Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Una estrategia rápida para el aislamiento de nuevos Faustoviruses de muestras ambientales Uso

7.5K vistas

⸱

DOI:

10.3791/54104

⸱

4 de junio de 2016

 ,  ,  , 
1Faculty of Medicine and Pharmacy, Research Unit for Infectious and Tropical Emerging Diseases, Aix Marseille University, 2Pole of Infectious and Tropical Diseases, Clinical and Biological Sector, Federation of Bacteriology-Hygiene Virology, University Hospital Institute Mediterranean Infection

En este artículo

Resumen

Describimos aquí los últimos avances en aislamiento viral para la caracterización de nuevos genotipos de Faustovirus, un nuevo linaje de virus gigantes relacionado con asfarvirus. Este protocolo se puede aplicar al aislamiento de alto rendimiento de virus, especialmente virus gigantes que infectan amebas.

Resumen

El aislamiento del virus gigantes es de gran interés en esta nueva era de la virología, sobre todo porque estos virus gigantes están relacionadas con los protistas. virus gigantes pueden ser potencialmente patógenos para muchas especies de protistas. Pertenecen al orden descrito recientemente de Megavirales. El nuevo linaje Faustovirus que se ha aislado de muestras de aguas residuales está lejanamente relacionado con el virus de la peste porcina africana patógeno de mamífero. Este virus también es específico de su huésped amebas, vermiformis Vermamoeba, un protista común en los sistemas de agua para el cuidado de la salud. Es fundamental seguir aislando nuevos genotipos Faustovirus con el fin de ampliar su colección genotipo y estudiar su pan-genoma. Hemos desarrollado nuevas estrategias para el aislamiento de cepas adicionales mediante la mejora de la utilización de combinaciones de antibióticos y antifúngicos con el fin de evitar contaminaciones bacterianas y fúngicas de la ameba co-cultivo y favoreciendo la multiplicación del virus. También hemos implementado un nuevo starvation medio para mantener V. vermiformis en condiciones óptimas para el virus de co-cultivo. Por último, se utilizó citometría de flujo en lugar de la observación microscópica, que consume mucho tiempo, para detectar el efecto citopatogénico. Se obtuvieron dos aislamientos de muestras de aguas residuales, lo que demuestra la eficacia de este método y ampliando así la recogida de Faustoviruses, para entender mejor su medio ambiente, la especificidad del hospedador y contenido genético.

Introducción

El descubrimiento de virus gigantes, especialmente los que pertenecen a la orden Megavirales, cambió por completo el mundo de los virus en términos de tamaño de partícula y la complejidad del genoma. Los virus se pensaba que ser entidades pequeñas, y el Mimivirus parecieron romper todas las reglas. 1 metagenomic datos sugiere la ubicuidad de los virus gigantes no sólo en el medio ambiente, 2-5, sino también en los seres humanos. 6 Por lo tanto, todavía hay una necesidad para buscar estos virus a gran escala. La diversidad de estos virus gigantes se evaluó mediante el muestreo no sólo una variedad de ambientes acuáticos y sus sedimentos asociados en todo el mundo, 7-11, sino también por la selección de una variedad de muestras humanas 12,13 y muestras ambientales. 7,9 Los mimivirus Polyphaga Acanthamoeba fue aislado por co-cultivo usando protistas fagocíticas, principalmente Acanthamoeba spp. 14-16 Una colección completa de virus gigantes eran entonces tambiénaislado de este alojamiento protista especificado, lo que hizo que la comunidad científica restringir su procedimiento de la investigación y el aislamiento de Acanthamoeba spp. Es evidente que esta dependencia de una sola especie de acogida ha dado lugar a una gran parte de los virus que se pasa por alto. El hecho de que el virus gigante, CroV, se aisló con la gran movilidad roenbergensis protozoos marinos Cafetería, 17,18 demuestra la necesidad de utilizar una gama más amplia de protozoos con el fin de descubrir nuevos linajes o familias de virus gigantes. Reteno et al. Lograron seleccionar otros protozoos como anfitriones celulares que nunca antes se había utilizado, y se aisló el nuevo linaje relacionados con Asfar de virus gigantes (el recién nombrado Faustovirus). 19

En un intento de aislar nuevos genotipos Faustovirus con el fin de ampliar los miembros de este linaje viral, modificamos nuestros procedimientos de aislamiento y los utilizó para examinar muestras ambientales capaces de cosechar nuevos Faustoviruses. Nosotros entoncesse describe el protocolo completo para caracterizar los nuevos aislados. Se evaluó vermiformis Vermamoeba, el protista de vida libre más común encontrado en los ambientes humanos, 20-22 que ya se utiliza en el aislamiento del primer prototipo Faustovirus E12. 19 Este protista actualmente está siendo el anfitrión-específico para Faustovirus. Sabíamos que ninguno de los virus gigantes conocidos era patógena para esta ameba, porque no hay intentos de cultivar otros virus gigantes en nuestro laboratorio mostraron lisis ameba o el crecimiento viral. Por esta razón, nosotros creemos que V. vermiformis es el mejor y más exclusivo apoyo de células conocidas para aislar nuevos Faustoviruses.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Colección 1. Muestra

  1. Recoge 70 muestras de diferentes ambientes y regiones. En este caso, utilice los siguientes: 5 muestras de agua sucia de la localidad de Saint Pierre de Meyzoargues (Francia), 15 muestras del lago en Parc Borély en Marsella (Francia); 15 muestras de agua de mar con los sedimentos de las calas en Samena en Marsella (Francia), 25 muestras de agua del río de los Alpes (Francia), y finalmente, 10 muestras de aguas residuales en La Ciotat (Francia).
  2. muestras de vórtice para la homogeneización antes de la inoculación, durante un minuto a temperatura ambiente sin ningún tratamiento.

Procedimiento 2. Aislamiento

  1. Preparación para albergar procedimientos de ciego Cultura y la inoculación de la muestra
    1. V. Uso vermiformis (cepa CDC19) como un soporte de células para el co-cultivo.
    2. Mantener las amebas a 28 ° C, en un 75 cm matraz de cultivo de 2 células con 30 ml de medio de extracto de glucosa-proteasa-peptona-levadura (PYGRAMO). Por favor, compruebe la composición PYG en la Tabla 1.
      Nota: Después de 48 horas, las amebas se cuantifican mediante un recuento utilizando diapositivas de conteo normales (por ejemplo, Kovaslides).
    3. Células de la cosecha a una concentración de 5 x 5 10-6 10 células / ml, y pellet amebas por centrifugación a 720 xg durante 10 min.
    4. Eliminar el sobrenadante por aspiración y resuspender el pellet amebas en 30 ml de solución salina estéril amebas de Página (PAS) Tabla 1. Repita este procedimiento de enjuague.
    5. Vuelva a suspender amebas en 30 ml de medio de inanición con una mezcla de antibióticos y antifúngicos a una concentración de aproximadamente 10 6 amebas / ml. El medio de inanición es un medio de supervivencia para la ameba, lo que le permite mantenerse con vida y sin enquistamiento o multiplicación. Comprobar la composición en la Tabla 1.
      Nota: La mezcla de agente antimicrobiano contenía 10 mg / ml de vancomicina, 10 mg / ml imipenem, 20 g / ml de ciprofloxacina, 20 μg / ml de doxiciclina, y 20 mg / ml voriconazol. Esta mezcla sirve para reducir la contaminación bacteriana y fúngica que puede disminuir o alterar la multiplicación viral.
    6. Directamente inocular 25 l de cada muestra en el 200 l monocapa ameba en un fondo plano placa de 96 pocillos que favorece la adherencia ameba y se incuba a 30 ° C en un ambiente húmedo (un ambiente húmedo consiste en colocar una compresa húmeda dentro de la bolsa que contiene el placa con el fin de evitar la evaporación). Este es el primo-cultura. Dejar dos pozos de amebas sin ninguna inoculación de la muestra; esto actúa como el control negativo. Incubar este primo-cultivo durante tres días.
    7. Tres días después de la primera inoculación, sub-cultivo de la placa primo-cultura en amebas fresco como se describe anteriormente sin ninguna observación microscópica. Incubar la nueva placa durante tres días en las mismas condiciones que el primo-cultura.
    8. Realizar el cultivo final después de estos tres días de incubación de la misma manera como para THe primo- y sub-cultura. Incubar el cultivo final durante dos días. A continuación, proceder a la detección.
  2. La detección de la lisis por Automated Citometría de Flujo
    Nota: la cultura Ciegos junto con el flujo de citometría difiere del sistema anterior estándar de aislamiento. Es más sensible, preciso y automatizado. Para propósitos de detección, se aplicó una nueva técnica desarrollada para detectar lisis a la velocidad más alta y sin observación microscópica. Esta técnica es ventajosa para las muestras de cribado y tiene una mejor sensibilidad que las técnicas más antiguas. 7-9
    1. Utilice la placa de 96 pocillos de la final de co-cultivo para detectar la lisis.
    2. Encienda el citómetro y ejecutar un ciclo de limpieza y aclarado con el fin de obtener menor ruido de fondo de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    3. Poner en marcha el Sampler de alto rendimiento (HTS) combinado con citómetro de flujo para cargar automáticamente las muestras de la placa de 96 pocillos y realizar una adquisición completamente automatizada dentro de 40 min according con el protocolo del fabricante.
    4. Configurar el sistema de cine de la siguiente manera: 150 l volumen de la muestra, mezclando volumen de 50 l, 180 de velocidad, número de mezclas de mezcla 5, el volumen de lavado entre cada muestra de 400 l, caudal de 2,5 l / seg, el número de eventos registrados 10.000.
    5. Evaluar los pocillos de control negativo de la co-cultivo de micro-placa final de primera con el fin de puerta de la población ameba y para determinar el porcentaje de estas células huésped de acuerdo a sus características físicas. Asegúrese de tener una población homogénea ameba y una segunda población de unos acontecimientos inferiores correspondientes a los desechos y el ruido.
      Nota: Este procedimiento compuerta distingue restos subcelular y cúmulos de células individuales por tamaño, estimados por dispersión hacia adelante. Por tanto, es importante determinar con precisión el porcentaje de cada población usando el mejor procedimiento gating posible. Estos porcentajes pueden variar, especialmente si se utilizan muchos tipos de protozoos, así que es importante siempre tener un negativde control electrónico, que puede ser utilizado como la población de referencia para el resto de las muestras.
    6. Iniciar la compuerta haciendo clic en la muestra de adquisición.
    7. Registrar el número de eventos no menos de 10.000 eventos.
    8. Localizar la población ameba de interés utilizando la flecha. Esta es la forma de definir las puertas.
    9. Después de bloquear, dejar que el punto de HTS o localizar la placa haciendo clic en "Inicio", a continuación, ejecutar toda la placa automáticamente. Realizar adquisición y análisis de datos de acuerdo con los parámetros de tamaño y estructura (respectivamente, FSC (dispersión hacia adelante) y SSC (dispersión lateral)).
      Nota: La detección de la pérdida de la población de ameba cerrada señala la presencia de un agente patógeno responsable de la lisis ameba. lisis Protozoa asociado con infección por el virus se detecta con un umbral arbitrariamente diseñada de 50% de lisis de la población ameba cerrada por el analizador y en comparación con la misma población no infectada utilizado como control negativo fiable.
3. Caracterización de los nuevos aislados después de la detección de lisis

  1. La tinción preliminar para revelar la presencia de virus gigantes
    1. Después de la detección de lisis por citometría de flujo, pipetear los co-cultivos lisadas a suspender las amebas restantes. Entonces citocentrífuga directamente 50 l de la suspensión a 800 xg durante 10 min.
    2. Después de la centrifugación, fijar los portaobjetos con una solución de metanol puro. Manchar las diapositivas utilizando una tinción rápida comercial de Eosina / azul Azul y tinción DAPI y observar con un microscopio óptico con un aumento de 1.000X con el fin de comprobar la presencia de fábricas de virus.
      1. Para tinción rápida, sumergirse las diapositivas en la primera solución de eosina (4 sec repitió tres veces) y luego pasa directamente a sumergirse diapositivas en la segunda solución de fijación que contiene azul Azul durante 6 s, y finalmente enjuagar las diapositivas de 45 segundos con una solución tampón de fosfato pH 7,2. Deje secar los portas a temperatura ambiente, a continuación, proceder a observatien.
      2. Para la tinción DAPI, depósito de 15 l de la solución madre comercial DAPI sobre el portaobjetos seco fijo. Proteger de la luz a continuación, proceder a la observación.
  2. Microscopio de electrones
    1. Después de la primera identificación en las diapositivas, evaluar la presencia del virus gigante través de la observación de microscopía electrónica de las culturas sobrenadante.
    2. Depósito de 5 l de la muestra positiva sobre la rejilla descargada brillan. Esperar aproximadamente 20 min a temperatura ambiente.
    3. Se seca la rejilla con cuidado y depósito en él una pequeña gota de molibdato de amonio al 1% durante 10 seg. Deje la rejilla para secar durante 5 minutos.
    4. Continúe con Microscopía Electrónica a 200 keV.
    5. Coloque la rejilla en el soporte; introducir el soporte en el microscopio. Compruebe el resumen de vacío haciendo clic en el icono correspondiente. Cierre las válvulas y comienzan observación en un tamaño de punto 5, y el aumento de x 25.000.
    6. Medir el virus gigante usando ImageJ o directaLy en el microscopio utilizando la herramienta de medida del microscopio se encuentra en la pantalla de adquisición.
      Nota: Clasificar la muestra en el grupo Faustovirus con un tamaño de la cápside de aproximadamente 200 nm.
  3. Biología Molecular
    Nota: Después de esta identificación, pruebas de biología molecular fueron cruciales para la confirmación con el fin de distinguir Faustovirus de Marseillevirus, que tiene el mismo tamaño de la cápside y la apariencia bajo el microscopio electrónico, aunque no tienen la misma especificidad de huésped. El Marseillevirus no puede crecer en Vermamoeba, el Faustovirus es específico para Vermamoeba y todos los intentos de hacer crecer en otras amebas como Acanthamoeba han fracasado hasta la fecha. El diseño y la aplicación de los sistemas de cebadores / sondas específicas enumeradas en las obras de Reteno et al. permitido una clasificación preliminar más precisa de los virus recién aislados a través de la amplificación y secuenciación de los genes virales.
    1. ExADN tracto partir de las muestras de cultivo positivo usando un sistema de extracción automatizada de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    2. Realizar PCR en tiempo real utilizando un termociclador como se describe en Reteno et al. 19
    3. Secuencia usando los mismos cebadores que se usaron para la amplificación. Usa los cebadores dirigidos dirigida por ADN polimerasa de ARN de la subunidad 1 gen: CAT Fstv_S2F 5'-CCA GGA GAT CAC ATA GGT G-3 '(hacia adelante) y Fstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC AGT AAT A-3' (inverso) con la sonda Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA.

4. Virus de Producción, purificación y secuenciación del genoma

  1. Subcultura de la misma cultura ameba virus para el punto final clonación de dilución.
  2. Para la producción: preparar 20 matraces que contenían 30 ml de PYG, 10 ml de vermiformis Vermamoeba y 5 ml del virus aislado ya transferido de pozos a los pequeños frascos.
  3. Se incuba a 30 ° C hasta su completala lisis de la ameba. Observar todos los días por microscopía óptica invertida hasta que todas las amebas son lisadas.
  4. Después de la lisis completa, en común todos los frascos en un solo recipiente. Filtro con un filtro de 0,45 micras para eliminar los desechos.
  5. Iniciar la purificación mediante ultracentrifugación a 89.800 xg durante 75 min. Asegúrese de calibrar el peso de los tubos antes de iniciar la centrifugación.
  6. Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante de cada tubo por aspiración y resuspender el sedimento en PAS con el mismo volumen utilizado para la calibración, antes de repetir la centrifugación.
  7. Como el anterior, eliminar el sobrenadante y volver a suspender todos los gránulos en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  8. Se purifica el virus que se produce, con el 25% de sacarosa (27,5 g de sacarosa en 100 ml de PBS, se filtró sobre un filtro de 0,22 micras).
    1. Utilice 8 ml de sacarosa y 2 ml de la suspensión viral. Centrifugar a 89.800 xg durante 1 h 15 min. Volver a suspender el sedimento en 1 ml de PBS. Almacenar a -80 ° C.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

El sistema estudiado en este manuscrito validado su prueba de concepto mediante el aislamiento de dos nuevas Faustoviruses. De las 70 muestras analizadas, se detectaron dos episodios de lisis, a diferencia de nuestros controles negativos fiables. El control negativo para la lisis contenía una población ameba 86%. Por el contrario, las muestras positivas (ST1 de Saint Pierre de Meyzoargues), y (LC9 para la muestra La Ciotat 9) mostraron una disminución dramática en las amebas cerrada; más...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

La posibilidad de que Faustovirus podría ser el primer miembro de una nueva familia Megavirales cerca de VPPA se sugirió por primera vez por Reteno et al., 19 pero algunas diferencias todavía se puede distinguir. Parece claro si Faustovirus debe unirse a la familia Asfarviridae o si debería en cambio formar una nueva familia viral putativa. Este problema será necesario estudiar más detalladamente, en particular, una caracterización más completa de su morfología, la gama de huéspedes, ciclo de replica...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Los autores no tienen agradecimientos que hacer.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Citómetro LSR FORTESSA BD BiosciencesFrance 649225B4
TECNAI G2 F20FEIAlemania  5027/11
Microscopio óptico invertidoleica Francia72643
Extracción de ADNQiagen EZ1 Advanced XL Robot de extracciónFrancia  L106A0452
Ciclador PCR CFX96Bio radFrance785BR06298
Medio PYG, PAS, Medio de inaniciónProducción propia en laboratorio Marsella URMITEx
Amoeba cepa CDC-19ATCCFrance50237
PlacasCellstarFrance655180
PCR materiales, cebadores. eurogentecFrancePrimers citados en el manuscrito
diapositiva vítrea 10 con rejillasKova EE. UU
H899871441F Eosin/tinción azul Azur-HemacolorMilipore Merck Francia111955,6,57,109468
Filtros accionados por vacíoThermo scientificFrance BPV4550/ 20170115
Solución salina tamponada con fosfatoThermo Fisher scientific Francia  10010-023
Tinte DAPILife Technologies Francia  D1306
cytospin 4 citocentrífugaThermo Fisher scientificFrance10522013JT184-31
Túnel de citología simpleBiomedical polymers inc.FranciaBMP-cyto-S50
Redes de carbono EuromedexFrancia FCF400NI
Molibdato de amonioVWR internationanl Francia  21276185
Frascos SARSTEDTAlemania833911
0,22 μ m filtros Milex millipor FranciaSE2M229104
Ultracentrífuga Sorval WX 80Thermo scientificFrance9102448
Filtros de flujo rápidoNalgeneFrance450-0020
.

Referencias

  1. Raoult, D., et al. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).
  2. Claverie, J. -M. Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop. Virol J. 2, 52-52 (2004).
  3. Monier, A. A., et al. Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses. Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).
  4. Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea. Genome Biol. , (2008).
  5. Claverie, J. -M., et al. Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges. J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).
  6. Colson, P., et al. Evidence of the megavirome in humans. J Clin Virol. 57 (3), 191-200 (2013).
  7. La Scola, B., et al. Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry. Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).
  8. Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ Microbiol. , (2012).
  9. Pagnier, I., et al. A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba. Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).
  10. Philippe, N., et al. Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
  11. Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. PNAS. , (2014).
  12. Saadi, H., et al. First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia. Clin Infect Dis. , (2013).
  13. Saadi, H., et al. Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia. Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).
  14. Claverie, J. -M., Abergel, C. Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses. Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).
  15. Colson, P., et al. Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes. Genome Biol Evol. 3 (0), 737-742 (2010).
  16. Claverie, J. -M., Abergel, C. Open questions about giant viruses. Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).
  17. Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).
  18. Van Etten, J. L. Another really, really big virus. Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).
  19. Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. J.Virol. , (2015).
  20. Coşkun, K. A., Ozçelik, S., Tutar, L., Elaldı, N., Tutar, Y. Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey. Biomed res Int. 2013, 675145(2013).
  21. Bradbury, R. S. Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture. J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).
  22. Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water. Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).
  23. Ogata, H., Toyoda, K., et al. Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus. Virol J. 6, 178-178 (2008).
  24. Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama. Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Aislamiento de faustoviruscitometr a de flujomezcla de antibi ticos y antif ngicosmedio de inanici ndetecci n del efecto citop ticomicroscop a electr nicatinci n de f bricas viralesprocesamiento de muestras de aguas residualescocultivo con amebas
Una estrategia rápida para el aislamiento de nuevos Faustoviruses de muestras ambientales Uso
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.