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Artículo de método

La secuenciación de ARN dirigidos Ensayo para caracterizar la expresión génica y la genómica alteraciones

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DOI:

10.3791/54090

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4 de agosto de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Medical Oncology, Comprehensive Cancer Center, The Ohio State University, 2Department of Pharmacology, The Ohio State University

En este artículo

Resumen

Describimos un método basado en la secuenciación de ARN dirigido que incluye la preparación de bibliotecas de ADNc indexadas, hibridación y captura con sondas personalizadas y análisis de datos para interrogar transcripciones seleccionadas para la expresión génica, mutaciones y fusiones de genes. Targeted RNAseq permite una evaluación rápida y rentable de transcripciones seleccionadas en un secuenciador de escritorio.

Resumen

la secuenciación de ARN (RNAseq) es un método versátil que puede ser utilizado para detectar y caracterizar la expresión génica, las mutaciones, las fusiones de genes, y noncoding RNAs. Estándar RNAseq requiere 30 - 100 millones de secuenciación lee y puede incluir varios productos de ARN como ARNm y ARN no codificantes. Demostramos cómo orientar las RNAseq (captura) permite un estudio centrado en productos de ARN seleccionados utilizando un secuenciador de escritorio. captura RNAseq puede caracterizar transcripciones anotadas, bajas, o expresado de forma transitoria que de otra manera no pueden ser detectados usando métodos tradicionales RNAseq. Aquí se describe la extracción de ARN a partir de líneas celulares, el agotamiento de ARN ribosomal, síntesis de ADNc, la preparación de bibliotecas de código de barras, la hibridación y la captura de las transcripciones específicas y la secuencia multiplex en un secuenciador de escritorio. También describimos la tubería análisis computacional, lo que incluye la evaluación del control de calidad, la alineación, la detección de la fusión, la cuantificación de la expresión génica y la identificación de un solo nucleotide variantes. Este ensayo permite la secuenciación de transcripción específico para caracterizar la expresión génica, fusiones de genes, y las mutaciones.

Introducción

El transcriptoma completo o secuenciación de ARN (RNAseq) es un método de secuenciación no sesgado para evaluar todos los productos de ARN. El objetivo de la secuenciación de ARNseq dirigida (captura) es una evaluación centrada de las transcripciones seleccionadas con una mayor sensibilidad, rango dinámico, reducción de coste o escala y mayor rendimiento en comparación con la RNAseq estándar. Al igual que el RNAseq estándar, los enfoques de enriquecimiento dirigido se pueden utilizar para evaluar la expresión génica, múltiples especies de ARN como ARNm, microARN (miARN), lncRNA1, otros ARN no codificantes2, fusiones de genes3 y mutaciones4-6.

La captura implica la hibridación de oligonucleótidos complementarios para enriquecer las bibliotecas de ADNc para la secuenciación. La justificación de la captura de ARNseq es similar a los enfoques de microarrays, en los que los oligonucleótidos complementarios o las sondas se hibridan con las muestras y luego se miden para determinar la abundancia relativa. Para las tecnologías de microarrays, la expresión se basa en la señal relativa medida para las transcripciones que se unen a estas sondas. Por lo tanto, los microarrays están limitados por el alcance, el ruido de fondo potencial de la unión no específica y la hibridación cruzada de sondas. Además, las matrices tienen un rango dinámico limitado para transcripciones de baja y alta expresión en comparación con RNAseq1. Los microarrays son ampliamente utilizados debido a su costo reducido y alta capacidad de rendimiento en comparación con RNAseq.

Aquí, demostramos un método para la captura de RNAseq que ofrece un término medio entre los enfoques de RNAseq y microarray para evaluar el transcriptoma. RNAseq Capture tiene un rendimiento intermedio, un mayor rango dinámico y sensibilidad, y está escalado para una respuesta rápida en secuenciadores de escritorio. La captura de RNAseq también requiere recursos computacionales reducidos en términos de espacio de almacenamiento y procesamiento de datos.

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Protocolo

Nota: Este protocolo describe el procesamiento y el análisis de cuatro muestras simultánea. Este método es compatible con ARN aislado de células, tejido fresco congelado y tejido incluido en parafina fijado con formalina (FFPE). Este protocolo inicia con 50 - 1000 ng (250 ng recomendado) de iniciar la entrada de ARN para cada muestra.

1. El agotamiento de ARNr y la fragmentación de ARN Procedimiento

  1. El agotamiento rRNA
    1. Retire eluyen, prima, mezcla de fragmentos, ARNr mezcla de extracción, tampón de unión rRNA y tampón de resuspensión de -20 ° C y descongelar a temperatura ambiente. Eliminar el tampón de elución, perlas de eliminación de rRNA y perlas paramagnéticas específica de ARN / ADNc a partir del 4 ° C y llevar a temperatura ambiente.
    2. Añadir 0,25 g de ARN al tubo PCR. Diluir el ARN total con agua ultra-pura libre de nucleasa a un volumen final total de 10 l. Añadir 5 l de tampón de unión ARNr a cada tubo a continuación, añadir 5 l de ARNr mezcla suavemente y eliminación pipeteee arriba y hacia abajo para mezclar. Colocar los tubos en el termociclador con tapa previamente calentado a 100 ° C y el programa ciclador térmico a 68 ° C durante 5 min para desnaturalizar el ARN.
    3. Después de RNA desnaturalización, retirar tubos de termociclador y se incuba a temperatura ambiente durante 1 min. Vortex rRNA de tubo de bolas eliminación vigorosamente para resuspender las perlas. Añadir 35 l de perlas de eliminación rRNA a nuevos tubos y transferir la reacción de desnaturalización de ARN (20 l) a tubos que contienen los granos de eliminación rRNA.
    4. Ajustar la pipeta de 45 l y la pipeta de forma rápida arriba y hacia abajo 20 veces para mezclar. Incubar los tubos a TA durante 1 min. A continuación, coloque los tubos en soporte magnético a temperatura ambiente durante 1 min. Transferir el sobrenadante a tubos de PCR recién etiquetados y colocar estos tubos de nuevo en soporte magnético a temperatura ambiente durante 1 min. Esto asegura que no hay perlas se transfieren. Transferir el sobrenadante a tubos de PCR recién etiquetados.
    5. Vortex RNA / perlas paramagnéticas específico de ADNc y añadir 99 l de perlas a cada tubo. Suavemente toda la pipetavolumen arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Si a partir de degradado-RNA, añadir 193 l de perlas paramagnéticas específicas de ARN / ADNc bien mezclada a cada tubo. Incubar a TA durante 15 min. A continuación, coloque los tubos en el soporte magnético a temperatura ambiente durante 5 min. Retirar y desechar el sobrenadante.
    6. Añadir 200 l de recién preparada de etanol 70% (EtOH). Mantenga los tubos de soporte magnético y tener cuidado para no molestar a los granos. Se incuba a temperatura ambiente durante 30 segundos, a continuación, retirar y desechar el sobrenadante. Permitir que los tubos en reposo a temperatura ambiente durante 5 - 10 min para secar.
    7. Centrifugadora descongeló sala de tampón de elución temperatura a 600 × g durante 5 seg. Añadir 11 l de tampón de elución a cada tubo y suavemente la pipeta hacia arriba y abajo 10 veces para mezclar. Incubar los tubos a TA durante 2 min. Colocar los tubos en soporte magnético a temperatura ambiente durante 5 min. Transferir 8,5 l del sobrenadante a tubos de PCR recién etiquetados.
  2. La fragmentación de los ARNr ARN Empobrecido
    1. Añadir 8,5 l ELUTE, 8,5 l primer y 8,5 l de mezcla fragmento a cada tubo. pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Colocar los tubos en el termociclador con el siguiente programa: tapa precalentado a 100 ° C, 94 ° C durante 8 minutos, luego 4 ° C bodega.
      NOTA: Este paso está diseñado para generar un tamaño de inserción promedio de 155 pb. Si el tamaño promedio fragmento de muestra de ARN es inferior a 200 pb, omita este paso y continúe con la primera cadena de cDNA de síntesis.

2. Síntesis de ADNc

  1. Sintetizar la primera cadena de ADNc
    1. Quitar primero la mezcla de síntesis de la cadena de -20 ° C y descongelar a temperatura ambiente.
    2. Pre-programar el termociclador con la siguiente configuración: opción de tapa de precalentamiento y se puso a 100 ° C, luego 25 ° C durante 10 min, 42 ° C durante 15 min, 70 ° C durante 15 minutos y mantener a 4 ° C . Guardar este programa como "Sintetizar 1ª hebra."
    3. Centrifugar el tubo descongelado primera hebra mezcla de síntesis a 600 y #215; g durante 5 seg. Mezclar 1 l de transcriptasa inversa con 9 l de mezcla de la primera síntesis de la cadena.
    4. Añadir 8 l de síntesis de la primera hebra y revertir la transcriptasa mezcla a cada tubo, con cuidado la pipeta hacia arriba y abajo para mezclar 6x. tubos de centrífuga de 4 segundos usando una centrífuga de mesa Mini velocidad fija en el 6,0 × g para llevar el líquido a la parte inferior. Colocar los tubos en el termociclador y seleccione Sintetizar 1ª hebra. Cuando el termociclador alcanza los 4 ° C, retirar los tubos y proceder inmediatamente a Sintetizar Segunda cadena de ADNc.
  2. En segundo lugar sintetizar ADNc Strand
    1. Pre-caliente el termociclador a 16 ° C con tapa previamente calentado a 30 ° C. Descongelar la segunda mezcla maestra hebra y el tampón de resuspensión en hielo. De antemano, retire la botella de perlas paramagnéticas de 4 ° C y se deja reposar durante al menos 30 minutos para llevarlos a temperatura ambiente.
    2. Añadir 5 l de tampón de resuspensión a cada tubo de PCR. Centrifugadora segunda mezcla maestra Strand en 600× g durante 5 segundos y añadir 20 l de cada tubo de PCR. Colocar los tubos en el termociclador precalentado a 16 ° C durante 1 hora. Cuando se ha completado la incubación, retirar del termociclador y permiten que los tubos lleguen a temperatura ambiente.
    3. Vortex las perlas paramagnéticas hasta que estén bien dispersos. Añadir 90 l de perlas paramagnéticas bien mezclados a cada tubo. pipeta suavemente todo el volumen arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 15 min. Colocar los tubos en el soporte magnético a temperatura ambiente durante 5 min.
    4. Retire y deseche 135 l de sobrenadante a continuación, salir de tubos en el soporte magnético para realizar lavado de EtOH. Añadir 200 l recién preparada 80% EtOH a cada tubo sin perturbar las perlas, a continuación, se incuba a temperatura ambiente durante 30 seg. Retirar y desechar todo el sobrenadante de cada uno. Repita para un total de dos lavados de EtOH 80%.
    5. Permiten tubos reposar a temperatura ambiente durante 5 - 10 min se sequen en el soporte magnético. Centrifugar la temperatur ambiente descongeladotampón de resuspensión de correo a 600 × g durante 5 seg. Retire los tubos de PCR de soporte magnético. Añadir 17,5 l de tampón de resuspensión a cada tubo de PCR y la pipeta suavemente todo el volumen arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar bien. Incubar los tubos durante 2 minutos a temperatura ambiente.
    6. Colocar los tubos en el soporte magnético a temperatura ambiente durante 5 min, luego se transfieren 15 sobrenadante l (ADNc bicatenario) a tubos de 0,2 ml de la tira de PCR.
      NOTA: Este es un punto de parada segura como ADNc se puede almacenar a -20 ° C por hasta 7 días.

3. Preparación Biblioteca

  1. Termina ciclasa 3 '
    1. Retire A-tizón mezcla entre -20 ° C y descongelar a temperatura ambiente. Pre-programar el termociclador con la siguiente configuración: elija la opción de tapa de precalentamiento y se puso a 100 ° C, a continuación, establezca a 37 ° C durante 30 min, 70 ° C durante 5 min y mantener a 4 ° C. Guardar este programa como "ATAIL70."
    2. Añadir 2,5 l de la resuspensióntampón a cada tubo. A continuación, añadir 12,5 l de mezcla descongelado A-tizón. pipeta suavemente todo el volumen arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar a fondo. Colocar los tubos en el termociclador y seleccione ATAIL70. Cuando la temperatura es termociclador a 4 ° C, retirar los tubos de PCR del termociclador y proceder inmediatamente a ligar adaptadores.
  2. Se ligan los adaptadores
    1. Retire los tubos del adaptador de ARN apropiadas, deje de tampón de ligación y tampón de resuspensión de -20 ° C y descongele a temperatura ambiente. No retire el tubo de mezcla de ligación de -20 ° C hasta que se le indique en el protocolo. Retire la botella de perlas paramagnéticas de 4 ° C y dejar reposar durante al menos 30 minutos para llevar a temperatura ambiente.
    2. Precalentar el termociclador a 30 ° C y elegir la opción de tapa de precalentamiento y se puso a 100 ° C. Centrifugar los tubos del adaptador de ARN descongelaron a 600 × g durante 5 seg. Inmediatamente antes de su uso, retire el tubo de mezcla de ligación de -20 ° Calmacenamiento.
    3. Añadir 2,5 l de tampón de resuspensión a cada tubo de muestra. Añadir 2,5 l de mezcla de ligación. Vuelva a colocar el tubo de mezcla de ligación a -20 ° C de almacenamiento inmediatamente después de su uso. Añadir 2,5 l de índice adaptador de ARN descongelado a cada tubo de muestra. pipeta suavemente todo el volumen arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar a fondo.
    4. tubos de centrífuga de 4 segundos utilizando un mini centrífuga de mesa de velocidad fija en 6,0 x g. Colocar los tubos en el termociclador precalentado. Cierre la tapa y se incuba a 30 ° C durante 10 minutos.
    5. Eliminar tubos de termociclador y añadir 5 l de tampón de ligación de parada a cada tubo para inactivar la ligación. pipeta suavemente todo el volumen arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar a fondo.
    6. Repetir el lavado como se describe en 2.2.3 - 2.2.4, utilizando 42 l de perlas paramagnéticas mixtos, y descartando el sobrenadante 79,5 l. Con los tubos en el soporte magnético, dejar que las muestras de aire seco a temperatura ambiente durante 5 - 10 minutos a.
    7. Retire las tiras de tubos PCR de lasoporte magnético y añadir tampón de resuspensión 52,5 l a cada tubo. pipeta suavemente todo el volumen arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar a fondo. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 2 min. Colocar los tubos en el soporte magnético a temperatura ambiente durante 5 minutos o hasta que el líquido es claro. Transferencia de 50 l de sobrenadante de cada tubo a nuevos tubos de 0,2 ml de la tira de PCR. Tenga cuidado de no alterar las perlas.
    8. Repetir el lavado como se describe en 2.2.3 - 2.2.4, utilizando 50 l de perlas paramagnéticas mixtos, y descartando el sobrenadante 95 l. Con los tubos en el soporte magnético, dejar que las muestras se sequen al aire a temperatura ambiente durante 5 - 10 minutos a.
    9. Retire las tiras de tubos de PCR del soporte magnético y añadir tampón de resuspensión 22,5 l a cada tubo. pipeta suavemente todo el volumen arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar a fondo.
    10. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 2 min. Colocar los tubos en el soporte magnético a temperatura ambiente durante 5 min o hasta que el líquido es claro. Transferencia de 20 l sobrenadante de cada tubo a unanuevo tubo de 0,2 ml tira de PCR. Tenga cuidado de no alterar las perlas. Este es un punto de parada segura y cDNA puede ser almacenado a -20 ° C por hasta 7 días.

4. Biblioteca de amplificación

  1. Enriquecer fragmentos de ADN
    1. Retire la mezcla maestra de PCR, PCR cóctel de imprimación y tampón de resuspensión de almacenamiento -20 ° C y descongelar a temperatura ambiente. Retire la botella de perlas paramagnéticas de almacenamiento de 4 ° C y dejar reposar durante al menos 30 minutos para llevar a temperatura ambiente.
    2. Pre-programar el termociclador con la siguiente configuración: elija la opción de tapa de precalentamiento y se puso a 100 ° C, a continuación, establecer una desnaturalización inicial a 98 ° C durante 30 segundos, 15 ciclos de desnaturalización a 98 ° C durante 10 segundos, hibridación a 60 ° C durante 30 seg, y extensión a 72 ° C durante 30 segundos, un ciclo de extensión final a 72 ° C durante 5 min y mantener a 4 ° C. Guardar este programa como "PCR".
    3. Se centrifuga el maestro PCR descongeladomezclar y cebadores de PCR tubos a 600 xg durante 5 seg. Añadir 5 l de cebadores de PCR descongelados a cada tubo de muestra. Añadir 25 l de descongelado mezcla maestra de PCR a cada tubo de muestra. pipeta suavemente todo el volumen arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar a fondo.
    4. Colocar las tiras de tubos PCR tapados en el termociclador previamente programada. Cierre la tapa y ejecutar el programa de PCR. Cuando se ha completado la PCR, retirar los tubos del termociclador y mantener en hielo.
    5. Repetir el lavado como se describe en 2.2.3 - 2.2.4, utilizando 50 l de perlas paramagnéticas mixtos, y descartando el sobrenadante 95 l. Con los tubos en el soporte magnético, dejar que las muestras de aire seco a temperatura ambiente durante 5 - 10 minutos a.
    6. Retire los tubos del soporte magnético y añadir tampón de resuspensión 32,5 l a cada tubo de muestra. pipeta suavemente todo el volumen arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar a fondo. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min. Colocar los tubos de PCR en el soporte magnético a temperatura ambiente durante 5 min o hasta que el líquido es claro. A continuación, traslado de 30 l Dopernatant a nuevos tubos de 0,2 ml de PCR.
    7. Realizar cuantificación de cDNA utilizando un fluorómetro 7 y determinar la calidad de ADNc utilizando un sistema de electroforesis capilar 8.
      NOTA: Este es un punto de parada segura y cDNA puede ser almacenado a -20 ° C por hasta 7 días. Nota: Esta biblioteca se considera una biblioteca RNAseq.
      Los pasos subsiguientes conducen a una biblioteca de captura.

5. La hibridación, captura y secuenciación

  1. La hibridación multiplexado
    1. Retire las sondas hidratados encargo, ADN Cot-1, los oligonucleótidos de bloqueo universales, y el adaptador de oligonucleótidos bloqueantes específicos de -20 ° C y descongelar en hielo.
    2. En un tubo ml baja se unen 1.5, se combinan 500 ng de ADN (125 ng por muestra cuando la multiplexación 4 muestras), 5 l ADN Cot-1 (1 mg / l), 1UL oligos de bloqueo universales, p7 0,5 l (6 nucleótidos) adaptador específico el bloqueo de oligos (puede ser necesario ajustar dependiendo de conditi múltiplex esta cantidadons) y p7 0,5 l (8 nucleótidos) adaptador de oligonucleótidos bloqueantes específicos (pueden necesitar ser ajustados dependiendo de las condiciones multiplex) esta cantidad.
    3. Colocar el tubo de muestra en un concentrador de vacío con tapa abierta frente a la dirección opuesta a la rotación. contenido de secado a 45 ° C durante 20 min o hasta la completa evaporación del líquido.
    4. Resuspender el contenido seca con 8,5 l de 2x tampón de hibridación, la hibridación 3.4 l componente A y agua libre de nucleasa 1.1 l. Permita 10 minutos para la resuspensión y agitar cada 2,5 minutos. Transferencia de material resuspendido a un tubo de PCR de 0,2 ml y se incuba a 95 ° C durante 10 min en un ciclador térmico.
    5. Retire el tubo de muestra de hibridación de termociclador y añadir 2 l de sondas personalizadas resuspendidas a una concentración de 1,5 pmol / l. Alternativamente, añadir 4 l de sondas personalizadas resuspendidas a una concentración de 0,75 pmol / l. Incubar reacción de hibridación durante la noche (16-24 h) a 65 ° C.
      NOTA: Sondas comprados a varios vendedores se pueden utilizar y las instrucciones del fabricante deben ser seguidas. La duración de la etapa de hibridación también puede variar.
  2. Preparación del grano y captura
    1. Eliminar botella de perlas paramagnéticas de estreptavidina acoplada a partir de 4 ° C y se equilibre a temperatura ambiente durante 30 min. Diluir Los tampones de lavado 10X (I, II, III y estrictas) y 2,5 veces la gota de tampón de lavado para crear soluciones de trabajo 1x.
    2. Alícuota de 140 l de tampón de lavado 1x I en a un nuevo tubo de 1,5 ml. toda Heat cantidad de tampón 1x estrictas y alícuota de tampón de lavado 1x I a 65 ° C en un bloque de calor durante al menos 2 hr.
    3. Alícuota de 100 l de perlas paramagnéticas de estreptavidina acoplada por captura en un tubo de 1,5 ml. Colocar en imán y desechar el sobrenadante. Añadir 200 l de tampón de lavado del grano por cada 100 l perlas y agitar durante 10 seg. Colocar en el imán durante 2 - 5 min o hasta que el sobrenadante es claro. Una vez sobrenadante es claro, descartarlo y volverturba una vez más para un total de dos lavados.
    4. Tras la eliminación del tampón de lavado gota, añade la igualdad de tampón de lavado del grano volumen como el volumen inicial de partida (es decir, 100 l de una adquisición). Resuspender y la transferencia a un tubo de PCR de 0,2 ml. Coloque el tubo en la gradilla magnética durante 2 - 5 min o hasta que el sobrenadante es claro. sobrenadante de descarte.
    5. Con tanto en la muestra de hibridación y perlas en el ciclador térmico a 65 ° C, transferir la mezcla de hibridación a la de tubo de bolas y la pipeta arriba y abajo 10 veces para mezclar. Se incuba a 65 ° C durante 45 minutos, mezclar y centrifugar la muestra durante 4 segundos usando una velocidad fija (6,0 x g) de sobremesa minicentrifugadora.
  3. Bead Wash
    1. Retire el tubo de captura de termociclador y añadir 100 l precalentado 1x tampón de lavado I al tubo y agitar durante 10 segundos para mezclar. Transfiera la mezcla a un tubo nuevo mínimo de 1,5 ml se unen. Colocar el tubo en una gradilla de separación magnética y permita 2-5 min para la separación o hasta que el sobrenadante es claro. reiscard sobrenadante.
    2. Añadir 200 l precalentado tampón de lavado 1x estrictas y la pipeta hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Incubar a 65 ° C durante 5 min. Colocar el tubo en la gradilla de separación magnética y permita 2-3 min para la separación o hasta que el sobrenadante es claro. sobrenadante de descarte. Repetir el lavado astringente, una vez más para un total de dos lavados.
    3. Añadir 200 l 1x temperatura ambiente tampón de lavado I y agitar durante 2 minutos para mezclar. Colocar el tubo en la gradilla de separación magnética y permitiendo 2-5 min para la separación o hasta que el sobrenadante es claro. sobrenadante de descarte.
    4. Añadir 200 l 1x temperatura ambiente tampón de lavado II y agitar durante 1 minuto para mezclar. Colocar el tubo en la gradilla de separación magnética y permitiendo 2-5 min para la separación o hasta que el sobrenadante es claro. sobrenadante de descarte.
    5. Añadir 200 l 1x temperatura ambiente tampón de lavado III y agitar durante 30 segundos para mezclar. Colocar el tubo en la gradilla de separación magnética que permite 2-5 min para la separación o hasta que el sobrenadantees claro. sobrenadante de descarte.
    6. Retire el tubo del bastidor separación magnética y añadir 20 l de agua libre de nucleasa para volver a suspender las perlas. Mezcle bien con la pipeta hacia arriba y hacia abajo 10 veces.
  4. Captura posterior amplificación por PCR
    1. Eliminar perlas paramagnéticas de 4 ° C y se equilibre a temperatura ambiente durante 30 min.
    2. Retire el arranque en caliente PCR Ready Mix (2x) y PCR Primer Mix de -20 ° C y descongelar a temperatura ambiente y luego se coloca en hielo. Preparar la mezcla maestra de amplificación de la biblioteca mediante la combinación de 27,5 l de arranque en caliente 2x PCR Ready Mix con 2,75 l de PCR Primer 1 y 2,75 l de cebador de PCR 2 (estos volúmenes son para 1 biblioteca de hibridación más un 10% de exceso).
    3. Configuración de la reacción en el tubo de PCR mediante la adición de 20 l de perlas de más ADN capturado con 30 l de la amplificación de la biblioteca mezcla maestra para un volumen total de 50 l. Tape el tubo y agitar bien para mezclar. tubos de centrífuga de 4 segundos utilizando un mini pestaña velocidad fijale-centrífuga de 6,0 x g.
      1. Estableció el siguiente programa de PCR: elegir la opción tapa de precalentamiento y ajustado a 100 ° C, a continuación, establecer una desnaturalización inicial a 98 ° C durante 45 s, 10 - 12 ciclos de desnaturalización a 98 ° C durante 15 segundos, hibridación a 65 ° C durante 30 segundos y extensión a 72 ° C durante 60 segundos, un ciclo de extensión final a 72 ° C durante 60 segundos y mantener a 4 ° C.
    4. Retirar la muestra del termociclador y añadir 75 l perlas paramagnéticas. Mezclar bien e incubar a TA durante 15 min.
    5. Colocar los tubos en el imán a temperatura ambiente durante 2 - 3 minutos y luego retirar el sobrenadante. Lavar los granos en el imán añadiendo 200 l 80% de etanol, incubando durante 30 segundos y luego retirar el sobrenadante. Repita para un total de dos lavados de 80%.
    6. Incubar a temperatura ambiente durante 5 - 10 min para permitir que los granos se sequen. No se exceda en seco al agrietamiento. Volver a suspender las perlas en 22 l de Tris-EDTA pH 8,0 (solución TE 1x) y se deja 3 minutos para la elución. Coloque la muestra en el imán durante 3 - 5 min THen la transferencia de 20 l de producto eluido a un nuevo tubo de baja unen 1,5 ml, lo que garantiza que no hay cuentas son transferidas.
    7. Realizar cuantificación de cDNA capturados utilizando fluorómetro 7 y determinar la calidad de ADNc capturado utilizando un sistema de electroforesis capilar 8.
  5. Secuenciador de escritorio Cargando Procedimiento 9
    1. Diluir biblioteca de ADNc capturado a una concentración final de 4 nM utilizando 10 mM Tris-Cl pH 8,5 con 0,1% de Tween 20. Descongelar NaOH 10 N y tampón de hibridación en hielo. Aproximadamente 30 minutos antes de su uso, descongelar secuenciador de escritorio reactivo v2 caja del kit 1 en agua RT. No llene por encima de la línea de llenado MAX 10. Tenga en cuenta que este es un procedimiento específico plataforma de secuenciación y puede variar según las instrucciones del fabricante.
    2. Preparar 1 ml de NaOH 0,2 N mediante la combinación de 20 l de NaOH 10 N con agua libre de nucleasa 980 l en un tubo de microcentrífuga (prepare siempre fresco). Diluir la biblioteca PhiX (control de la biblioteca) a 4 nmla combinación de 2 l de 10 control de la biblioteca nM con 3 l de 10 mM Tris-Cl pH 8,5 con 0,1% de Tween 20.
    3. Desnaturalizar la biblioteca final y control de la biblioteca mediante la combinación de 5 l de la biblioteca 4 nM con 5 l de NaOH 0,2 N y agitar brevemente para mezclar. tubos de centrífuga de 4 segundos usando una centrífuga de mesa de mini-top velocidad fija en 6,0 x g. Incubar a RT durante 5 min para desnaturalizar las bibliotecas.
    4. Añadir 990 l de tampón de hibridación pre-refrigerada a los tubos que contienen 10 l de bibliotecas desnaturalizadas. Esto da como resultado una biblioteca de 20 pM. Marque la desnaturalizada biblioteca de 20 horas, con la fecha y se puede almacenar hasta por 3 semanas a -20 ° C.
    5. Mezclar 375 l de control de la biblioteca 20 pM con 225 l de tampón de hibridación pre-enfriada y control de la biblioteca se diluyó para dar lugar a un control de la biblioteca 24:05. Invierta varias veces para mezclar la solución.
    6. Combinar 594 l de la biblioteca definitiva desnaturalizado con 6 l de 24:05 desnaturalizada control de la biblioteca y agitar para mezclar. Ajuste el samp combinadoLe biblioteca y control de la biblioteca a un lado en hielo hasta que las muestras están listas para cargar en el cartucho de reactivos secuenciador de escritorio.

Análisis 6. Datos

  1. Evaluación de la Calidad de Secuencia
    1. Calcular la calidad de los datos de secuencia en bruto (archivos) utilizando FASTQ evaluación de la calidad de secuencia 11.
      NOTA: Este paso ayuda a evaluar los datos antes de que se somete además a un análisis de aguas abajo. El software funciona con los parámetros in-construidas y produce un conjunto de métricas para cada archivo FASTQ.
  2. Alineación
    1. Alinear la secuencia lee (archivos) a la FASTQ hg19 referencia del genoma humano y el transcriptoma utilizando Tophat2 12 (versión 2.0.10) mientras que proporciona transcripciones conocidas como archivo GTF. La salida está en la forma de un formato de alineación binario llamado el archivo de BAM.
    2. Realice los pasos de procesamiento posteriores, incluidos la clasificación y la indexación usando Samtools 13 (versión 0.1.19) En el archivo de BAM. Realizar duplicado marcado, la reordenación de SAM, inserte el cálculo del tamaño y la adición o sustitución grupos de lectura utilizando herramientas Picard 14 (versión 1.84).
  3. Evaluación de la Calidad RNAseq
    1. Calcular una serie de métricas de control de calidad para los datos de evaluación de la calidad RNAseq utilizando RNAseq. La entrada a este software es un archivo de BAM 15 de la alineación Tophat2. La salida es un archivo HTML que las listas de recuento de lecturas totales, duplicados, hicieron mapas de porcentaje y porcentaje ARNr, etc. leer, entre otros.
  4. Llamadas variante
    1. Utilice STAR (versión 2.4.0) 16 para la alineación y luego llamar a un solo nucleótido variantes de uso de GATK (Versión 3,3-0) HaplotypeCaller 17 .Siga GATK BAM pasos de post-procesamiento y criterios de filtrado para la bandera y eliminar los falsos positivos de la salida.
  5. La expresion genica
    1. Calcular la expresión génica USIsoftware ng Gemelos (versión 2.1.1) de la suite smoking 18.
      NOTA: La entrada es un archivo de BAM herramienta de alineación Tophat2. La salida se produce a nivel de la isoforma, transcripción de genes y, cuando la expresión se calcula como FPKM (fragmentos por Kilobase por millón asignada lecturas).
  6. Llamadas de fusión
    1. Llame a las fusiones de cada muestra utilizando ChimeraScan 19 (versión 0.4.5), Tophat Fusion 20 costumbre y TRUP 21. Anotar las fusiones de dominios usando Oncofuse 22 (versión 1.0.9b2).

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Resultados

A destacando esquemática pasos clave en Capture RNAseq se muestra en la Figura 1. Cuatro líneas celulares de cáncer con mutaciones conocidas se utilizaron para demostrar la eficacia de la técnica de RNAseq Capture (K562 con la fusión ABL1, LC2 con la fusión RET, EOL1 con la fusión PDGFRalpha y RT- 4 con la fusión FGFR3). Las cuatro muestras se agruparon y se secuenciaron con 2x 100 pb lee en un secuenciador de escritorio, que genera ar...

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Discusión

Captura RNAseq es una estrategia intermedia entre RNAseq y microarrays enfoques para la evaluación de una parte seleccionada del transcriptoma. Las ventajas de captura incluyen el costo, el tiempo de respuesta rápido redujeron en un secuenciador de escritorio, de alto rendimiento, y la detección de alteraciones genómicas. El método puede ser adaptado para caracterizar los ARN no codificantes 23, detectar solo nucleótido variantes 4-6, examinar empalme de ARN, y para identificar las fusiones de gene...

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Divulgaciones

S.R. recibe financiación de Novartis y Ariad Pharmaceuticals para la realización de ensayos clínicos. Los miembros de la familia inmediata de S.R. poseen acciones en Johnson and Johnson.

Agradecimientos

Damos las gracias especialmente a Ezra Lyon, Eliot Zhu, Michele Wing, Esko Kautto y Eric Samorodnitsky por su apoyo técnico. También nos gustaría agradecer a Jenny Badillo por su apoyo administrativo a nuestro equipo. Agradecemos al Centro de Supercomputación de Ohio (OSC) por proporcionar espacio en disco, capacidad de procesamiento y soporte para ejecutar nuestros análisis. Agradecemos al Centro Oncológico Integral (CCC, por sus siglas en inglés) del Centro Médico Wexner de la Universidad Estatal de Ohio por su apoyo administrativo a este trabajo. S.R. y su equipo cuentan con el apoyo de la Sociedad Americana del Cáncer (MRSG-12-194-01-TBG), un Premio al Investigador Joven de la Fundación del Cáncer de Próstata, NHGRI (UM1HG006508-01A1), la Fundación para la Investigación del Cáncer Fore, la Asociación Americana del Pulmón y Pelotonia.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Termomezclador REppendorf21516-166
Centrífuga 5417REppendorf5417R
miRNeasy Mini KitQiagen217004
Etanol de Grado de Biología MolecularSigma AldrichE7023-6X500ML
Thermoblock 24 x 1.5 mlEppendorf21516-166
MiSeq Reactivo Kit v2 (300- ciclos)IlluminaMS-102-2002
MiSeq Secuenciador de EscritorioIllumina
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
TruSeq Kit de ARN Total Trenzado con RiboZero Gold SetAIlluminaRS-122-2301
25 rxn xGen® Oligo de bloqueo universal - TS-p5IDT127040822
25 rxn xGen® Oligo de bloqueo universal - TS-p7(6nt)IDT127040823
25 rxn xGen® Oligo de bloqueo universal - TS-p7(8nt)IDT127040824
Agencourt® AMPure® XP - Perlas de purificación PCR Beckman-CoulterA63880
Dynabeads® M-270 StreptavidinLife Technologies65305
COT ADN humano, grado fluorométrico, 1 mgRoche Applied Science05480647001
Qubit® Tubos de ensayo Life TechnologiesQ32856
Qubit® dsDNA HS Kit de ensayoLife TechnologiesQ32851
SeqCap® Hibridación EZ y kits de lavado  (24 o 96 reacciones)Roche NimbleGen 05634261001 o 05634253001 
Qubit® 2.0 Fluorómetro Life TechnologiesQ32866
10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x Solución TE)IDT
Tween20 BioXtraSigmaP7949-500ML
Agua libre de nucleasasLife TechnologiesAM9937
C1000 Touch™ Termociclador con 96– Módulo de rección rápida de pozosBiorad185-1196
SeqCap EZ Kits de hibridación y lavado RocheApplied Science05634253001
SuperScript II Transcripción inversa 200 U/μ lTecnologías de la vida18064-014
D1000 ScreenTapeAgilent Technol. Inc.5067-5582
Agencourt RNAClean XP - 40 mlBeckman Coulter IncA63987
RNA ScreenTapeAgilent Technol. Inc.5067-5576
Escalera de cinta de ARNAgilent Technol. Inc.5067-5578
Tampón de muestra RNA ScreenTapeAgilent Technol. Inc.5067-5577
Hidróxido de sodioSigma72068-100ML
DynaBeads MyOne Estreptavidina T1Life Technologies65602
DYNAMAG -96 LADO CADA UNO LifeTechnologies12331D
CloroformoSigmaC2432-1L
KAPA HotStart ReadyMixKAPA BiosystemsKK2602
Espectrofotómetro NanoDrop 2000Thermo Scientific
My Block Mini baño secoBenchmarkBSH200
D1000 ReactivosAgilent Technol. Inc.5067- 5583
Vacufuge PlusEppendorf022829861 

Referencias

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