Artículo de método

Entrega de Therapeutic siRNA al SNC Usando catiónicos y aniónicos Los liposomas

DOI:

10.3791/54106

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23 de julio de 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Colorado State University

En este artículo

Resumen

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El objetivo de este protocolo es utilizar liposomas catiónicos/aniónicos con un péptido neuro-dirigido como sistema de administración del SNC para permitir que el siRNA atraviese la BBB. La optimización de un sistema de administración de tratamientos, como el siRNA, permitiría más opciones de tratamiento para los priones y otras enfermedades neurodegenerativas.

Resumen

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Las enfermedades priónicas son el resultado del mal plegamiento de la proteína priónica celular normal (PrPC) a un isómero anormal resistente a la proteasa llamado PrPRes. La aparición de enfermedades priónicas en las poblaciones de fauna silvestre y su creciente amenaza para la salud humana ha llevado a aumentar los esfuerzos para encontrar un tratamiento para estas enfermedades. Estudios recientes han encontrado numerosos compuestos antipriónicos que pueden inhibir el isómero infeccioso PrPRes o regular a la baja la proteína priónica celular normal. Sin embargo, la mayoría de estos compuestos no atraviesan la barrera hematoencefálica para inhibir eficazmente la formación de PrPRes en el tejido cerebral, no se dirigen específicamente a la PrPC neuronal y, a menudo, son demasiado tóxicos para su uso en animales o seres humanos.

Investigamos si el siRNA administrado por vía intravascular y dirigido a la PrPC neuronal es un compuesto antipriónico más seguro y eficaz. Este informe describe un protocolo para producir dos vehículos de administración liposomal de siRNA y para empaquetar y administrar siRNA de PrP a las células neuronales. Los dos vehículos de administración liposomal son 1) la formulación de liposomas de siRNA complejados que utiliza liposomas catiónicos (LSPC) y 2) la formulación de liposomas de siRNA encapsulados que utilizan liposomas catiónicos o aniónicos (PALETS). En el caso de los LSPC, el siRNA cargado negativamente se une electrostáticamente al liposoma catiónico. Se añade al complejo un péptido cargado positivamente (RVG-9r [glicoproteína del virus de la rabia]), que se dirige específicamente a los complejos liposoma-siRNA-péptido (LSPC) a través de la barrera hematoencefálica (BBB) para las neuronas que expresan acetilcolina en el sistema nervioso central (SNC). Para los PALETS (siRNA terapéutico encapsulado con liposomas dirigidos a péptidos), los lípidos catiónicos y aniónicos fueron rehidratados por el siRNA de PrP. Este procedimiento da como resultado la encapsulación del siRNA dentro de los liposomas catiónicos o aniónicos. Una vez más, el neuropéptido RVG-9r se unió a los liposomas para dirigirse a los complejos siRNA/liposomas al SNC. Con el uso de estas formulaciones, hemos entregado con éxito siRNA de PrP a las neuronas que expresan AchR y hemos disminuido la expresión de PrPC de las neuronas en el SNC.

Introducción

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Los priones son enfermedades neurodegenerativas graves que afectan el SNC. Las enfermedades priónicas son el resultado de la mal plegamiento de la proteína priónica celular normal, PrP C, por un isómero infecciosa llamada PrP Res. Estas enfermedades afectan a una amplia variedad de especies, incluyendo la encefalopatía espongiforme bovina en vacas, scrapie en ovejas, la caquexia crónica en los cérvidos, y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en humanos 1-3. Los priones causan neurodegeneración que se inicia con la pérdida sináptica, y progresa a vacuolización, gliosis, pérdida neuronal, y los depósitos de placa. Con el tiempo, dando como resultado la muerte del animal / persona 4. Durante décadas, los investigadores han investigado compuestos destinados a ralentizar o detener la progresión de la enfermedad priónica. Sin embargo, los investigadores no han encontrado ya sea una terapia exitosa o un vehículo de administración sistémica eficaz.

Se requiere la expresión endógena PrP C para el desarrollo de las enfermedades priónicas 5 . Por lo tanto, disminuir o eliminar la expresión de PrP C puede resultar en un retraso o mejora de la enfermedad. Varios grupos crearon ratones transgénicos con niveles reducidos de PrP C o lentivectores inyectados que expresan shRNA directamente en el tejido cerebral murino para investigar el papel de los niveles de expresión PrP C en la enfermedad priónica. Estos investigadores han encontrado que reduce la cantidad de PrP C neuronal resultó en la detención de la neuropatología progresivo de las enfermedades priónicas y extendieron la vida de los animales 6-9. Nos han informado de que los resultados del tratamiento PrP C siRNA en el aclaramiento de la PrP Res en células de neuroblastoma de ratón 10. Estos estudios sugieren que el uso de terapias para disminuir PrP C los niveles de expresión, como pequeños ARN de interferencia (siRNA), que escinde mRNA, puede suficientemente retrasar la progresión de las enfermedades priónicas. Sin embargo, la mayoría de las terapias para las enfermedades priónicas investigados fueron entregados en una forma que no sería prácticoen un entorno clínico. Por lo tanto, una terapia de ARNip necesita un sistema de administración sistémica, que se entrega por vía intravenosa y dirigido al SNC.

Los investigadores han estudiado el uso de liposomas como vehículos de administración para los productos de terapia génica. Los lípidos catiónicos y aniónicos se utilizan ambos en la formación de liposomas. Los lípidos catiónicos son los más utilizados que los lípidos aniónicos debido a que la diferencia de carga entre el lípido catiónico y el ADN / ARN permite para el embalaje eficiente. Otra ventaja de los lípidos catiónicos es que atraviesan la membrana celular más fácilmente que otros lípidos 11-14. Sin embargo, los lípidos catiónicos son más inmunogénicos que los lípidos aniónicos 13,14. Por lo tanto, los investigadores han comenzado a cambiar el uso catiónico a los tensioactivos aniónicos lípidos en liposomas. Productos de terapia génica se pueden empaquetar de manera eficiente en liposomas aniónicos utilizando el péptido cargado positivamente sulfato de protamina, que se condensa moléculas de ADN / ARN de 15-19. Desde lipi aniónicods son menos inmunogénicas que los lípidos catiónicos que pueden haber aumento de los tiempos de circulación, y pueden ser más toleradas en modelos animales 13,14. Los liposomas se dirigen a tejidos específicos utilizando péptidos dirigidos que se unen a los liposomas. El neuropéptido RVG-9R, que se une a los receptores nicotínicos de la acetilcolina, se ha utilizado para orientar siRNA y liposomas para el SNC 17-20.

Este informe describe un protocolo para producir tres vehículos de entrega de siRNA, y para empaquetar y entregar el siRNA para las células neuronales (Figura 1). complejos liposoma-siRNA-péptido (LSPCs) se componen de liposomas con siRNA y el RVG-9R péptido dirigido electrostáticamente unidos a la superficie exterior del liposoma. Péptido dirigida encapsulado en liposomas terapéuticos siRNA (PALETS) se componen de siRNA y protamina encapsulado dentro del liposoma, con RVG-9R covalentemente unido a grupos PEG de lípidos. El uso de los métodos siguientes para generar LSPCs y PALETS, PrP C siRNA disminuye la expresión PrP C hasta el 90% en las células neuronales, que posee una gran promesa para curar o retrasar la aparición de patología de la enfermedad de priones sustancialmente.

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Protocolo

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Todos los animales fueron criados y mantenidos en el laboratorio de Recursos Animales, acreditados por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International, de acuerdo con los protocolos aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad del Estado de Colorado.

1. Preparación de LSPCs

  1. Use un 1: 1 de DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano): la proporción de colesterol para LSPCs. Para una preparación de liposomas nmol 4, mezclar 2 nmoles de DOTAP y 2 nmoles de colesterol en 10 ml de una solución 1: metanol en un matraz: cloroformo 1.
  2. Evaporar 9 ml de cloroformo: solución de metanol usando N 2 gas en una campana de humos. Evaporar los últimos 1 ml de disolvente en una campana de humos durante la noche sin gas. Observar una película delgada de lípidos en el fondo del matraz.
  3. Heat 10 ml de una solución de sacarosa al 10% a 55 ° C.
  4. Se vierte la solución de sacarosa al 10% se calienta a la película lipídica delgada lentamente, es decir, 1 ml / min, mientras que gently agitando el matraz. Mantener la sacarosa 10% y el matraz con lípidos a 55 ° C de modo que las moléculas de lípidos permanecen en la fase de gel-líquido. resultados de rehidratación en la formación de vesículas multilamelares (MLV).
  5. Permitir lípidos para rehidratar a 55 ° C durante al menos una hora antes de dimensionar los liposomas.
  6. Montar un extrusor según las instrucciones del fabricante con 1,0 micras filtros o usar filtros de jeringa de 1,0 micras para el dimensionamiento.
  7. Añadir 1 ml de la suspensión de liposomas se calentó a una de las jeringas en la extrusora, y pasar la suspensión entre las dos jeringas 11 veces. Asegúrese de que la suspensión está en la jeringa opuesta a la jeringa comienza después de los 11 pases.
  8. Tamaño de los liposomas de nuevo a través de 0,45 micras y luego 0,2 micras filtros para generar grandes vesículas unilamelares (LUV). Mantener la suspensión de liposomas se calienta para el dimensionamiento más fácil.
  9. Incubar 20 l de la suspensión de liposomas 4 nmol (200 M) con 200 l de un 20 micras (4total de nmol) solución madre de siRNA para 10 min a temperatura ambiente.
  10. Incubar 80 l de una 500 mM (40 nmol total de) solución RVG-9R de valores con la solución / liposoma siRNA durante 10 min a RT. LSPCs deben utilizarse tan pronto como sea posible, pero se pueden utilizar hasta varias horas después de la preparación. LSPCs se almacena a 4 ° C durante varias horas después de la preparación.

2. Preparación de palets

  1. Use un 55: 5 relación molar de cualquiera de DSPE (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina):: 40 colesterol: DSPE-PEG o DOTAP: colesterol: DSPE-PEG para PALETS. Para una preparación de liposomas nmol 4, mezclar 2,2 nmoles de o bien DSPE o DOTAP, 1,6 nmoles de colesterol, y 0,2 nmoles de DSPE-PEG en 10 ml de una mezcla 2: solución de metanol en un matraz: cloroformo 1.
  2. Preparar suspensión de liposomas exactamente como se describe en el paso 1.1 y 1.2 anterior. Rehidratar los liposomas DSPE en 10 ml de PBS 1x calentó a 75 ° C, la adición de 1 ml / min. Permitir lípidos para rehidratar a 75 ° C durante por lopor lo menos 1 hora antes de dimensionar.
  3. Tamaño de la suspensión de liposomas exactamente como se describe en el Paso 1.6 a 1.8.
  4. Pipetear 20 l de cada una de las suspensiones de liposomas 4 nmol (200 mM) en alícuotas de un solo uso después de DOTAP y DSPE liposomas han sido tamaño, y liofilizar durante 30 minutos utilizando un secador de congelación de sobremesa (Figura 2).
  5. Incubar 200 l de una solución madre 20 mM (4 en total nmol) siRNA con 1,4 l de una solución 26,6 M de sulfato de protamina durante 10 min a RT para siRNA que ha de ser encapsulado en liposomas DSPE PALETS.
  6. Rehidratar los liposomas DOTAP palets 200 l de una solución madre nmol 4 de siRNA o rehidratar los liposomas DSPE palets 201,4 l de la solución / protamina siRNA. Incubar solución / siRNA liposoma durante 10 min a RT.
  7. Añadir 10 l de una solución 60 mM de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) a la solución de liposomas / siRNA para ambos DOTAP y DSPE PALETS.
  8. Añadir 10 l de una solución 150 mM N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS) a la solución de liposomas / siRNA para ambos DOTAP y DSPE PALETS.
  9. Incubar la EDC y sulfo-NHS con la suspensión / liposoma siRNA durante 2 horas a RT.
  10. Incubar 80 l de una 500 mM (40 nmol total de) solución RVG-9R de valores con el siRNA / liposoma solución durante 10 min a RT reticulación.
    NOTA: La EDC / sulfo-NHS permite la RVG-9r para unir covalentemente a los lípidos PEG. PALETS utilizar dentro de varias horas después de la preparación. PALETS se almacena a 4 ° C durante varias horas después de la preparación.
  11. Para determinar la eficiencia de encapsulación siRNA de palets:
    1. Medir la concentración de siRNA antes y después de la adición de protamina y liposomas usando un espectrofotómetro ajustado a 260 nm.
    2. Se filtra la no encapsulado siRNA desde el liposoma suspensión siRNA / encapsulado usando 50 kDa filtros centrífugos. Centrifugar a 1000 xg durante 20 min.
    3. Medir la concentración desiRNA no encapsulado en el filtrado y la concentración de siRNA encapsulado en el material retenido usando un espectrofotómetro a 260 nm.

3. La inyección de ratones con LSPCs o PALETS

  1. Exponer a los ratones durante 5-10 minutos a una lámpara de calor para dilatar la vasculatura.
  2. Anestesiar ratón con un 2-3% de isofluorano / oxígeno fluya 5-10 min antes de la inyección, y durante la inyección. Confirmar la anestesia cuando los animales ya no es ambulante y respiraciones han frenado haciendo una pizca dedo del pie. Coloca el ratón sobre su parte posterior o lateral para acceder a la vena de la cola. Utilice ungüento veterinario en los ojos del ratón para evitar que se seque mientras está bajo anestesia.
  3. Limpiar / rociar la cola con 70% de EtOH y se inyecta 300 l de LSPCs o PALETS en la vena de la cola del ratón utilizando una jeringa de 26 G de insulina. Iniciar la inyección distalmente en la vena de la cola y mover proximalmente Si la vena se derrumba o se rompe.
  4. Coloque el ratón en una jaula limpia hasta que se mantiene decúbito esternal. No coloque moutilizar con otros compañeros de jaula hasta que se haya recuperado por completo. Los ratones deben recuperarse en 5 a 15 minutos. Se pueden colocar en una almohadilla eléctrica o bajo una lámpara de calor para mantener la temperatura corporal si la recuperación tarda más tiempo. Los ratones deben ser vigilados estrechamente para proteger contra el sobrecalentamiento.
  5. Monitorear los animales varias horas después de la inyección para asegurar efecto de la anestesia, y no hay efectos nocivos del tratamiento. Permitir a los LSPCs o palets a circular por lo menos durante 24 horas.

4. Análisis de la expresión de proteínas a través de Citometría de Flujo

  1. La eutanasia a los ratones con un CO 2 velocidad de flujo 20% durante 15 min.
  2. Diseccionar la mitad de un hemisferio del cerebro mediante el corte de la piel y el cráneo del ratón usando tijeras. Peel distancia media de un hemisferio cerebral lejos de la cráneo con unas pinzas o el extremo de un par de tijeras.
  3. Press medio de un hemisferio cerebral de cada ratón a través de un filtro de células de malla de 40 micras utilizando 2,5 ml de tampón FACS (1x; PBS, 1% de suero bovino fetal, 10 mM EDTA) en una placa de Petri con el émbolo de una jeringa.
  4. Enjuague el filtro de células y la placa de Petri con un adicional de 2,5 ml de tampón FACS. Poner la suspensión de células individuales en un tubo cónico de 15 ml en hielo.
  5. Pipetear 100 l de la 5 ml de suspensión de células individuales en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugar durante 5 min a 350 x g. Desechar el sedimento celular sobrenadante y resuspender en 1 ml de tampón de FACS. Girar a 350 xg durante 5 min. Repita con el otro 1 ml de tampón FACS. Mantener la suspensión de células en hielo.
  6. Se incuban las células en 100 l de dilución 1: 100 de un / ml rata bloque anti-ratón Fc 0,5 mg en tampón FACS durante 30-60 min en hielo. Pellets y lavar las células como en el paso 4.5. Mantener la suspensión de células en hielo.
  7. Se incuban las células en 100 l de un anticuerpo de 20 mg / ml fluorescente contra ratón PrP C en suero de ratón 7% en tampón FACS en hielo durante 30-60 min. Pellets y lavar las células como en el paso 4.5. Mantener la suspensión de célulassobre hielo.
  8. Pellets y resuspender las células en 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (1x PBS, 155 mM NH 4 Cl, 12 mM de NaHCO3, EDTA 0,1 mM) durante 1 min. Pellet como en el paso 4.5 y resuspender las células en 1 ml de tampón de FACS. Mantener la suspensión de células en hielo.
  9. Analizar la expresión de PrP C usando un citómetro de flujo como se ha descrito previamente 10. Puerta de las células de la población total de células en vivo. Puerta de PrP C + células de la población de células vivas para determinar MFI (intensidad de fluorescencia media).

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Resultados

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Para aumentar la eficiencia de la encapsulación dentro de siRNA PALETS aniónicos, el ARNsi se mezcló con protamina. Para determinar la mejor concentración de protamina para el siRNA, el ARNsi se mezcló con diferentes concentraciones de protamina, a partir de 1: 1 a 2: 1 (Figura 3A). Había una eficiencia de encapsulación siRNA 60-65% en liposomas aniónicos sin el uso de protamina. Las muestras con protamina: relaciones molares siRNA de 1: 1 a 1,5: 1 (133 a 266 nM) tenían ...

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Discusión

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Este informe describe un protocolo para crear dos sistemas de administración dirigida que transporta de manera eficiente ARNsi al SNC. Los métodos anteriores de la entrega de siRNA en el SNC incluyen la inyección de vectores de siRNA / shRNA directamente en el cerebro, la inyección intravenosa de siRNA dirigidos, o inyección intravenosa de complejos de liposomas-siRNA no dirigidas. La inyección de los vectores de siRNA / shRNA en el SNC no causa una disminución en los niveles de expresión de proteína objetivo. Sin embar...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Nos gustaría agradecer las siguientes fuentes de financiación: el Programa de Formación en Investigación Traslacional de Enfermedades Infecciosas de la CSU (ID:TRTP) y el programa de becas de investigación de los NIH (R01 NS075214-01A1). Nos gustaría agradecer al laboratorio Telling por el uso de su anticuerpo monoclonal PRC5. También nos gustaría agradecer al laboratorio Dow por los liposomas DOTAP y por compartir su experiencia en la generación de liposomas.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Lípidos DOTAPAvanti Lípidos890890
ColesterolLípidos Avanti700000
DSPELípidos Avanti850715
DSPE-PEGLípidos Avanti880125
CloroformoFisher ScientificAC268320010
MetanolEMD Millipore113351
N2 GasAirGas
ExtrusoraFisher ScientificS5-500
Lípidos Avanti610023
1.0, 0.4 y 0.2 μ Filtros AvantiLípidos610010, 610007, 610006
PBSLife Technologies70011-044
Sulfato de protaminaFisher ScientificICN10275205
EDCThermo Scientific22980Aliquoted para un solo uso
Sulfo-NHSThermo Scientific24510Aliquoted para un solo uso
40 μ m Filtro de célulasFisher Scientific08-771-1
Rata anti-ratón CD16/CD32 Fc blockBD Pharmigen553141
Anticuerpo anti-PrP (PRC5)Patentado - PRC

Referencias

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