Artículo de método

La eliminación de materiales exógenos de la parte exterior de congelados Núcleos para Investigar la antigua comunidades biológicas albergaba el interior

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DOI:

10.3791/54091

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3 de julio de 2016

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1Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 2Environmental Processes Branch, Environmental Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Vicksburg, MS, 3Terrestrial and Cryospheric Scienes Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 4Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Fairbanks, AK

En este artículo

Resumen

La criosfera ofrece acceso a los organismos conservados que persistieron en las condiciones ambientales del pasado. Un protocolo se presentará a recoger y descontaminar los núcleos de permafrost de suelos y hielo. La ausencia de colonias exógenos y el ADN sugiere que los microorganismos detectados representan el material, en lugar de la contaminación de la perforación o de procesamiento.

Resumen

La criosfera ofrece acceso a organismos preservados que persistieron en condiciones ambientales pasadas. De hecho, estos materiales congelados podrían reflejar las condiciones durante vastos períodos de tiempo y la investigación de los materiales biológicos albergados en su interior podría proporcionar información sobre los entornos antiguos. Para analizar adecuadamente estos ecosistemas y extraer información biológica significativa de los suelos congelados y el hielo, es necesario recolectar y procesar adecuadamente las muestras congeladas. Esto es especialmente crítico para los análisis microbianos y de ADN, ya que las comunidades presentes pueden ser muy diferentes de las modernas. Aquí, se presenta un protocolo para recolectar y descontaminar con éxito núcleos congelados. Tanto la ausencia de las colonias utilizadas para dopar la superficie exterior como el ADN exógeno sugieren que descontaminamos con éxito los núcleos congelados y que los microorganismos detectados procedían del material, en lugar de la contaminación de la perforación o el procesamiento de los núcleos.

Introducción

La criosfera (por ejemplo, los suelos de permafrost, características hielo, nieve glacial, firn y hielo) ofrece una visión de qué tipos de organismos persistido en las condiciones ambientales del pasado. Dado que estos sustratos pueden ser de decenas a cientos de miles de años de antigüedad, sus comunidades microbianas, cuando se conservan congeladas desde el depósito, reflejar las condiciones ambientales antiguos. Para analizar adecuadamente estos ecosistemas y extraer información biológica significativa de los suelos congelados y el hielo, la correcta recogida y procesamiento de las muestras congeladas es necesario. Esto es de suma importancia que las proyecciones climáticas para el siglo 21 indican la posibilidad de un calentamiento pronunciado en las regiones árticas y subárticas 1. En concreto, se espera que Alaska interior y Groenlandia para calentar aproximadamente a 5 ° C y 7 ° C, respectivamente, para el año 2100 2,3. Se espera que un impacto significativo en el suelo y las comunidades microbianas acuáticos y, por tanto, relacionadaprocesos biogeoquímicos. Se espera que las temperaturas más cálidas y alteración del régimen de precipitación para iniciar la degradación del permafrost en muchas áreas 2-5 que podría dar lugar a una más gruesa, descongelado estacionalmente (activo) capa 6,7, el deshielo de los suelos congelados, y el derretimiento del hielo cuerpos masivos como hielo del suelo, cuñas de hielo, y la segregación de hielo 8. Esto cambiaría drásticamente los atributos biogeoquímicos, además de la biodiversidad de plantas y animales en estos ecosistemas.

El hielo glaciar y las características de los sedimentos del permafrost y hielo syngenetic han atrapado evidencia biológica de un entorno que representa lo que vivía allí en el momento de las características químicas y forman. Por ejemplo, en Alaska interior, tanto Illinoisan y Wisconsin permafrost de edades están presentes, y dicha permafrost, en particular, ofrece lugares únicos que datan de lo moderno a 150.000 años antes del presente (aap) que contienen evidencia biológica y geoquímica de la IMPAct de los cambios climáticos pasados ​​en la biodiversidad. Como resultado, estos sedimentos proporcionan un registro de la biogeoquímica y la biodiversidad durante muchos miles de años. Puesto que el área tiene bajas tasas de sedimentación y nunca se ha glaciación, muestras inalteradas son accesibles para la recogida y el análisis, ya sea de perforación vertical en el perfil del suelo o de perforación horizontal en los túneles. Más importante aún, existen extensos registros que, sobre todo resaltar las características únicas de permafrost biogeoquímicos en esta región 9-14. En concreto, la aplicación del análisis de ADN para estimar la presencia y extensión de la biodiversidad en las dos muestras de hielo y permafrost existentes y antiguas permite la exploración de la conexión entre las condiciones ambientales y de hábitat antiguos de ocupación por parte de organismos específicos.

Estudios previos han identificado los impactos climáticos en mamíferos, plantas y microorganismos de muestras que datan de 50k aap 11, 15-19, aunque cada estudio utilizó una diferent metodología para recolectar y descontaminar el permafrost o hielo núcleos. En algunos casos, los núcleos de perforación se esterilizaron 16, 20-21, aunque la metodología específica no aclaró si los ácidos nucleicos extranjeros también fueron eliminados de las muestras. En otros estudios, aislamientos bacterianos 15 (por ejemplo, Serratia marcescens), así como microesferas fluorescentes 22 se han utilizado para medir la eficacia de los procedimientos de descontaminación.

Este experimento fue parte de un estudio más amplio que investiga las comunidades microbianas de muestras de permafrost que datan de aproximadamente 40k aap. El objetivo específico de esta parte del estudio era para descontaminar éxito de hielo y permafrost núcleos. Hasta donde sabemos, no existe una metodología ha integrado el uso de soluciones diseñadas para eliminar los ácidos nucleicos extraños y nucleasas asociados de la parte exterior de los núcleos congelados. Esto a pesar del hecho de que estas soluciones son commonly utilizado para descontaminar el equipo de laboratorio para experimentos moleculares.

Una vez que se descontaminan los núcleos, se extrajo ADN genómico utilizando los protocolos desarrollados por Griffiths et. Al 23 y Töwe et al. 24, cuantificado usando un espectrofotómetro, y se diluyó con agua estéril, libre de ADN para lograr 20 ng por reacción. Bacterianas 16S rRNA genes se amplificaron con cebadores 331F y 797R y la sonda BacTaq 25 y 16S arqueas rRNA genes se amplificaron con cebadores Arco 349F y Arco 806R y sondear TM Arco 516F 26 bajo las siguientes condiciones: 95 ° C durante 600 segundos seguido de 45 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 57 ° C durante 60 seg, y 72 ° C durante 25 seg con extensión final a 40 ° C durante 30 seg. Todas las reacciones de qPCR se llevaron a cabo por duplicado. Los volúmenes de reacción de 20 l incluyeron 20 ng de DNA, 10 mM de los cebadores, 5 mM de la sonda, y 10 l de la mezcla de reacción qPCR. normas for qPCR bacteriano y archaeal se prepararon utilizando el ADN genómico de Pseudomonas fluorescens y salinarum Halobacterium, respectivamente. Ambos fueron cultivadas hasta la fase logarítmica. Los recuentos de placas se llevaron a cabo y se aisló el ADN de los cultivos. El ADN genómico se cuantificó con un espectrofotómetro con la suposición de uno y seis copias del gen 16S rRNA por genoma de H. salinarum y P. fluorescens, respectivamente 27-28. número de copias de los genes bacterianos y archaeal se calcularon sobre la base de la curva estándar, log-transformados para dar cuenta de desigualdad de las diferencias entre los tratamientos, y se evaluaron mediante ANOVA.

Composición de la comunidad se determinó mediante la secuenciación del gen 16S rRNA utilizando células de flujo y las tecnologías de amplificación de puentes y el análisis de las comunidades con las ideas 'cuantitativos en la ecología microbiana' (QIIME) 29. Hacia adelante y hacia atrás dice estaban unidas entre sí y luego secuencias se filtraron, se indexan,y se seleccionaron los representantes de alta calidad para la asignación de novo unidades taxonómicas operacionales (OTU) a través de la alineación de secuencias con una base de datos de referencia. Alineado secuencias se compararon con una base de datos de referencia independiente para la asignación taxonómica. Una tabla OTU nivel phylum fue creado para determinar la composición de la comunidad en general.

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Protocolo

1. Equipo de Preparación y Core Collection permafrost

  1. la preparación del equipo y la recogida de muestras de campo y equipo de conservación
    1. Montar la barrena para la recogida de muestras insertando el adaptador de unidad en la parte superior del barril y la rotación de la palanca para bloquearlo en su sitio. Pin el tubo adaptador en el adaptador de la unidad y el pin del motor sobre el anillo adaptador. Inserte los cortadores en el cañón.
    2. Llevar trajes ligeros Los guantes de nitrilo, y máscaras para reducir la contaminación de las muestras. Use protección para los oídos y un casco de seguridad al entrar en el túnel del permafrost (Figura 1).
    3. Entrar en el túnel y seleccione una ubicación para recoger las muestras (Figura 1B).
      Nota: Para la ubicación de la perforación vertical u horizontal, seleccione una zona donde no se conoce evidencia de que el material se congela (por ejemplo, el hielo o permafrost), no hay grandes sistemas de raíces conocidas, y no hay grava conocida. Eliminar todoviviendo material vegetal de la zona antes de obtener la muestra. Si la perforación vertical u horizontalmente, seleccione un área que es relativamente plana y accesible con la barrena.
    4. Preparar una estación de trabajo por capas de suelo con un material plástico que ha sido esterilizada con 70% de isopropanol, la solución de descontaminación de ADN, y la solución de descontaminación RNasa.
    5. Colocar un 10 cm de diámetro de cloruro de polivinilo (PVC) de corte del tubo en la mitad longitudinalmente en la estación de trabajo para proporcionar un canal para contener los núcleos, ya que se eliminan de la barrena. Descontaminar el tubo de PVC con un 70% de isopropanol, solución descontaminante de ADN, y la solución de descontaminación RNasa.
    6. Cerca de la estación de trabajo, la descontaminación de la barrena rociándolo con isopropanol al 70%, solución de descontaminación de ADN, y la solución de descontaminación RNasa. Retire las soluciones de la barrena con un trapo.
  2. El hielo y el permafrost recogida y almacenamiento de núcleos
    1. Seleccionar un área de la pared de la muestra (véase 1.2.1Nota).
    2. Descontaminar aproximadamente 10 cm de diámetro del área de la pared congelada frotándola con isopropanol al 70%, solución de descontaminación de ADN, y la solución de descontaminación RNasa.
    3. Elevar la barrena descontaminado para el área de interés tal que es perpendicular a la zona de la muestra y comenzar la perforación en la cara limpia de la pared (Figura 1C, D).
    4. Retirar con cuidado el tornillo de la zona de recogida de muestras. Desconectar la barrena desde el motor y colocar el tornillo sin fin por encima de la tubería de PVC estéril en la estación de trabajo limpia. Incline con cuidado la barrena de tal manera que los núcleos congelados se deslizan sobre el tubo de PVC estéril (Figura 1E).
    5. Descontaminar los guantes con isopropanol al 70%, solución de descontaminación de ADN, y la solución de descontaminación RNasa.
    6. Recoger los núcleos de hielo y permafrost con guantes estériles y colocarlos en bolsas estériles.
    7. Coloque los núcleos en una habitación más fresca o fría hasta que sean enviados o procesados.
    8. ship los núcleos congelados utilizando hielo seco para mantenerlos a una temperatura por debajo de 0 ° C.
    9. Inmediatamente almacenar los núcleos a -80 ° C.

2. El permafrost y Procesamiento de núcleo de hielo

  1. Preparación de materiales
    1. Preparar, libre de lámina estéril de ácido nucleico de aluminio de alta resistencia, bastidores de metal, vidrio, unas pinzas de metal, y lana de vidrio por cocción en un horno a 450 ° C durante 4 horas. Ponga a un lado estos materiales hasta su uso.
    2. Esterilizar 95% de etanol y agua ultrapura haciendo pasar las soluciones a través de un filtro de 0,22 micras.
    3. Almacenar la solución de etanol a -20 ° C y agua a 4 ° C.
    4. Esterilizar una regla de plástico mediante pulverización con etanol al 70%, solución de descontaminación de ADN, y la solución de RNasa descontaminación y limpiar inmediatamente después de cada solución.
  2. Preparación bacteriana Cultura
    1. Preparar el caldo y placas de crecer Serratia marcescens.
      1. Para el caldo, se combinan 5 g intentoptone, 1 g de glucosa, 5 g de extracto de levadura, y 1 g de fosfato dibásico de potasio, y agua destilada a continuación, añadir para llegar a 1 L. Para hacer las placas, añadir 15 g de agar a la mezcla anterior. Para caldo y placas, ajustar el pH a 7 y autoclave a 121 ° C durante 15 min.
    2. Preparar la solución salina pulimentado fosfato 1x (PBS) mediante la combinación de 8 g de cloruro de sodio, 0,2 g de cloruro de potasio, 1,44 g de fosfato dibásico de sodio, y 0,24 g de fosfato de potasio monobásico y añadir agua destilada para llegar a 800 ml. Ajustar el pH a 7,4 y añadir agua destilada hasta llegar a 1 L. autoclave a 121 ° C durante 15 minutos.
    3. Inocular caldo con un asa estéril mediante la sumersión en el S. cultura marcescens que anteriormente se almacenaron congeladas a -80 ° C. En condiciones asépticas, diluido en serie del cultivo mediante la adición de 1 ml de cultivo a 9 ml de PBS y se invierte manualmente la solución. Añadir 1 ml de esta dilución a 9 ml de PBS e invertir manualmente la solución. Repita ocho veces más hasta un Dilu 10 -9ción se alcanza.
    4. Extender los 10 -6, -7 10, 10 -8, -9 y 10 soluciones sobre discos de agar mediante la distribución de 1 ml de caldo sobre la placa y la difusión con un esparcidor de células. Para ello, por triplicado por cada dilución. Almacenar la cultura original a 4 ° C.
    5. Incubar las placas a 30 ° C durante 24 horas. Contar el número de colonias para calcular el número de células en el cultivo original. Nota: El número de colonias en el cultivo original dependerá de la tasa de crecimiento de las bacterias.
    6. Pipetear 250 l de la cultura original en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Diluir cultivo original mediante la adición de un volumen suficiente de la 1x PBS para obtener aproximadamente 10 9 células / ml como se determina por recuento de colonias en el paso anterior. Sedimentar las células en un tubo de microcentrífuga por centrifugación a 2500 xg durante 10 min.
      Nota: El volumen de PBS 1x variará en función de la tasa de crecimiento de las bacterias.
    7. En una biohood estéril, Pipetear fuera el caldo y resuspender las células en 1 ml de 1x tampón de PBS. Almacenar a 4 ° C hasta su uso o aproximadamente dos meses.
    8. En el día del tratamiento, se diluye la S. cultura marcescens de la etapa 2.2.7 mediante la adición de 1 ml de la S. originales cultura marcescens a 39 ml de 1x tampón de PBS en un tubo de centrífuga de 50 ml.
  3. Preparar el espacio cuarto frío para el procesamiento de núcleo y equipo de conservación
    1. Antes de enfriar la habitación fría, paredes limpias, plantas, y una mesa de metal con una solución de lejía al 1%.
    2. Ajuste la temperatura de la habitación fría a aproximadamente -11 ° C.
    3. Una vez que el cuarto frío ha alcanzado la temperatura deseada, llevar trajes servicio liviano, guantes de nitrilo, y máscaras para reducir cualquier contaminación a la sala fría y las muestras.
      Nota: Se requieren dos individuos vestidos adecuadamente para este procedimiento.
    4. Trae los materiales estériles (por ejemplo, papel de aluminio, bastidores de metal, vidrio, bandeja, S. marcescens cultura, y microtomo cuchilla) y muestras en la cámara frigorífica y el lugar en la mesa estéril.
  4. Permafrost y procesamiento de muestras de hielo en una instalación de cuarto frío
    1. Coloque un núcleo de permafrost en una hoja estéril, libre de ácido nucleico de papel de aluminio.
    2. Ligeramente inocular el exterior del núcleo con el cultivo diluido de S. marcescens usando un tapón de espuma estéril (Figura 2B).
    3. Coloque el núcleo de la rejilla de metal estéril que se encuentra por encima de una bandeja.
    4. Esterilizar la hoja microtomo de acero con 70% de etanol, solución de descontaminación de ADN, y la solución de descontaminación RNasa.
    5. Tener individuo una guantes de nitrilo limpia con etanol al 70%, solución de descontaminación de ADN, y la solución de descontaminación RNasa y mantenga núcleo en un ángulo de 45 ° por encima de la bandeja.
    6. Tiene individual B raspar suavemente aproximadamente 5 mm de la parte exterior de todo el núcleo, incluyendo los extremos, utilizando la cuchilla estéril mientras Particular Un gira el núcleo después de cada raspadura ( Figuras 2C y 3A, B). Limpiar la cuchilla con 70% de etanol, solución de descontaminación de ADN, y la solución de descontaminación RNasa según sea necesario.
    7. Tiene individual B verter etanol al 95% esterilizada por filtración sobre el núcleo cuidadosa y rápidamente, mientras Particular Un gira el núcleo como se vierte la solución (Figuras 2D, 3C).
    8. Tiene individual B enjuague inmediatamente el núcleo con agua esterilizada por filtración.
    9. Instale la parrilla de metal utilizado en la bandeja con una nueva rejilla de metal estéril.
    10. Tiene particular Un limpiar sus guantes de nitrilo con etanol al 70%, solución de descontaminación de ADN, y la solución de descontaminación RNasa y mantener el núcleo en un ángulo de 45 ° por encima de la bandeja.
    11. Tiene individual B rociar todo el núcleo con una solución descontaminante de ADN.
    12. Tiene individual B enjuague inmediatamente el núcleo con agua esterilizada por filtración.
    13. Tiene individual B rociar todo el núcleo con una solución de descontaminación RNasa.
    14. tener IndividuAl B enjuague inmediatamente el núcleo con agua esterilizada por filtración.
    15. Coloque el núcleo en una hoja de papel de aluminio estéril y ligeramente envolver.
  5. núcleo externo deshielo
    1. Coloque una rejilla metálica estéril sobre una placa de vidrio estéril en un biohood estéril con flujo laminar.
    2. Coloque dos placas de agar específicos para S. marcescens en el plato de cristal por debajo de la rejilla estéril para recoger el líquido del núcleo (Figura 2E).
    3. Coloque el núcleo de la rejilla de metal estéril.
    4. Deje aproximadamente 2-5 mm de la superficie exterior del núcleo se descongele a 23 ° C (en promedio, esto ocurrirá dentro de aproximadamente 10 minutos). Gire el núcleo de aproximadamente 90 ° cada 2 min.
    5. Limpie toda la superficie del núcleo usando pinzas estériles y lana de vidrio estéril e inocular dos placas de agar específico para S. marcescens en muestras de secreciones de estos materiales sobre la superficie de las placas. Inocular dos nuevas placas con la cultura original utilizado para dopar el exterior de lanúcleo, que se expuso a las bajas temperaturas de la cámara fría.
    6. Medir las dimensiones exteriores de núcleo cilíndrico descongelado mediante la colocación de una regla estéril cerca de, pero sin tocar el núcleo.
    7. Coloque el núcleo en gran bolsa estéril y almacenarlo a -80 ° C.
  6. Compruebe para el crecimiento
    1. Incubar las placas de agar a 23 ° C durante una semana.
    2. Examinar las placas de agar para crecimiento de S. colonias marcescens.
      1. Si no hay colonias visibles en la placa, continúe en el paso 2.5.3.
      2. Si colonias aparecen en la placa, repita desde el paso 2.1.1 de la sección 2 "permafrost y procesamiento de muestras de hielo".
    3. Obtener el núcleo del congelador y asépticamente transferirlo a una bolsa estéril.
    4. Almacenar el núcleo en una bolsa estéril a 4 ° C durante aproximadamente 24-48 horas para descongelar todo el núcleo.

3. Obtener la submuestra para la extracción de ácidos nucleicos a partir de muestras de hielo y permafrost

  1. extracción de ácidos nucleicos a partir de muestras de hielo
    1. Mezclar el material descongelado a partir del núcleo de hielo agitando suavemente la bolsa (Figura 2G).
    2. Verter el material descongelado en un recipiente estéril con un filtro de 0,22 micras a vacío para recoger microorganismos.
    3. Asépticamente quitar el filtro con pinzas estériles y colocarlo en un tubo estéril de grano de cerámica 2 ml (1,4 mm).
    4. Guarde el filtro a -80 ° C.
  2. Extracción de ácido nucleico a partir de núcleos de permafrost
    1. Mezclar el material descongelado desde el núcleo permafrost amasando suavemente la bolsa.
    2. Después de que el permafrost se ha mezclado bien, obtener una submuestra de aproximadamente 0,5 g de suelo con una mayor scoopula estéril y colocarlo en un estériles de 2 ml tubo de cerámica del grano con tapón de rosca tarado (1,4 mm) que se encuentra en posición vertical sobre una balanza.
    3. submuestras almacenar a -80 ° C.
    4. Obtener el contenido de agua gravimétrica de muestras.
      1. Medir 10 g del permafrost con una estérile scoopula y colocar en un molde tarado en una balanza. Medir la masa húmeda de permafrost y estaño.
      2. Incubar permafrost en un horno a 105 ° C durante 24 horas. Medir la masa seca del permafrost y estaño.
      3. Calcular el contenido de agua gravimétrica restando la masa húmeda del permafrost por la masa seca del permafrost y dividiendo por la masa seca del permafrost.
    5. permafrost almacenar a -80 ° C.

4. Extraer los ácidos nucleicos de permafrost y hielo Núcleos

  1. preparación de la materia
    1. Preparar viales de color ámbar para contener soluciones mediante el tratamiento con 0,1% de dietilo (DEPC), incubando O / N a 37 ° C, y la esterilización en autoclave.
    2. Preparar la solución tampón de fosfato de potasio 240 mM. Añadir 2. 5 g de fosfato monobásico de potasio y 38,7 g de fosfato dibásico de potasio. Ajustar el volumen final de 500 ml mediante la adición de agua estéril.
    3. Preparar bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) buf extracciónfer disolviendo 4,1 g de cloruro de sodio en 80 ml de agua y añadiendo lentamente 10 g CTAB mientras se calienta y se agita. Ajustar el volumen final de 100 ml mediante la adición de agua estéril.
    4. Añadir volúmenes iguales de solución de tampón fosfato y tampón CTAB y esterilizar por filtración con un filtro de 0,22 micras. Cubra la botella con papel de aluminio y se almacena a temperatura ambiente.
    5. Preparar la solución de 1,6 M de cloruro de sodio (NaCl) mediante la combinación de 9,35 g de NaCl y 100 ml de agua estéril. Añadir 10 g de polietilenglicol 8000 a la solución y filtro esterilizar 1,6 M NaCl. Almacenar a 4 ° C.
  2. Extracción de ácido nucleico de acuerdo con una versión modificada de Griffiths et al. 22 y Töwe et al. 23
    1. Llevar trajes ligeros Los guantes de nitrilo, y máscaras. espacio de laboratorio limpia y pipetas con etanol al 70%, solución de descontaminación de ADN, y la solución de descontaminación RNasa.
    2. Retire submuestra (filtro de núcleo de hielo o muestra de suelo permafrost) en 2 ml de perlas de cerámica de tornillo-cap tubo de -80 ° C congelador y descongelar a temperatura ambiente.
    3. Añadir 0,5 ml de bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) de tampón de extracción y agitar brevemente.
    4. Añadir 0,5 ml de alcohol de fenol-cloroformo-isoamílico (25: 24: 1) (pH 8) y agitar los tubos en posición horizontal durante 10 min utilizando un adaptador de panel plano en un vórtice.
    5. Después de grano-late, tubos de centrifugación a 16.100 xg durante 5 min a 4 ° C.
    6. Eliminar la capa acuosa a un nuevo tubo estéril de 1,5 ml y se mezcla con un volumen igual de cloroformo-alcohol isoamílico (24: 1). Centrifugar a 16.100 xg durante 5 min a 4 ° C.
    7. Eliminar la capa acuosa a un nuevo tubo estéril de 1,5 ml y añadir dos volúmenes de 30% de polietilenglicol 8000 y 1,6 M NaCl. Incubar durante 2 horas a 4 ° C.
    8. Centrifugar a 16.100 xg durante 10 min a 4 ° C.
    9. Lavar pellet de ácido nucleico con aproximadamente 500 l de etanol al 70% enfriado en hielo y centrifugar a 16.100 xg durante 10 min a 4 ° C.
    10. pellet se seque al aire en un biohood estéril durante 2 horas. Resuspender en / tampón TE RNasa libre de DNasa 50 l (pH 8,0). ADN está listo para aplicaciones posteriores tales como PCR y qPCR.
    11. Determinar la concentración de ADN con un espectrofotómetro.
    12. Diluir ADN con agua estéril, libre de ADN para lograr 20 ng por reacción.

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Resultados

El método presentado podría ser utilizado para la descontaminación de muestras congeladas recogidas de varios ambientes criosfera, de hielo glacial a permafrost. A continuación, presentamos los datos recogidos específicamente a partir de muestras de hielo y permafrost recogidos de la Investigación Centro de Ingeniería y Desarrollo - Regiones de Investigación Fría y Laboratorio de Ingeniería (ERDC-CRREL) permafrost túnel situado en Fox, AK (Figura 1A y 1B).

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Discusión

La criosfera ofrece acceso a los organismos conservados que persistieron en las condiciones ambientales del pasado. A pesar de los taxones recuperado puede no representar la comunidad histórica completa, los recuperados a partir del análisis de las muestras de hielo y glaciares de permafrost es posible obtener valiosa información histórica acerca seleccione un intervalo de tiempo de 15-16. Por ejemplo, la información biológica significativa ha sido elaborado a partir de estudios que investigan la actividad an...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado a través del Centro de Investigación y Desarrollo de Ingenieros del Ejército de EE. UU., Oficina del Programa de Investigación Básica. El permiso para publicar esta información ha sido concedido por el Jefe de Ingenieros.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Establecimiento deInvestigación de Nieve, Hielo y Permafrost (SIPRE), Fairbanks, AK
70% de isopropanolWalmart551116880
95% de alcohol etílico (desnaturalizado) Fisher Scientific, Pittsburgh, PAA407-4
Solución de descontaminación de ADN, DNA AwayMolecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA7010
Solución de descontaminación de RNasa, RNase AwayMolecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA 7002
Trajes de trabajo ligeroKimberly-Clark Professional, Roswell, GA10606
Guantes de nitriloFisher Scientific, Pittsburgh, PAFFS-700
Curad, WalgreensCUR3845
Bolsas de muestras estériles Nasco, Fort Atkinson, WIB01445
Hoja de micrótomo de acero B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC
Estante de metalfabricado en CRREL, Hanover, NH
TrayHandy Paint Products, Chanhassen, MN7500-CC
Papel de aluminioWestern Plastics, Temecula, CA
Botella de 500 ml con 0.22  μ m FiltroCorning, Corning, NY430513
Serratia marcescensATCC, Manassas, VA17991
Campana de bioseguridadNuAire, Plymouth, MNNU-425-400
Placa de PetriFisher Scientific, Pittsburgh, PAFB0875712
ATCC Agar 181- TriptonaAcros Organics, NJ61184-5000
ATCC Agar 181- GlucosaFisher Scientific, Pittsburgh, PABP381-500
ATCC Agar 181- Extracto de levaduraFisher Scientific, Pittsburgh, PABP1422-500
ATCC Agar 181- Fosfato dipotásicoJT Baker, Phillipsburg, NJ3252-01
ATCC Agar 181- AgarDifco, Sparks, MD214530
NanoDrop 2000 EspectrofotómetroUV VisThermo Fisher Scientific, Wilmington, DE
Lightcycler 480 SystemRoche Molecular Systems, Inc., Indianápolis, IN
em>Halobacterium salinarumAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
em>Pseudomonas fluorescensAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Kit de aislamiento de ADN microbianoMoBio Laboratories, Carlsbad, CA12224-50
Protección auditivaElvexEP-201
Casco Kimwipes
Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA34705
Lana de vidrioPyrex430330
Regla
pesaje Lata Fisher Scientific, Pittsburgh, PA08-732-100
Cloruro de sodioSigma Aldrich, St Louis, MOS-9625
Cloruro de potasioJT Baker, Phillipsburg, NJ3040-04
Fosfato de potasio, monobásicoJT Baker, Phillipsburg, NJ  3246-01
Fosfato de potasio, dibásicoJT Baker, Phillipsburg, NJ3252-01
Fosfato de sodio dibásico, anhidroFisher Scientific, Pittsburgh, PABP332-500
Tubos de centrífuga de 50 ml Corning, Corning, NY4558
Tubos de microcentrífuga de 2 ml MoBioLaboratories, Carlsbad, CA1200-250-T
Tubos de perlas de cerámica de 2 ml (1.4  mm)MoBio Laboratories, Carlsbad, CA13113-50
ScoopulaThermo Fisher Scientific, Wilmington, DE1437520
BalanceOhaus, Parsippany, NJE12130
Dietilpirocarbonato (DEPC)Sigma Aldrich, St Louis, MOD5758
Hexadeciltrimetilammoniabromuro (CTAB) Acros Organics, NJ22716-5000
Polietilenglicol 8000 Sigma Aldrich, St Louis, MOP5413-1KG
Alcohol fenol-cloroformo-isoamílico (25:24:1) (pH 8) Fisher Scientific, Pittsburgh, PABP1752-400
CentrífugaEppendorf, Hauppauge, NY5417R
Cloroformo-alcohol isoamílico (24:1)Sigma Aldrich, St Louis, MOC0549-1PT
TE BufferAmbion (Thermo Fisher), Wilmington, DEAM9860
PipetsRainin, Woburn, MAPipet Lite XLS, 2, 10, 200 y 1,000 µ l pipetas
Puntas de pipetaRainin, Woburn, MARainin LTS preesterilizadas, baja retención, puntas filtradas, 10, 20, 200, 1.000  y micro; l
Vortexor, Bohemia, NYG-560
Adaptador de vórticeMoBio Laboratories, Carlsbad, CA13000-V1
Botella transparenteCorning, Corning, NYC1395500
Amber Bottle Corning, Corning, NY
Filtros de tapa de botella, 0.22  y micro; mCorning, Corning, NY 430513
Jeringa de 60 mlBecton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJBD 309653
Filtros de jeringa Millex, 0,22 μ mEMD Millipore, Billerica, MASLGV033RB 70
% EtanolFisher Scientific, Pittsburgh, PABP2818-500diluido y esterilizado por filtro
Horno Isotemp 100 LFisher Scientific, Pittsburgh, PA151030511
Esparcidor de célulasFisher Scientific, Pittsburgh, PA08-100-10
Asas de inoculación desechablesFisher Científico, Pittsburgh, PA22-363-602
Mascarillas antivirales << de Industrias científicas de C5135250

Referencias

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