Describimos un método basado en la secuenciación de ARN dirigido que incluye la preparación de bibliotecas de ADNc indexadas, hibridación y captura con sondas personalizadas y análisis de datos para interrogar transcripciones seleccionadas para la expresión génica, mutaciones y fusiones de genes. Targeted RNAseq permite una evaluación rápida y rentable de transcripciones seleccionadas en un secuenciador de escritorio.
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Artículo de método
La secuenciación de ARN dirigidos Ensayo para caracterizar la expresión génica y la genómica alteraciones
En este artículo
Resumen
Resumen
la secuenciación de ARN (RNAseq) es un método versátil que puede ser utilizado para detectar y caracterizar la expresión génica, las mutaciones, las fusiones de genes, y noncoding RNAs. Estándar RNAseq requiere 30 - 100 millones de secuenciación lee y puede incluir varios productos de ARN como ARNm y ARN no codificantes. Demostramos cómo orientar las RNAseq (captura) permite un estudio centrado en productos de ARN seleccionados utilizando un secuenciador de escritorio. captura RNAseq puede caracterizar transcripciones anotadas, bajas, o expresado de forma transitoria que de otra manera no pueden ser detectados usando métodos tradicionales RNAseq. Aquí se describe la extracción de ARN a partir de líneas celulares, el agotamiento de ARN ribosomal, síntesis de ADNc, la preparación de bibliotecas de código de barras, la hibridación y la captura de las transcripciones específicas y la secuencia multiplex en un secuenciador de escritorio. También describimos la tubería análisis computacional, lo que incluye la evaluación del control de calidad, la alineación, la detección de la fusión, la cuantificación de la expresión génica y la identificación de un solo nucleotide variantes. Este ensayo permite la secuenciación de transcripción específico para caracterizar la expresión génica, fusiones de genes, y las mutaciones.
Introducción
El transcriptoma completo o secuenciación de ARN (RNAseq) es un método de secuenciación no sesgado para evaluar todos los productos de ARN. El objetivo de la secuenciación de ARNseq dirigida (captura) es una evaluación centrada de las transcripciones seleccionadas con una mayor sensibilidad, rango dinámico, reducción de coste o escala y mayor rendimiento en comparación con la RNAseq estándar. Al igual que el RNAseq estándar, los enfoques de enriquecimiento dirigido se pueden utilizar para evaluar la expresión génica, múltiples especies de ARN como ARNm, microARN (miARN), lncRNA1, otros ARN no codificantes2, fusiones de genes3 y mutacio....
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Protocolo
Nota: Este protocolo describe el procesamiento y el análisis de cuatro muestras simultánea. Este método es compatible con ARN aislado de células, tejido fresco congelado y tejido incluido en parafina fijado con formalina (FFPE). Este protocolo inicia con 50 - 1000 ng (250 ng recomendado) de iniciar la entrada de ARN para cada muestra.
1. El agotamiento de ARNr y la fragmentación de ARN Procedimiento
- El agotamiento rRNA
- Retire eluyen, prima, mezcla de fragmentos, ARNr mezcla de extracción, tampón de unión rRNA y tampón de resuspensión de -20 ° C y descongelar a temperatura ambiente. Eliminar el tampón d....
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Resultados
A destacando esquemática pasos clave en Capture RNAseq se muestra en la Figura 1. Cuatro líneas celulares de cáncer con mutaciones conocidas se utilizaron para demostrar la eficacia de la técnica de RNAseq Capture (K562 con la fusión ABL1, LC2 con la fusión RET, EOL1 con la fusión PDGFRalpha y RT- 4 con la fusión FGFR3). Las cuatro muestras se agruparon y se secuenciaron con 2x 100 pb lee en un secuenciador de escritorio, que genera ar.......
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Discusión
Captura RNAseq es una estrategia intermedia entre RNAseq y microarrays enfoques para la evaluación de una parte seleccionada del transcriptoma. Las ventajas de captura incluyen el costo, el tiempo de respuesta rápido redujeron en un secuenciador de escritorio, de alto rendimiento, y la detección de alteraciones genómicas. El método puede ser adaptado para caracterizar los ARN no codificantes 23, detectar solo nucleótido variantes 4-6, examinar empalme de ARN, y para identificar las fusiones de gene.......
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Divulgaciones
S.R. recibe financiación de Novartis y Ariad Pharmaceuticals para la realización de ensayos clínicos. Los miembros de la familia inmediata de S.R. poseen acciones en Johnson and Johnson.
Agradecimientos
Damos las gracias especialmente a Ezra Lyon, Eliot Zhu, Michele Wing, Esko Kautto y Eric Samorodnitsky por su apoyo técnico. También nos gustaría agradecer a Jenny Badillo por su apoyo administrativo a nuestro equipo. Agradecemos al Centro de Supercomputación de Ohio (OSC) por proporcionar espacio en disco, capacidad de procesamiento y soporte para ejecutar nuestros análisis. Agradecemos al Centro Oncológico Integral (CCC, por sus siglas en inglés) del Centro Médico Wexner de la Universidad Estatal de Ohio por su apoyo administrativo a este trabajo. S.R. y su equipo cuentan con el apoyo de la Sociedad Americana del Cáncer (MRSG-12-194-01-TBG), un Premio al Investigad....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Termomezclador R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Centrífuga 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| Etanol de Grado de Biología Molecular | Sigma Aldrich | E7023-6X500ML | |
| Thermoblock 24 x 1.5 ml | Eppendorf | 21516-166 | |
| MiSeq Reactivo Kit v2 (300- ciclos) | Illumina | MS-102-2002 | |
| MiSeq Secuenciador de Escritorio | Illumina | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| TruSeq Kit de ARN Total Trenzado con RiboZero Gold SetA | Illumina | RS-122-2301 | |
| 25 rxn xGen® Oligo de bloqueo universal - TS-p5 | IDT | 127040822 | |
| 25 rxn xGen® Oligo de bloqueo universal - TS-p7(6nt) | IDT | 127040823 | |
| 25 rxn xGen® Oligo de bloqueo universal - TS-p7(8nt) | IDT | 127040824 | |
| Agencourt® AMPure® XP - Perlas de purificación PCR | Beckman-Coulter | A63880 | |
| Dynabeads® M-270 Streptavidin | Life Technologies | 65305 | |
| COT ADN humano, grado fluorométrico, 1 mg | Roche Applied Science | 05480647001 | |
| Qubit® Tubos de ensayo | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit® dsDNA HS Kit de ensayo | Life Technologies | Q32851 | |
| SeqCap® Hibridación EZ y kits de lavado (24 o 96 reacciones) | Roche NimbleGen | 05634261001 o 05634253001 | |
| Qubit® 2.0 Fluorómetro | Life Technologies | Q32866 | |
| 10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x Solución TE) | IDT | ||
| Tween20 BioXtra | Sigma | P7949-500ML | |
| Agua libre de nucleasas | Life Technologies | AM9937 | |
| C1000 Touch™ Termociclador con 96– Módulo de rección rápida de pozos | Biorad | 185-1196 | |
| SeqCap EZ Kits de hibridación y lavado Roche | Applied Science | 05634253001 | |
| SuperScript II Transcripción inversa 200 U/μ l | Tecnologías de la vida | 18064-014 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5582 | |
| Agencourt RNAClean XP - 40 ml | Beckman Coulter Inc | A63987 | |
| RNA ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5576 | |
| Escalera de cinta de ARN | Agilent Technol. Inc. | 5067-5578 | |
| Tampón de muestra RNA ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5577 | |
| Hidróxido de sodio | Sigma | 72068-100ML | |
| DynaBeads MyOne Estreptavidina T1 | Life Technologies | 65602 | |
| DYNAMAG -96 LADO CADA UNO Life | Technologies | 12331D | |
| Cloroformo | Sigma | C2432-1L | |
| KAPA HotStart ReadyMix | KAPA Biosystems | KK2602 | |
| Espectrofotómetro NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| My Block Mini baño seco | Benchmark | BSH200 | |
| D1000 Reactivos | Agilent Technol. Inc. | 5067- 5583 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 022829861 |
Referencias
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
- Mercer, T. R., et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014....
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Reimpresiones y permisos
