mutagénesis gen de la orientación es ahora posible en una amplia gama de organismos utilizando técnicas de edición genoma. Aquí, demostramos un protocolo para la mutagénesis dirigida de genes usando activador de la transcripción como nucleasas efectoras (Talens) en Astyanax mexicanus, una especie de peces que incluye a los peces de superficie y cavefish.
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En este artículo
Resumen
Resumen
La identificación de alelos de genes subyacentes al cambio evolutivo es esencial para entender cómo y por qué ocurre la evolución. Con este fin, gran parte del trabajo reciente se ha centrado en la identificación de genes candidatos para la evolución de rasgos en una variedad de especies. Sin embargo, hasta hace poco ha sido un reto validar funcionalmente genes candidatos interesantes. Las herramientas recientemente desarrolladas para la ingeniería genética permiten manipular genes específicos en una amplia gama de organismos. La aplicación de esta tecnología en organismos evolutivamente relevantes permitirá una visión sin precedentes del papel de los genes candidatos en la evolución. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) es una especie de pez con formas que habitan en la superficie y en cuevas. Múltiples líneas independientes de formas cavernícolas han evolucionado a partir de peces ancestrales de superficie, que son interfértiles entre sí y con los peces de superficie, lo que permite dilucidar la base genética de los rasgos de las cuevas. A. mexicanus se ha utilizado para una serie de estudios evolutivos, incluido el análisis de ligamiento para identificar genes candidatos responsables de una serie de rasgos. Por lo tanto, A. mexicanus es un sistema ideal para la aplicación de la edición del genoma para probar el papel de los genes candidatos. Aquí reportamos un método para usar nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALENs) para mutar genes en A. mexicanus de superficie. La edición del genoma utilizando TALENs en A. mexicanus se ha utilizado para generar mutaciones en genes de pigmentación. Esta técnica también se puede utilizar para evaluar el papel de los genes candidatos para una serie de otros rasgos que han evolucionado en formas de cueva de A. mexicanus.
Introducción
La comprensión de la base genética de la evolución rasgo es un objetivo de investigación crítica de los biólogos evolutivos. Se ha logrado un progreso considerable en la identificación de loci que subyacen a la evolución de los rasgos y la localización de genes candidatos dentro de estos loci (por ejemplo 1-3). Sin embargo, las pruebas funcionalmente el papel de estos genes se ha mantenido desafiante como muchos organismos utilizados para el estudio de la evolución de los rasgos no son actualmente manejable de forma genética. El advenimiento de las tecnologías de edición genoma ha aumentado considerablemente manipulabilidad genética de una amplia gama de o....
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Protocolo
Todos los procedimientos con animales estaban en conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Estatal de Iowa y la Universidad de Maryland.
1. Diseño TALEN
- De entrada deseada secuencia diana a un sitio web de diseño TALEN. (Por ejemplo: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). Entrada elegido longitudes de matriz espaciador / repetición.
- Copiar la secuencia genómica en la casilla "Secuencia".
- Dentro de la pestaña "Usuario P....
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Resultados
TALEN par inyecciones dan como resultado la unión de los RVDS a los nucleótidos de ADN específicas y por lo tanto la dimerización de los dominios de FokI, dando lugar a roturas de doble cadena 39 que pueden ser reparados a través de extremos no homólogos (NHEJ). NHEJ menudo introduce errores que resultan en inserciones o deleciones (indeles). Indeles pueden ser identificados mediante la amplificación de la región que rodea el sitio de destino TALEN y digerir el amplic.......
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Discusión
Grandes avances se han hecho en los últimos años hacia la comprensión de la base genética de la evolución de los rasgos. Aunque se han identificado los genes candidatos que subyacen a la evolución de una serie de rasgos, se ha mantenido un reto para poner a prueba estos genes in vivo debido a la falta de maleabilidad genética de las especies evolutivamente más interesantes. Aquí mostramos un método para la edición del genoma de A. mexicanus, una especie usada para estudiar la evolución de los animales .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el Departamento de Genética, Desarrollo y Biología Celular y la Universidad Estatal de Iowa y por el NIH subvención EY024941 (WJ) .dr. Jeffrey Essner proporcionó comentarios sobre el manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipo | |||
| Estación | |||
| Aparato | |||
| agujas | |||
| Nanodrop | |||
| Name | Compañía | Número de catálogo | Comments |
| >Suministros | |||
| Nota: Hasta donde sabemos, se pueden utilizar suministros de diferentes compañías a menos que se indique | |||
| Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0 | Addgene | Kit #1000000024 | |
| Fisher BioReagents LB Agar, Miller (granulado) | Fisher | BP9724-500 | |
| Fisher BioReagents Medios de microbiología: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Teknova TET-15 en 50% de EtOH | Teknova (pedido a través de Fisher) | 50-843-314 | |
| Espectinomicina Dihidroclorhidrato, Fisher BioReagents | Fisher | BP2957-1 | |
| Super Ampicillin (1,000x DNA | Technologies | 6060-1 | |
| ThermoScientific X-Gal Solution, Thermo | Sci Fermentas Inc listo para usar (pedido a través de Fisher) | FERR0941 | |
| IPTG, Fisher BioReagents | Fisher | BP1620-1 | |
| Placas de Petri | Fisher 08-757-13 | ||
| BsaI | New England Biolabs (pedido a través de Fisher) | 50-812-203 | Use BsaI, no BsaI-HF (como se describe en el protocolo Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit) |
| BSA | New England Biolabs | provisto de enzimas | |
| 10x T4 tampón de ligasa | Promega (pedido a través de Fisher) | PR-C1263 | |
| GoTaq Green Master mix | Promega (pedido a través de Fisher) | PRM7123 | Se pueden usar otros Taq, pero la reacción debe ajustarse en consecuencia |
| Kit de ligadura rápida | New England Biolabs (pedido a través de Fisher) | 50-811-728 | Utilizamos Quick Ligase para todas las reacciones de ensamblaje de TALEN |
| One Shot TOP10 E.coli químicamente competente | Invitrogen | C4040-06 | pueden utilizar otras células químicamente competentes o células competentes caseras |
| Esp 3I | Thermo Sci Fermentas Inc (pedido a través de Fisher) | FERER0451 | |
| Epicentro de DNasa dependiente de ATP seguro para plásmidos | (pedido a través de Fisher) | NC9046399 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | El kit Qiagen debe utilizarse para la preparación inicial del plásmido (como se describe en el protocolo Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit) |
| QIAquick PCR Kit de purificación | Qiagen | 28104 | |
| GeneMate LE Agaraose de disolución rápida | BioExpress | E-3119-125 | |
| Sac I | Promega (Pedido a través de Fisher) | PR-R6061 | |
| mMESSAGE mMACHINE T3 Kit de transcripción | Ambion | AM1348M | |
| Rneasy MinElute Kit de limpieza | Qiagen | 74204 | |
| NorthernMax-Gly Sample Loading Dye | Ambion (pedido a través de Fisher) | AM8551 | |
| Eliminase | Decon (pedido a través de Fisher) | 04-355-32 | |
| Fisherbrand Vidrio desechable de soda-lima Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-6B | |
| Capilares de vidrio estándar | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0010 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Puntas para Microinyector Femtojet | Eppendorf (pedido a través de Fisher) | E5242956003 | |
| Hidróxido de sodio | Fisher | S318-500 | |
| Tris base | Fisher | BP152-1 |
Referencias
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
- Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mut....
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Reimpresiones y permisos
