alineación. La Figura 2 compara la orientación axón en el PDMS pre-estirados y sin estirar sustratos después de 12 días de cultivo. Los axones DRG alineados paralelamente a la dirección de estirado, mientras que mostraron alineación .......

Discusión

Para inducir la alineación axón en la superficie pre-estirado, hay dos pasos críticos: 1) la membrana de PDMS debe ser plana y de un espesor homogéneo; y 2) las células gliales se deben retirar de la DRG. Después de mezclar el PDMS y agente de reticulación y curado en un horno, el gel reticulado PDMS debe mantenerse en la cima de banco plano y manejarla con cuidado para evitar cualquier inclinación. El tratamiento con plasma de oxígeno de la membrana de PDMS se debe seguir dentro de 6 h por recubrimiento de PLL, ya que .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Neurobasal Medio 1x	GibcoBRL	21103-049
B27 Suplemento 50x	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100x	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Factor de Crecimiento Nervioso-7S	Invitrogen	13290-010
Penicilina-estreptomicina	GibcoBRL	15140-122
0.05% Tripsina-EDTA/1 mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lisina	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lisina	Sigma	p-6407
Fluoro-2 desoxi-uridina	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank' s Solución salina equilibrada (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Tampón de aislamiento
Tipo I colagenasa	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
suero bovino fetal inactivado por calor		SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Cámara de silicona	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Sistema de limpieza/grabado por plasma	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 anticuerpo	Sigma- Aldrich	M7898
Complemento de conejo	Sigma- Aldrich	S-7764
Medio			de crecimiento estándarPara 500 ml de Medio Neurobasal 1x, agregue 10 ml de B-27 50x, 5 ml de Glutamax-I 100x, 2,5 ml de Penicilina/Estreptomicina (Penn/Strep), 1 ml de Albumax-I, y 1 μ l de NGF-- 7S (50 μ g/ml).
FDU Solución			FDU 100 mg en 10 ml de ddH2O (10 mg/ml), filtro en la campana y dividido en 500 μ l alícuotas y almacenar a -20 ºC. Uridina 5 g en 166,7 ml de ddH2O (33 mg/ml), filtro en capucha, dividir en 200 μ l alícuotas y almacenar a -20 ºC. Toma 61.5 μ l de FDU (10 mg/ml) y 20,5 μ l de uridina (33 mg/ml), y añadir 4.918 μ l de ddH2O hasta una concentración final de existencias, luego dividir en alícuotas de 1 ml y almacenar a -20 ºC.

Hicono de madre de uridina