El objetivo de este protocolo es utilizar liposomas catiónicos/aniónicos con un péptido neuro-dirigido como sistema de administración del SNC para permitir que el siRNA atraviese la BBB. La optimización de un sistema de administración de tratamientos, como el siRNA, permitiría más opciones de tratamiento para los priones y otras enfermedades neurodegenerativas.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Entrega de Therapeutic siRNA al SNC Usando catiónicos y aniónicos Los liposomas
En este artículo
Resumen
Resumen
Las enfermedades priónicas son el resultado del mal plegamiento de la proteína priónica celular normal (PrPC) a un isómero anormal resistente a la proteasa llamado PrPRes. La aparición de enfermedades priónicas en las poblaciones de fauna silvestre y su creciente amenaza para la salud humana ha llevado a aumentar los esfuerzos para encontrar un tratamiento para estas enfermedades. Estudios recientes han encontrado numerosos compuestos antipriónicos que pueden inhibir el isómero infeccioso PrPRes o regular a la baja la proteína priónica celular normal. Sin embargo, la mayoría de estos compuestos no atraviesan la barrera hematoencefálica para inhibir eficazmente la formación de PrPRes en el tejido cerebral, no se dirigen específicamente a la PrPC neuronal y, a menudo, son demasiado tóxicos para su uso en animales o seres humanos.
Investigamos si el siRNA administrado por vía intravascular y dirigido a la PrPC neuronal es un compuesto antipriónico más seguro y eficaz. Este informe describe un protocolo para producir dos vehículos de administración liposomal de siRNA y para empaquetar y administrar siRNA de PrP a las células neuronales. Los dos vehículos de administración liposomal son 1) la formulación de liposomas de siRNA complejados que utiliza liposomas catiónicos (LSPC) y 2) la formulación de liposomas de siRNA encapsulados que utilizan liposomas catiónicos o aniónicos (PALETS). En el caso de los LSPC, el siRNA cargado negativamente se une electrostáticamente al liposoma catiónico. Se añade al complejo un péptido cargado positivamente (RVG-9r [glicoproteína del virus de la rabia]), que se dirige específicamente a los complejos liposoma-siRNA-péptido (LSPC) a través de la barrera hematoencefálica (BBB) para las neuronas que expresan acetilcolina en el sistema nervioso central (SNC). Para los PALETS (siRNA terapéutico encapsulado con liposomas dirigidos a péptidos), los lípidos catiónicos y aniónicos fueron rehidratados por el siRNA de PrP. Este procedimiento da como resultado la encapsulación del siRNA dentro de los liposomas catiónicos o aniónicos. Una vez más, el neuropéptido RVG-9r se unió a los liposomas para dirigirse a los complejos siRNA/liposomas al SNC. Con el uso de estas formulaciones, hemos entregado con éxito siRNA de PrP a las neuronas que expresan AchR y hemos disminuido la expresión de PrPC de las neuronas en el SNC.
Introducción
Los priones son enfermedades neurodegenerativas graves que afectan el SNC. Las enfermedades priónicas son el resultado de la mal plegamiento de la proteína priónica celular normal, PrP C, por un isómero infecciosa llamada PrP Res. Estas enfermedades afectan a una amplia variedad de especies, incluyendo la encefalopatía espongiforme bovina en vacas, scrapie en ovejas, la caquexia crónica en los cérvidos, y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en humanos 1-3. Los priones causan neurodegeneración que se inicia con la pérdida sináptica, y progresa a vacuolización, gliosis, pérdida neuronal, y los depósitos de placa. Con el tiempo, dando com....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los animales fueron criados y mantenidos en el laboratorio de Recursos Animales, acreditados por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International, de acuerdo con los protocolos aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad del Estado de Colorado.
1. Preparación de LSPCs
- Use un 1: 1 de DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano): la proporción de colesterol para LSPCs. Para una preparación de liposomas nmol 4, mezclar 2 nmoles de DOTAP y 2 nmoles de colesterol en 10 ml de una solución 1: metanol en un matraz: cloroformo 1.
- Evaporar 9 ml de clo....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Para aumentar la eficiencia de la encapsulación dentro de siRNA PALETS aniónicos, el ARNsi se mezcló con protamina. Para determinar la mejor concentración de protamina para el siRNA, el ARNsi se mezcló con diferentes concentraciones de protamina, a partir de 1: 1 a 2: 1 (Figura 3A). Había una eficiencia de encapsulación siRNA 60-65% en liposomas aniónicos sin el uso de protamina. Las muestras con protamina: relaciones molares siRNA de 1: 1 a 1,5: 1 (133 a 266 nM) tenían .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este informe describe un protocolo para crear dos sistemas de administración dirigida que transporta de manera eficiente ARNsi al SNC. Los métodos anteriores de la entrega de siRNA en el SNC incluyen la inyección de vectores de siRNA / shRNA directamente en el cerebro, la inyección intravenosa de siRNA dirigidos, o inyección intravenosa de complejos de liposomas-siRNA no dirigidas. La inyección de los vectores de siRNA / shRNA en el SNC no causa una disminución en los niveles de expresión de proteína objetivo. Sin embar.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer las siguientes fuentes de financiación: el Programa de Formación en Investigación Traslacional de Enfermedades Infecciosas de la CSU (ID:TRTP) y el programa de becas de investigación de los NIH (R01 NS075214-01A1). Nos gustaría agradecer al laboratorio Telling por el uso de su anticuerpo monoclonal PRC5. También nos gustaría agradecer al laboratorio Dow por los liposomas DOTAP y por compartir su experiencia en la generación de liposomas.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Lípidos DOTAP | Avanti Lípidos | 890890 | |
| Colesterol | Lípidos Avanti | 700000 | |
| DSPE | Lípidos Avanti | 850715 | |
| DSPE-PEG | Lípidos Avanti | 880125 | |
| Cloroformo | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Metanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Extrusora | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Lípidos Avanti | 610023 | ||
| 1.0, 0.4 y 0.2 μ Filtros Avanti | Lípidos | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Sulfato de protamina | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted para un solo uso |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted para un solo uso |
| 40 μ m Filtro de células | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rata anti-ratón CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anticuerpo anti-PrP (PRC5) | Patentado - PRC |
Referencias
- Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
- McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell<....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
