Covalente La unión de anticuerpos a los discos de papel de celulosa y sus aplicaciones en-simple vista colorimétricos inmunoensayos

Resumen

En este manuscrito se presentan los métodos de oxidación periodato y reticulación de glutaraldehído para la inmovilización covalente de anticuerpos en discos de papel. Se evaluó la actividad de unión de los anticuerpos inmovilizados. Sobre la base de estos resultados, se utilizó un método de reticulación de glutaraldehído para desarrollar un nuevo inmunoensayo en papel para la detección de inmunoglobulinas G (IgG).

Resumen

Este informe presenta dos métodos para la inmovilización covalente de anticuerpos de captura en papel de filtro de celulosa de grado N ° 1 (papel de filtro de flujo medio) y discos de grado Nº 113 (papel de filtro de flujo rápido) discos. Estos discos de papel de celulosa fueron injertados con grupos funcionales de amina a través de una técnica de acoplamiento de silano antes de que los anticuerpos se inmovilizan sobre ellos. métodos de reticulación periodato de oxidación y glutaraldehído fueron utilizados para injertar anticuerpos de captura en los discos de papel de celulosa. A fin de garantizar la capacidad de unión máxima de los anticuerpos de captura a sus objetivos después de la inmovilización, se investigaron los efectos de diversas concentraciones de peryodato de sodio, glutaraldehído, y anticuerpos de captura en la superficie de los discos de papel. Los anticuerpos que se recubrieron sobre los discos de papel de celulosa funcionalizada con amina a través de un agente de entrecruzamiento con glutaraldehído mostraron una mayor actividad de unión a la diana en comparación con el método de oxidación con peryodato. IgG (en suero de referencia de ratón) se utilizó como un objetivo de referencia en este estudio para probar la aplicación de anticuerpos inmovilizados covalentemente a través de glutaraldehído. Un nuevo, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas basado en papel (ELISA) se desarrolló con éxito y validada para la detección de IgG. Este método no requiere un equipo, y puede detectar 100 ng / ml de IgG. El papel de filtro de flujo rápido era más sensible que el papel de filtro de flujo medio. El período de incubación de este ensayo fue corta y requiere volúmenes de muestra pequeños. Este simple vista, inmunoensayo colorimétrico puede extenderse para detectar otros objetivos que se identifican con ELISA convencional.

Introducción

El estudio de diagnóstico de la prueba de punto de atención (POCT) es importante para el desarrollo de nuevas estrategias para la terapéutica, la medicina personalizada y la atención domiciliaria ^1. Papeles de celulosa son ampliamente utilizados como plataformas en inmunoensayos, ya que son baratos, accesible y familiar para los usuarios ^2. Además, la estructura porosa del papel de celulosa posee la potencia para impulsar el flujo de líquido sin impacto adicional de energía. Los registros de bioanálisis en papel se pueden encontrar ya en el ^siglo 20, cuando la cromatografía en papel fue inventado por primera vez en 1952. El ejemplo má....

Protocolo

1. Injerto grupos funcionales amina sobre los discos de papel de celulosa

1. Preparar una hoja de papel cuadrada con una dimensión de 1 cm x 1 cm, y 100 discos de papel hechas de papel de celulosa de grado No. 1 con un diámetro de 6,0 mm (papel de filtro de flujo medio) usando una perforadora.
2. Para derivar grupos _-NH2 en los discos de papel, mezclar 1 ml de APS y 10 ml de acetona en una botella de vidrio de 50 ml en la campana de humos. Añadir discos de papel a la mezcla de reactivo de APS recién preparado, y se incuba durante 5 horas con agitación orbital (200 rpm) a temperatura ambiente ^32.
   Precaución: Manipular APS y ....

Resultados

Figura 3. transformada de Fourier infrarroja (FTIR) de papel de filtro de flujo medio no tratado y tratado con APS cuadrada (A) y filtro de flujo rápido del papel cuadrado (B). A. Los espectros de papel cuadrado filtro de flujo medio sin tratar fue similar a la de APS papel cuadrado filtro de flujo medio tratado. El aumento de las intensidades en bandas de 902-1,170 .......

Discusión

El recubrimiento directo de afinidad purificada de cabra anti-ratón de anticuerpo de captura IgG-Fc sobre discos de papel de celulosa no modificada se realizó para detectar concentraciones de IgG. Los resultados indicaron que, se requiere más la fijación de los anticuerpos de captura para la reproducibilidad. La técnica de silano fue utilizado con éxito para introducir grupos funcionales de amina a los discos de papel de celulosa ^34. La concentración de APS afecta a la inmovilización de anticuerpos. Por lo ta.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Papel de filtro de celulosa, grado 1 (papel de filtro de flujo medio)	GE Healthcare Pte Ltd Singapur	1001 110
Papel de filtro de celulosa, Grado 113 (Papel de filtro de flujo rápido)	Sigma-Aldrich, Singapur	1113-320
Glutaraldehído Sigma-Aldrich	, Singapur	G6257	Grado II, 25% en H2O
Surfactante	Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapur	P2287
Álbum de suero bovino	Sigma-Aldrich, Singapur	A2153
Leche desnatada	en polvo Louis Franç OIS		Empaquetado por alcaparras de cocina, Singapur
Tris base	Promega	H5135
Periodato de sodio	Merck	106597
Na2HPO4	Merck	106585
KH2PO4	Merck	104873
NaCl	CALBIOCHEM
NaOH	Merck	106462
HCl	Merck	100317
solución salina tampón de fosfato (PBS)	N/A	N/A	PBS, que contiene 137  mmol/L NaCl, 2.7  mmol/L KCl, 8.0  mmol⁠/⁠ L Na2HPO4 y 1.5  mmol/L KH2PO4, se prepara con agua y se ajusta a pH 7.4 con 0.1  mol/L de NaOH o 0,1   mol/L HCl
Acetona	Tee Hai Chem Pte Ltd Singapur	9005-68
Mezcla de TMB y solución de peróxido de hidrógeno	Solución ultra TMB-ELISA de 1 paso, Thermo Scientific Pierce	34029	1 L
Conejo anti-humano IgG-FITC	TWC/Bio Pte Ltd Singapur	sc-2278
Peroxidasa conjugada cabra anti-conejo IgG	TWC/Bio Pte Ltd Singapur	sc-2030
Afinidad purificada cabra anti-ratón anti-Ratón recubrimiento anticuerpo	Bethyl Laboratories, Inc	A90-131A
Referencia de ratón suero	Bethyl Laboratories, Inc	RS10-101-5	9,5 mg/ml
HRP conjugado de cabra anti-ratón anticuerpo de detección IgG-Fc	Bethyl Laboratories, Inc	A90-131P
Equipment
Fourier	Shimadzu IR Prestige-21	N/A
Generador de imágenes moleculares de fluorescencia	Pharos FXTM plus generador de imágenes moleculares, Bio-Rad, Singapur	N/A
Horno	NUVE FN500	N/A
Turbo mezclador VM-2000	MYC LTD	N/A
ImageJ	RGB, descarga gratuita	N/A

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