Presentamos técnicas simples para aislar cromosomas gigantes lampbrush transcripcionalmente activas a partir de ovocitos de ranas y salamandras que viven. Se describe cómo observar estos cromosomas "vivo" por contraste de fase o contraste diferencial de interferencia, y la forma de solucionarlos por hibridación fluorescente in situ o tinción de inmunofluorescencia.
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Artículo de método
El aislamiento del gigante lampbrush cromosomas de estar ovocitos de ranas y salamandras
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Resumen
Resumen
Se describen métodos para el estudio de los cromosomas gigantes transcripcionalmente activos lampbrush (LBC) que se encuentran en el ovocito, o el huevo unlaid, de ranas y salamandras. LBC individuales pueden ser de hasta 1 mm de longitud y de que residan en un núcleo gigante, en sí hasta 0,5 mm de diámetro. El gran tamaño de los cromosomas permite observaciones sin precedentes de genes activos por microscopía óptica de luz, pero al mismo tiempo se requieren técnicas especiales para aislar el núcleo, la eliminación de la envoltura nuclear, y la difusión de los cromosomas en un portaobjetos de microscopio. El núcleo de los ovocitos, también llamada la vesícula germinal (GV), se aísla en un medio que permite la gelificación parcial de la actina nuclear y preserva la delicada estructura de las LBC. Este paso se lleva a cabo manualmente bajo un microscopio de disección utilizando pinzas de joyero. A continuación, se retira la envoltura nuclear, de nuevo manualmente con unas pinzas de joyero. Los contenidos nucleares se transfieren rápidamente a un medio que disperses el gel de actina y permite a los LBC en buen estado a asientan sobre un portaobjetos de microscopio. En este punto, los LBC y otros orgánulos nucleares pueden ser vistos por contraste de fase o de interferencia diferencial microscopía de contraste, aunque los detalles más finos están oscurecidos por el movimiento browniano. Para la observación microscópica alta resolución o el análisis molecular, toda la preparación se centrifugó para unir las LBC delicados firmemente a la diapositiva. Una breve fijación en paraformaldehído es seguido por la tinción de inmunofluorescencia o hibridación in situ. LBC están en un estado transcripcionalmente activo y su enorme tamaño permite el análisis molecular a nivel de genes individuales usando microscopía confocal o de super-resolución.
Introducción
La mayoría de los vertebrados, con la notable excepción de los marsupiales y mamíferos placentarios, producen huevos grandes con yema. A pesar de su enorme tamaño a veces, estos huevos son células individuales que llegan a su dimensión final, mientras que aún en el ovario de la hembra. Los huevos de ovario se denominan ovocitos y cada normalmente contiene un solo núcleo gigante, conocido desde principios del siglo 19 como la vesícula germinal o simplemente GV. 1 Los ovocitos de las ranas de laboratorio comunes, Xenopus laevis y Xenopus tropicalis, alcanzan un diámetro máximo de 1,2 mm y 0,8 mm, respectivamente (Figura 1....
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Protocolo
Información general acerca de las ranas y salamandras, así como fuentes de animales, se pueden encontrar en los siguientes sitios web: Xenbase (http://www.xenbase.org) y Sal-Site (http://www.ambystoma.org). Este protocolo sigue las pautas de cuidado animal del Departamento de Embriología de la Carnegie Institution for Science.
1. Soluciones
- Hacer 10 L "agua rana": Añadir 10 ml de 1 M de CaCl2 y 10 ml de 1 M de NaHCO3 a 10 L desionizada o sin cloro H2O con agitación.
- Hacer 1 L de 20% paraformaldehído hacer 1 litro de 4 mM de Na 2 CO 3. En una campana química añadir....
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Resultados
Para examinar los cromosomas gigantes lampbrush se comienza por aislar ovocitos de rana o una salamandra. La figura 1 muestra un grupo de oocitos maduros en una solución salina tamponada después de la eliminación de los ovarios de la rana, Xenopus. Tales ovocitos se mantienen en buen estado durante varios días a temperatura ambiente. El núcleo (o vesícula germinal) se retira entonces de un ovocito con unas pinzas de joyero, o bien en una solución salina .......
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Discusión
Las primeras observaciones de LBC "vivos" de Planos generales aislado a mano de ranas y salamandras se hicieron hace casi 80 años por el biólogo estadounidense William Duryee, 19 antes de la introducción de contraste de fases y microscopía DIC, antes de la inmunotinción fluorescente, y antes de FISH. Las ventajas de LBC para investigar los detalles de la estructura cromosómica y la transcripción en el desarrollo necesario nivel de genes individuales de técnicas para la fijación del LBC a portaobjeto.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio R01 GM33397. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. J.G.G. es profesor de Genética del Desarrollo de la Sociedad Americana Contra El Cáncer.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Paraformaldehído (grado reactivo, cristalino) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | A pesar de las advertencias en muchos protocolos, una solución concentrada puede almacenarse indefinidamente en RT |
| Etilo 3-aminobenzoato metanosulfonato | Sigma-Aldrich | A5040-100G | A veces denominado MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 punto cónico circular 3-0 suturas | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (cera de parafina) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| em>p-Fenilendiamina | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatina | Comercial de la tienda de comestibles | Knox funciona bien | |
| ProLong Gold montante antidecoloración | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Cubreobjetos Gold Seal 22 x 22 mm #1 1/2 (0,16 - 0,19 mm de grosor) | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 63786-01 | Estos cubreobjetos tienen el grosor recomendado para la microscopía de superresolución |
| Pinzas Dumont #5 | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Aceite de parafina (ligero) | EMD Chemicals | PX0047-1 | Para el aislamiento de GVs en aceite |
| Adhesivo in situ Cámaras de PCR e hibridación (25 µ L) | BioRad | Frame-Seal #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Aisladores de silicona | Grace-Biolabs | seleccionar del enlace del catálogo | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Frascos y platos de tinción Coplin | Ciencias de la Microscopía Electrónica | seleccionar del enlace | del catálogohttp://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
Referencias
- Purkinje, J. E. Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , Leopold Vossi. (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G.
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Reimpresiones y permisos
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