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Artículo de método

Nuevo enfoque para la grabación simultánea de la actividad nerviosa simpática Renal y presión arterial con la infusión intravenosa en consciente, libre de ratones.

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DOI:

10.3791/54120

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14 de febrero de 2018

 , 
1Department of Pediatrics, University of Alberta, 2Department of Physiology & Biophysics, University of Mississippi Medical Center, 3Mississippi Center for Obesity Research

En este artículo

Resumen

Ratones anestesiados exhiben la presión arterial sistémica no fisiológico, que impide una evaluación significativa del tono autonómico, dada la íntima relación entre la presión arterial y el sistema nervioso autónomo. Así, se describe un método novedoso para la actividad del nervio simpático renal al mismo tiempo récord y la presión arterial con la infusión intravenosa en ratones conscientes.

Resumen

Los nervios simpáticos renales contribuyen significativamente a los fenómenos fisiológicos y patofisiológicos. Evaluación de la actividad nerviosa simpática renal (RSNA) es de gran interés en muchas áreas de investigación tales como la enfermedad renal crónica, hipertensión, insuficiencia cardíaca, diabetes y obesidad. Evaluación inequívoca del papel del sistema nervioso simpático así es imprescindible para la correcta interpretación de resultados experimentales y la comprensión de procesos de la enfermedad. RSNA ha sido tradicionalmente medida en roedores anestesiados, incluyendo ratones. Sin embargo, ratones generalmente exhiben muy baja la presión arterial sistémica e inestabilidad hemodinámica durante varias horas durante la anestesia y la cirugía. Interpretación significativa de RSNA es confundido por esta situación no fisiológica, dada la íntima relación entre tono nervioso simpático y el estado cardiovascular. Para hacer frente a esta limitación de los enfoques tradicionales, hemos desarrollado un nuevo método para medir la RSNA en ratones conscientes, moviéndose libremente. Ratones fueron crónicamente instrumentados con radio telemetría para monitoreo continuo de presión arterial, así como un catéter de infusión venosa yugular y electrodo bipolar diseñado para la grabación directa de RSNA. Después de un período de recuperación de 48-72 horas, la tasa de supervivencia fue del 100% y todos los ratones se comportaban normalmente. En este momento, RSNA se registró con éxito en el 80% de los ratones, con las señales viables adquiridas hasta 4 y 5 días post-cirugía en 70% y el 50% de los ratones, respectivamente. Fisiológica presión arterial se registraron en todos los ratones (116±2 mmHg; n = 10). RSNA registrado aumentó con comer y aseo personal, tan bien establecido en la literatura. Además, RSNA fue validado por bloqueo ganglionar y la modulación de la presión arterial con agentes farmacológicos. En este documento, se describe un método eficaz y manejable para registro claro de RSNA en ratones conscientes, moviéndose libremente.

Introducción

Interés en el uso de ratones en varias áreas de la investigación biomédica continúan expandiéndose con el desarrollo de innumerables modelos genéticamente. En su mayor parte, avances técnicos han mantenido a la par con el aumento del uso de ratones en fisiología y ahora es una impresionante selección de dispositivos miniaturizados desarrollado específicamente para la medición de parámetros fisiológicos importantes en ratones. Aunque dispositivos telemétricos para dirigen medidas de autonómica tono nervioso en ratas conscientes han estado disponibles por más de una década, dispositivos miniaturizados para la evaluación de la actividad nerviosa en ratones conscientes no están disponibles actualmente. Los investigadores suelen eluden esta limitación mediante la evaluación de la contribución del sistema nervioso autónomo con métodos indirectos (es decir, catecolaminas en plasma u orina, farmacológica bloqueo autonómico, análisis espectral de los patrones de sangre presión/pulso)1.

Mientras que estos métodos proporcionan información valiosa, el resultado es una imagen global del tono autonómico en general, en lugar de revelar la discreta contribución de las poblaciones aisladas de los nervios para el fenómeno bajo investigación. También puede grabar directamente de la actividad de nervios específicos ha sido ejecutado en ratones anestesiados, que plantea una multitud de preocupaciones. Es sumamente difícil mantener estable la presión arterial dentro del rango fisiológico en un ratón anestesiado durante varias horas después de la cirugía. De hecho, en estos tipos de experimentos, la presión arterial es a menudo no denunciada o presentada en niveles extremadamente bajos (es decir, 60-80 mmHg vs > 100mmHg en un ratón consciente)2. La fragilidad del sistema cardiovascular en una preparación de ratón anestesiado a menudo excluye la evaluación significativa de la actividad del sistema nervioso autónomo, dada la relación codependiente entre presión arterial y el tono simpático3, 4.

Para hacer frente a esta limitación, un nuevo método para grabar directamente de la actividad nerviosa simpática renal (RSNA) en consciente, ratones desenfrenados, imperturbados dentro de sus jaulas hogar fue desarrollado. Tanto el enfoque experimental y quirúrgico para la exitosa implementación de esta técnica se describe en detalle. Esta preparación permite que el investigador registrar simultáneamente la presión arterial mediante radiotelemetría además de RSNA, con la capacidad añadida a infundir por vía intravenosa agentes de interés sin molestar el ratón.

Veinticuatro horas después de la cirugía, ratones se comportan normalmente y no presentan signos de dolor o angustia. Grabaciones experimentales pueden inicia la cirugía después de 48 a 72 horas mientras el ratón descansa cómodamente en su casa jaula con acceso ilimitado a alimentos, agua y enriquecimiento ambiental. Se presentan claras huellas RSNA y las respuestas características de esta población del nervio normales movimientos físicos del animal (por ejemplo, comer y aseo personal) se demuestran además de modulación farmacológica de la presión arterial sistémica. La calidad y la especificidad de la señal RSNA está más validado por bloqueo ganglionar. Este manuscrito incluye el complemento audiovisual a una descripción publicado al principio de esta técnica5.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales están de acuerdo con los institutos nacionales de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el cuidado institucional del Animal y uso de la Universidad de Mississippi Medical Center.

1. animales y vivienda

  1. Ratones de la casa (24-35 g) a su llegada a las instalaciones de animales de laboratorio institucional.
  2. Ofrecer ratones estándar chow roedor y agua ad libitum en todas las etapas del protocolo experimental en un ambiente controlado de temperatura y humedad.

2. modificado para requisitos particulares fabricación del electrodo Implantable RSNA

Nota: Construir el electrodo implantable de RSNA al menos unos días antes del procedimiento quirúrgico programado para curado y tiempo de esterilización (descrito a continuación).

  1. Cortar tres tiras iguales aislado inoxidable múltiple trenzado del alambre de acero, 250 mm (diámetro de alambre desnudo 0,0254 mm, 0,14 mm recubierto). Utilice una hoja de bisturí (preferiblemente #11) a aproximadamente 15 mm del material aislante para exponer el metal subyacente de un extremo de cada una de las longitudes de cable de la tira.
    1. La soldadura de un solo hombre conector (latón con la galjanoplastia de oro) para el extremo desnudo de sólo dos de los cables para crear cables de los electrodos bipolares (Figura 1A). Deje el final de la tercera longitud de alambre. Esto funcionará como el cable de tierra.
    2. Deslice un corto (~2.0 - 2,5 cm) pieza de tubería de encogimiento de calor de diámetro de 1,6 mm sobre el conector y el cable para cubrir completamente la articulación recién soldada entre el conector del cable y el pin.
      Nota: La punta del conector que va conectado en el amplificador headstage debe permanecer expuesta.
    3. Mantenga el cable por encima de una pistola de aire caliente con un par de pequeñas pinzas o pinzas hemostáticas que encoja el tubo sensible al calor y aislar eléctricamente la conexión entre el conector y el cable. Repita para el segundo cable/conector.
  2. Corte una longitud de 200 mm de tubería de polietileno (PE 90; diámetro interior 0,86 mm, diámetro externo 1,27 mm). Grupo los tres cables (dos plomos + cable de tierra) e introducir los extremos sin tocar en la tubería de PE 90, les enhebrado juntos a través de que el extremo abierto del tubo (Figura 1B).
    Nota: El PE 90 tubería funciones como una envoltura para agrupar y proteger el electrodo lleva y alambre de tierra.
    1. Identificar el cable de tierra y tire de ella a través de la vaina de PE 90 un poco más para distinguirla de los cables de los electrodos bipolares.

3. construcción de la punta del electrodo

  1. Visualizar los extremos sin tocar los cables de electrodo con un microscopio de disección. Enrosque los tres cabos sueltos del electrodo a través de un pedazo largo de 5 m m - de pequeños tubos de polietileno (PE 10, diámetro interno 0,28 mm, diámetro externo mm 0,61) que unen los cables del electrodo.
    1. Hilo una pieza de 1,5 mm de este tubo 10 PE en los cables de tres electrodos. Avanzar en esta tubería a 2,0 mm de la pieza inicial de 5 mm de 10 PE.
    2. Pase una segunda pieza de 1,5 mm de tubería de 10 PE en las puntas de los dos cables de electrodo bipolar para cubrir y aislar las puntas y separarlas del cable de tierra (Figura 1).
  2. Corte cualquier exceso de longitud de los cables con tijeras.
  3. Pegue los pedazos individuales del PE 10 tubo con los cables del electrodo con una pequeña gota de pegamento del cianocrilato de fórmula líquida. Coloque una aguja de 25 calibre blunted en el extremo del tubo de pegamento para mejorar el control y reducir derrames.
    1. Coloque la punta de la aguja en el cruce de la PE 10 y alambre, y dispense una pequeña gota de pegamento y visualizar el interior de la tubería de PE del pegamento.
    2. Deje que el pegamento se curan completamente durante la noche.

4. buena preparación de la punta del electrodo para la grabación

  1. Tira la capa aislante de las puntas del electrodo bipolar y la punta del cable de conexión con una hoja de bisturí #11. No molestar o dañar el subyacente alambres trenzados múltiples como esto afectará la calidad de la señal de la RSNA.
  2. Agarre el electrodo construido entre el 5,0 mm y 1,5 mm PE 10 anclajes con curva pinzas y doblar los alambres para formar un ángulo de 90° (Figura 1).
    Nota: Esta maniobra debe colocar los cables de electrodo bipolar sobre el cable a tierra, en una posición óptima para el paquete del nervio de la horquilla.

5. construcción del anclaje Pedestal

  1. Construir un pedestal para estabilizar el electrodo lleva a la región escapular medio del ratón sobre exteriorización cortando un trozo de 3 cm de la tubería de polietileno (diámetro interno 2,70 mm, diámetro exterior 4.00 mm).
    1. Sujete el tubo con unas pinzas y fundir un extremo sobre una pistola de calor. Presione el extremo caliente del tubo perpendicular a una superficie metálica fría para crear un borde redondeado o "brida".
    2. Enrosque este pedestal en el electrodo construido, tal que la brida esté orientada hacia la punta del electrodo.
      Nota: La combinación de la vaina de PE 90 y pedestal protege los cables de los electrodos una vez exteriorizados del animal.

6. esterilización del electrodo Implantable terminado

  1. Paquete electrodo terminado individualmente en bolsas de esterilización y ozono esterilizar (TSO3) antes de la implantación.
    Nota: Consulte con el servicio de esterilización hospital local con respecto a determinado tipo de procedimiento y bolsa de esterilización como esto difiere entre las instituciones.

7. anestesia y preparación para la cirugía

  1. Administrar analgesia 20 minutos previos al inicio de la cirugía (2 mg/kg de meloxicam, S.C.). Coloque el ratón en una cámara de inducción con oxígeno de grado médico 100%. Ajuste para aumentar el porcentaje de anestésico en incrementos de 0.5 a 4% de isoflurano vaporizador. Evaluar el plano quirúrgico mediante la evaluación de la respuesta refleja a la presión suave sobre los dedos de los pies o cojines del pie delantero y trasero de los miembros así como disminución de la frecuencia respiratoria.
    1. Traslado del animal a la mesa quirúrgica y mantener la anestesia con isoflurano de 1.5 a 2% mediante una espiga una vez que ha alcanzado el plano quirúrgico y no exhibe el reflejo del pellizco del dedo del pie. Repetir periódicamente la respuesta del pellizco del dedo del pie y evaluar la frecuencia respiratoria a lo largo de todo el procedimiento quirúrgico. Aplique ungüento oftálmico para ojos para evitar la sequedad.
    2. Mantener la temperatura normal del cuerpo de los animales en todo momento con cojines rellenos de gel de calor isotérmica y mesa quirúrgica correspondiente. Almacenar cojines isotermos en un baño de agua de 37° C y reemplazar almohadillas tan a menudo como sea necesario durante la cirugía para mantener la temperatura corporal fisiológica.
    3. Administrar el glicopirrolato (50-70 μg/kg, por vía subcutánea (S.C.)) para evitar la producción excesiva de secreciones de las vías respiratorias inmediatamente después de la inducción de la anestesia. Administrar esta dosis del glycopyrrolate una segunda vez en el punto medio de la intervención quirúrgica (paso 9.1).
    4. Llevar a cabo todos los procedimientos quirúrgicos en condiciones asépticas. Asegúrese de que todas las herramientas quirúrgicas han sido esterilizadas antes de la cirugía programada. Limpiar el campo quirúrgico como se describe a continuación (7.2.1) y mantener la esterilidad durante el procedimiento.
      1. Use una mascarilla, bata de aislamiento esterilizada y guantes estériles, de un solo uso. Limpie todos los grandes equipos como lámpara de cuello de cisne, disección alcance y mesa quirúrgica con etanol al 70%. Periódicamente durante el procedimiento, aplicar etanol al 70% a los guantes quirúrgicos para garantizar la esterilidad.
  2. Quitar el pelo del flanco izquierdo del animal, región ventral del cuello y región dorsal midscapular con cortar el pelo de animal pequeño seguido por crema depilatoria (fórmula de piel sensible).
    1. Limpiar la piel de estos dos campos quirúrgicos con 3 alternar aplicaciones de solución de limpieza quirúrgico (10% povidona yodada) y etanol al 70%. Preparar el campo quirúrgico con una aplicación final de la solución de limpieza quirúrgica.

8. cirugía implantación del electrodo RSNA

  1. Coloque el ratón sobre su lado derecho con el extremo rostral señalando a la izquierda del cirujano, exponiendo el flanco izquierdo del animal. Haga una incisión de 5 mm en la piel de la región midscapular con un bisturí (#11).
    Nota: Este es el sitio en el cual los cables de los electrodos RSNA se ser exteriorizados.
    1. Hacer una segunda incisión (< 20 mm) en la piel que cubría el flanco izquierdo, perpendicular a la espina dorsal y 2 mm de caudal a la caja torácica. Una aguja de acero inoxidable de 13G por vía subcutánea de esta incisión a la incisión en el dorsal de la salida del túnel.
      Nota: Presentar los filos de la aguja para dejar un suave borde no cortante.
    2. Pasar el electrodo implantable esterilizado de RSNA (pasos 2 - 6) a través de la aguja de 13G. Tire la aguja 13G para dejar la punta del electrodo en el músculo abdominal en el flanco izquierdo. Deja un segmento de los cables de los electrodos de mentira debajo de la piel y deja las longitudes restantes salen de la incisión dorsal.
  2. Coloque la punta del electrodo al lado. Hacer una incisión en el músculo abdominal subyacente directamente la incisión de piel en 8.1.1. Separar la grasa y tejido conectivo en el músculo de la espalda con pequeños aplicadores con punta de algodón para exponer el riñón izquierdo.
    1. Abrir el campo quirúrgico con micro-retractores y retraiga el riñón. No para estirar el paquete neurovascular renal, que irreversiblemente dañar los nervios renales e impide la grabación de una señal RSNA viable.
      Nota: Micro-retractores de acero pueden ser modelados de un clip de papel estándar y una longitud de seda 4-0. Asegúrese de que estos separadores también se esterilizan con los instrumentos quirúrgicos con el fin de preservar la técnica aséptica.
  3. Visualizar el paquete neurovascular renal con la ayuda de un microscopio de disección de alta potencia. Identificar el paquete del nervio renal, que normalmente (pero no siempre) funciona junto a la arteria renal y la vena. Diseccionar el paquete del nervio de los tejidos circundantes con pinzas finas y rectas.
    Nota: El paquete del nervio renal aparece opaco, con una "cuerda" reflexiva apariencia, única en comparación con los vasos linfáticos, que aparecen claro.
    1. Manipular el paquete del nervio lo menos posible. No toque, estiramiento o recoger el paquete del nervio en cualquier momento. No rompen los finos vasos sanguíneos que irrigan el nervio, o el conducto linfático renal porque esto compromete la viabilidad del nervio y producir linfa continuo fluido agrupación alrededor del nervio/electrodo, que obstruya o borrar completamente la señal del nervio.
    2. Dejar el paquete del nervio renal intacto, que ayudará a preservar la viabilidad a largo plazo del nervio así como mantener un contacto estable entre el nervio y el electrodo (es decir, un nervio seccionado puede deslizarse fuera de electrodos con el tiempo y los movimientos naturales del cuerpo).
  4. Introducir la punta del electrodo RSNA en el abdomen. Ajustar su posición tal que el alambre electrodo bipolar punta y de la tierra es perpendicular al paquete neurovascular renal. Además ajustar la posición del electrodo que el cable de tierra tiene buen contacto con los tejidos subyacentes y el electrodo de no comprimir los vasos renales, comprometiendo la circulación renal (Figura 1).
  5. Levantar el paquete del nervio renal con pinzas angulares. Deslice la punta del electrodo por debajo del nervio, dejando el nervio en contacto directo con ambos cables.
    1. Un pequeño trozo de la película de parafina se deslizan entre los cables del nervio/bipolar y el tercer cable (tierra) (Figura 1).
      Nota: Remojo esterilizar la película de parafina en etanol al 70% durante 24 horas y enjuague con solución salina fisiológica estéril antes de la implantación.
    2. Quitar cualquier sangre o líquido alrededor del nervio/electrodo con absorbente pequeño spears como cualquier líquido a la izquierda alrededor del nervio o cables del electrodo serán impedir o extinguir la señal del nervio.
    3. Probar rápidamente la calidad de la señal RSNA si lo desea (programa de instalación que se describe a continuación).
      Nota: Esto debe hacerse rápidamente ya que exposición al aire se seca el nervio y comprometer su viabilidad.
    4. Aplicar un elastómero de silicona de dos componentes a la unidad del nervio/electrodo, asegurándose de que las piscinas de silicona debajo y alrededor del nervio para proporcionar aislamiento eléctrico completo (es decir, no simplemente una gota en la parte superior el nervio).
      Nota: Asegúrese de que las puntas de los electrodos también están cubiertas en la silicona. El cable de tierra debe permanecer en contacto con el tejido subyacente y así elastómero no necesita piscina por debajo de este cable. Evite aplicar una cantidad innecesariamente grande de elastómero de silicona, ya que potencialmente puede impedir el flujo sanguíneo renal o desplazarse con los movimientos naturales del cuerpo con el tiempo.
    5. Permite 1-2 minutos para el elastómero de silicona curar totalmente, luego levante con cuidado los bordes exteriores de la silicona "pegote" con pinzas y aplique una pequeña cantidad de líquido adhesivo quirúrgico fórmula.
      Nota: tenga cuidado de no para aplicar una cantidad excesiva de este pegamento, ya que puede limitar la circulación o difundir al nervio y comprometer su viabilidad.
  6. Cerrar la incisión abdominal con suturas absorbibles, discontinuas (5-0). Cerca de la piel de manera similar con el mismo material de sutura.

9. implantación de la presión arterial Radiotelemeter

  1. Vuelva a colocar el ratón en su parte posterior, con el extremo rostral hacia el cirujano. Ajuste de nariz anestesia según sea necesario. Administrar la segunda dosis de glicopirrolato en este punto (véase 7.1.3).
  2. Hacer una incisión del midline en la piel de la región del cuello con un bisturí (#11), desde justo por debajo de la mandíbula inferior del animal y que se extiende justo por encima de la caja torácica. Separan el tejido glandular para exponer los músculos subyacentes del cuello. Exponer la arteria carótida común izquierda y separar los tejidos circundantes.
    Nota: Tener mucho cuidado para no dañar el nervio vago como esto puede conducir a aumento de la mortalidad post quirúrgico.
    1. Pasar tres pedazos de material de sutura de seda 6-0 por debajo de la arteria. Colocar una sutura rostral tan lejos como sea posible y atarla para ocluir el vaso. Coloque una segunda sutura a mitad de camino a lo largo de la longitud del vaso y atar flojo. Coloque la última sutura caudalmente posible y atar flojo.
    2. Retraiga la sutura más rostral y fijar a la nariz con un trozo pequeño de cinta umbilical. Retraiga la sutura más caudal con pinza micro mosquito para restringir el flujo sanguíneo en el vaso.
    3. Haga una pequeña incisión en la pared del vaso con una tijera fina primavera rostral como sea posible. Introducir el catéter de radiotelemeter de la presión arterial de ratón en la nave y el avance de la sutura caudal.
      1. Lazo de la sutura media para temporalmente estabilice el catéter, suelte la retracción caudal y avanzar el catéter 10 mm. Tie la sutura alrededor de catéter para asegurar su lugar.
    4. El cuerpo del telémetro a un bolsillo subcutáneo a lo largo del flanco derecho del túnel.

10. implantación y exteriorización del catéter venoso yugular

  1. Utilizar pequeños aplicadores con punta de algodón para exponer la vena yugular derecha. Pasar dos pedazos de material de sutura de seda 6-0 alrededor de la nave.
    1. Colocar una sutura rostral en la medida posible y lazo para ocluir el vaso. Coloque la segunda sutura lo más caudalmente posible y retraer suavemente para detener el flujo de sangre en el vaso.
    2. Utilice tijeras resorte fino para hacer una pequeña incisión en la pared del vaso como cerca de la sutura rostral como sea posible. Cateterizar la vena con tubería estirada de calor (D.E. 1,02 mm, estirada a OD 0,64 mm), que se la llena con solución salina fisiológica estéril.
      Nota: Asegúrese de que la punta del catéter se corta con un bisturí para producir un bisel redondeado para evitar la perforación de los vasos. Determinar el volumen de líquido en el catéter (espacio muerto) como referencia (ver pasos abajo de 14,4 14,6).
      1. Haga avanzar el catéter de 8 mm en la vena. Asegure el catéter atando las suturas de seda alrededor de la embarcación y catéter, así como la aplicación de una pequeña gota de pegamento de cianocrilato fórmula gel.
  2. Coloque el ratón sobre su lado izquierdo. Túnel del catéter intravenoso del cuello para salir en la región dorsal midscapular utilizando una aguja de acero inoxidable de 13G.
  3. Vuelva a colocar el ratón en su parte posterior. Cerrar la incisión en el cuello con suturas discontinuas.
  4. Coloque el animal en la posición propensa. Pase un pequeño botón subcutáneo en el catéter venoso. Fije el botón debajo de la piel con suturas. El resorte de acero inoxidable correspondiente del hilo de rosca sobre el catéter venoso y fijarlo con el botón de piel para proteger el catéter.

11. asegurar el electrodo exteriorizada conduce

  1. Asegure el pedestal de polietileno protege que el electrodo lleva al músculo subyacente con adhesivo tisular. Suturar la piel sobrepuesta sobre la brida para mayor apoyo.

12. post quirúrgico recuperación

  1. Aplique un ungüento antibiótico para todas las incisiones.
  2. Administrar medicamentos analgésicos. Administrar dosis adicionales de analgésicos según sea necesario durante el período de recuperación si el animal muestra signos de dolor o angustia.
  3. Coloque el ratón en una jaula metabólica con lecho de astillas de madera y papel toalla para recuperar. Monitorear continuamente al animal y no la deje desatendida hasta que recupera la conciencia y puede mantener recumbency esternal. Introducir el enriquecimiento ambiental, alimentos y agua (ad libitum) en este punto.
  4. Electrodo de bobina conduce fuera de la jaula hasta el tiempo del experimento.
  5. Coloque la jaula sobre una almohadilla de calor caliente durante las primeras 24 horas de recuperación. Conecte el resorte de acero inoxidable y catéter intravenoso a un sistema giratorio de la infusión para la infusión continua de solución salina fisiológica durante el período de recuperación (0.5 mL/hr).
  6. Garantizar los animales alojados individualmente en un dedicado debido a la naturaleza del catéter exteriorizado y electrodo conduce.

13. experimental configuración para registro de presión y RSNA

  1. Equiparse con una mesa antivibraciones superior acero inoxidable con una simple jaula de Faraday.
    Nota: Esta jaula de Faraday puede ser construida con una malla de pantalla de aluminio y marco de madera. Eléctricamente a tierra la jaula de Faraday/tabla para eliminar cualquier ruido eléctrico.
  2. Colocar un receptor de radiotelemetría de la presión arterial dentro de la jaula de Faraday.
  3. Conecte el receptor de radiotelemetría para el adaptador de salida de presión asociados. Conecte este adaptador a un sistema de adquisición de datos para registrar la presión arterial en línea.
  4. Dos conectores de perno femenino de la soldadura que son complementarios a los conectores de perno masculino de electrodo (latón con la galjanoplastia de oro) a los extremos de un vinculado, blindado PVC aisló el cable. La soldadura de los extremos opuestos de este cable emparejado para enchufes de plátano. Conecte los enchufes de plátano a una via headstage (amplificación de X 10).
  5. Conectar este preamplificador a un amplificador diferencial. Ajuste para amplificar la señal del nervio x10, 000. Ajustar la configuración de filtro de la siguiente manera: corte bajo, 100Hz; Corte alto, 1000 Hz.
  6. Coloque la jaula casera con el ratón sobre el receptor de radiotelemetría situado dentro de la jaula de Faraday 48 a 72 horas después de la cirugía. Activar la sonda de radiotelemetría para grabar las señales de la presión arterial.
    Nota: Aclimate el ratón colocando la jaula casera en el programa de instalación en el transcurso de 1 semana antes de la cirugía es óptimo.
  7. Desenrolle los cables de los electrodos y enchufe los conectores del electrodo bipolar correspondiente hembra conectores descritos anteriormente (13.4) para comenzar a grabar RSNA.
  8. Visualizar y grabar simultáneamente las señales de presión en línea con una computadora, mientras que la infusión de suero fisiológico o solución de interés. Grabar datos a una velocidad mínima de 2500 muestras por segundo.

14. Protocolo Experimental y validación del RSNA señal de la muestra

  1. Asegúrese de que los ratones son cómodos en su hogar jaula, libre con libre acceso al alimento y agua. Siga las pautas de cuidado institucional de los animales para verificar el comportamiento y apariencia normal.
  2. Casa de los ratones en la misma temperatura y humedad controladas sala en que RSNA grabación llevará a cabo. Asegurarse de la infusión intravenosa como se describe anteriormente.
  3. Permitir al menos 30 minutos de estabilización una vez que el animal se encuentra en la configuración del registro descrita antes de grabar una hora de la presión arterial inicial y los datos RSNA. Asegúrese de que el animal descanse tranquilamente durante la grabación ya que el movimiento natural se asocia con aumento del tono simpático. Nota Cuando el animal se mueve directamente en el rastro digital durante la grabación por lo que esto puede tenerse en cuenta durante el análisis.
  4. Prueba el baroreflejo respuesta primero lentamente inyectar un bolo de nitroprusiato de sodio (2,5 μg/g de peso corporal en un volumen de 25 μl de solución salina) en la línea de infusión. Descargue lentamente la línea con suero fisiológico de 50 μl. Asegúrese de que se elimina el espacio muerto del catéter. Registrar la presión arterial y RSNA para 2 a 5 minutos.
  5. Lentamente inyectar un bolo de fenilefrina (20 μg/g de peso en 25 μl de solución salina). Lavar con suero fisiológico de 50 μl. Asegúrese de que se elimina el espacio muerto del catéter. Registrar la presión arterial y RSNA durante 10 a 15 minutos.
  6. Verificar la naturaleza postganglionar de la señal del nervio inyectando lentamente un bolo de lo bloqueador ganglionar, hexametonio (50 μg/g de peso corporal en solución salina 25 μl) en la línea de infusión. Lavar con solución salina ~ 50 μl. Asegúrese de que se elimina el espacio muerto del catéter. Continuar grabando durante varios minutos.
  7. Use la actividad residual que queda después de la administración de hexametonio como una estimación del ruido de fondo para su uso en el análisis de la RSNA (descrito a continuación).
  8. Eutanasia el ratón con una sobredosis de isoflurano (dosis escalonada en incrementos de 0,5 hasta 5%) y continuar la grabación RSNA durante 30 minutos. Nota: La señal restante puede usarse como una estimación del ruido de fondo para el análisis de la RSNA.

15. Análisis de datos

  1. Uso software de adquisición de datos para analizar cruda presión de sangre y rastros RSNA.
    1. Integrar digitalmente y rectificación de onda completa el rastro RSNA crudo utilizando este software. Seleccione "Absoluta Integral" para la configuración integral; aplicar un decaimiento constante de tiempo de 0,1 segundos6.
    2. Analizar la señal integrada de RSNA (Visualiza en unidades de µV·s) para cada segmento del protocolo experimental. No cuenta los segmentos de la grabación cuando el animal pasó a estar en movimiento. Tomar al menos 3 mediciones de línea de base y porciones experimentales del experimento, respectivamente.
    3. Analizar la RSNA en el nivel de presión mínimo y máximo alcanzado de nitroprusiato de sodio o fenilefrina, respectivamente para evaluar la sensibilidad del barorreflejo.
    4. Promedio de las mediciones individuales tomadas por encima de cada parte del protocolo experimental para obtener un único valor.
    5. Cuantificar la respuesta RSNA calculando el cambio de porcentaje de RSNA desde el inicio, que se señala en el 100%7. Análisis estadístico completo según corresponda.
      Nota: En este ejemplo, el análisis estadístico de la respuesta de RSNA fenilefrina y nitroprusiato de sodio se completó con la prueba de t del estudiante; significado fue aceptado con valores de P < 0.05.

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Resultados

Siguiendo el protocolo descrito, tasa de supervivencia fue de 100% - todos los ratones instrumentados en este estudio sobrevivió y se recuperó bien tras la intervención quirúrgica. Dentro de las 24 horas de preparación quirúrgica, todos los ratones se comportó normalmente, exposición de comida típica, comportamientos exploratorios y peluquería. Animales no mostraron ningún signo de dolor o angustia en este momento. 48 horas después de la cirugía, una señal clara y verificable de la RSNA s...

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Discusión

Aquí hemos esbozado, demostrado y validado un nuevo método para la evaluación específica de RSNA en ratones conscientes, libres para moverse y descansar cómodamente en sus jaulas hogar. Después de la implantación quirúrgica de una radiotelemeter de la presión arterial, un catéter de infusión intravenosa permanente y un electrodo RSNA bipolar diseñado, ratones se recuperaron de la cirugía y quedaron inalterados durante 48 a 72 horas. Ratones permanecieron cómodamente asentados en su casa jaula en todo momento (incluyendo ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

S.M.H. fue apoyado por becas postdoctorales de los institutos canadienses para investigación de la salud (CIHR), corazón & Fundación tiempos de Canada (HSFC) y Alberta Innova Health Solutions (AiHS); J.E.H. es apoyado por una donación del corazón nacional, pulmón y sangre Instituto PO1HL-51971.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Alambre trenzado múltiple de acero inoxidable recubierto de teflónA-M Systems7932000.001in de diámetro desnudo; 0.0055in de diámetro recubierto
#11 Hoja de bisturíFisher ScientificALMM9011
Soldador y soldaduraCualquier marca o modelo adecuado
Conectores de clavija miniatura macho A-MSystems520200Latón con baño de oro
Conectores de clavija miniatura hembraA-M Systems520100Latón con chapado en oro
Tubo termorretráctilRadio ShackModelo #: 278-1610 |  Catálogo #: 2781610 Tubo
polietileno 90 (PE90)VWRCA-63018-7030,86 mm de diámetro interior; 1,27 mm de diámetro exterior
Microscopio de disecciónLeica MicrosystemsLeica M80Cualquier marca o modelo también adecuado
Tubo de polietileno 10 (PE10)Braintree ScientificPE10  50 PIES0,28 mm de diámetro interior; 0,61 mm de diámetro exterior
Super GlueLiquid Loctiten/aLiquid Formula; cualquier marca adecuada
Super Glue GelLoctiten/aGel Formula; cualquier marca adecuada
Tubo de polietilenoScientific CommoditiesBB31695-PE/13Para pedestal 2,7 mm de diámetro interior; 4,0 mm de diámetro exterior
Servicios de esterilización hospitalaria & Paquetes de esterilización con ozono Póngasecontacto con los servicios de esterilización del hospital local
Anestesia con isofluranoAbbott05260-05
Almohadillas térmicas isotérmicas Deltaphase y mesa quirúrgicaBraintree Scientific39OPMantenga las almohadillas térmicas calientes en un 37° C baño maría; Mesa quirúrgica correspondiente
esencial GlycopyrrolateAmdipharm Mercury Company Limitedn/a
Sistema de vaporizador de isoflurano y medidor de flujoBraintree ScientificVP IIncluye suministro de oxígeno de grado médico
Tijeras de tejido Herramientas defina14173-12
Tijeras de resorte finasHerramientas de ciencia fina15006-09
Aplicadores pequeños con punta de algodónFisher Scientific23400100
Pinzas rectas finasFine Science Tools11254-20#5, FST by Dumont Biologie
Pinzas angularesFine Science Tools11251-35#5/45 FST by Dumont
Lanzas absorbentes pequeñas FineScience Tools18105-03
ParafilmSigma AldrichBR701605  ALDRICH
Kwik-Sil 2 componentes Polímero de siliconaWorld Precision Instruments (WPI)KWIK-SILCompre puntas extra especializadas de WPI
5-0 Polysorb SutureTyco Healthcaren/a
6-0 Sutura de sedaBraintree ScientificSUT-S  104Marca Deknatel, bobina
Sonda de radiotelemetríaData Sciences International (DSI)TA11-PAC10
Receptor de radiotelemetríaData Sciences International (DSI)PhysioTel RPC-1
Referencia de presión ambiental Data SciencesInternational (DSI)Abr-01
Adaptador de salida de presiónData Sciences International (DSI)R11CPA
Rena Pulse TubingBraintree ScientificRPT-040
Infusion SwivelInstech Solomon375/D/22
Brazo de soporte giratorio & Botón de polisulfonaInstech SolomonSMCLA
 Instech SolomonLW62S/6
Muelle de acero inoxidableInstech SolomonPS62
Vetbond adhesivo quirúrgico3Mn/a
Triple Pomada AntibióticaFougeran/a
PowerLab Sistema de adquisición de datos de 8 canales & SoftwareADInstrumentsPowerLab 8/35
Cable aislado de PVC BeldenCable de conexión de audio de PVC 32 AWG
Headstage de preamplificaciónDagan Corporationmodelo 4002
Amplificador diferencialDagan CorporationEX4-400
Nitroprusside de sodioSigma Aldrich71778-25G
FenilefrinaSigma AldrichP6126-5G
Solución salina fisiológica estéril 0.9% NaClBeckton DickinsonContactar con el proveedor del hospital local
hexametonioSigma AldrichH0879-5G
Mesa antivibratoria superior de acero inoxidablen/an/aDiseñada internamente a medida; La placa de acero sólido en una mesa de trabajo también es adecuada
Jaula de Faradayn/an/aDiseñada y construida a medida en casa
Recortadora de pelo de animales pequeñosn/an/aFarmacia, recortadora de barba para hombres adecuada
Crema dipilatorian/an/aMarca Veet, fórmula para pieles sensibles
10% Povidona Yodada Productosde PurdueBetadiene
70% Etanoln/an/a
Microrretractores de aceron/an/aDe fabricación propia. Dobla un clip de acero y lazo 4-0 seda para formar un retractor
HemostáticosFine Science Tools13011-12
Pistola de calorFisher Scientific09-201-27
de de 1,6 mm de diámetro en ciencia con punta Mount

Referencias

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