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Artículo de método

Sitio Dirigida Etiquetado vuelta y EPR estudios espectroscópicos de Canales pentamérica por ligando de iones

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DOI:

10.3791/54127

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4 de julio de 2016

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University, 2School of Medicine, Case Western Reserve University

En este artículo

Resumen

Este artículo describe métodos para el etiquetado de espín dirigido al sitio y la reconstitución de canales pentaméricos activados por ligandos para estudios de Resonancia Paramagnética Electrónica. Este protocolo se puede adaptar a cualquier proteína de membrana. El método de reconstitución descrito aquí también se puede utilizar para mediciones de patch-clamp de corrientes macroscópicas y de un solo canal en un sistema lipídico definido.

Resumen

La activación de canales iónicos es una orquestación impulsada por estímulos de los movimientos de las proteínas que conduce a transiciones entre estados cerrados, abiertos y desensibilizados. Fundamental para estas transiciones es la flexibilidad intrínseca de la proteína, que está críticamente modulada por la composición de lípidos de la membrana. Para comprender mejor las bases estructurales de la función del canal, es necesario estudiar la dinámica de las proteínas en un entorno de membrana fisiológica. La espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica (EPR) es una herramienta importante para caracterizar las transiciones conformacionales entre estados funcionales. En comparación con la RMN y la cristalografía de rayos X, la información obtenida de la EPR es intrínsecamente de menor resolución. Sin embargo, a diferencia de otras técnicas, en la EPR no hay un límite superior para el peso molecular de la proteína, los requisitos de muestra son significativamente menores y, lo que es más importante, la proteína no está limitada por las fuerzas de la red cristalina. Por lo tanto, la EPR es especialmente adecuada para el estudio de grandes complejos de proteínas y proteínas en sistemas reconstituidos. En este artículo, discutiremos los protocolos generales para el etiquetado de espín dirigido al sitio y la reconstitución de membranas utilizando un canal iónico pentámero activado por ligando (pLGIC) procariota dependiente de protones de Gloeobacter violaceus (GLIC) como ejemplo. Se describirá una combinación de enfoques EPR de onda continua (CW) y pulsada (resonancia electrónica de doble electrón-DEER) en estado estacionario que permitirá una caracterización cuantitativa completa de la dinámica de canales.

Introducción

Durante la última década, la comprensión estructural de canales iónicos activados por ligando pentaméricas (pLGIC) ha crecido a pasos agigantados, debido a la multitud de estructuras de alta resolución de varios miembros de la familia. Los factores clave que llevaron a los avances actuales en el campo incluyen el descubrimiento de canales pLGIC procariotas, 1-3 grandes progresos en la expresión de proteínas de membrana eucariota, 4-6 y tremendos avances en los métodos de determinación de la estructura. 7 Estas estructuras proporcionan un consenso claro sobre la conservación general de la arquitectura tridimensional de pLGIC. Sin embargo, dos áreas principales que parecen zaga son la caracterización funcional de estas preparaciones de canal y la descripción mecanicista de la función de los canales.

Gating cambios conformacionales son complejas y se producen sobre una distancia 60 Å a lo largo de la longitud del canal y estas transiciones son ampliamente modulados porlípidos de membrana. En particular, los lípidos negativos, colesterol y fosfolípidos han sido demostrado que modulan la función de pLGIC 8-11. Mientras que el papel preciso de estos componentes de lípidos en la función del canal sigue siendo desconocida, una comprensión molecular completa de gating requeriría el estudio de estos canales en su ambiente nativo. Girar dirigida al sitio de etiquetar (SDSL) y la resonancia paramagnética de electrones (EPR) espectroscopia son las técnicas de elección para el estudio de la dinámica de proteínas en sistemas reconstituidos. espectroscopia EPR no está limitado por el tamaño molecular (como es NMR) o la propiedad óptica de la muestra (como es la espectroscopia de fluorescencia), y de ese modo permite mediciones de construcciones de longitud completa reconstituidas en condiciones de lípidos nativos. La técnica es extremadamente sensible y tiene requisitos relativamente bajos de la muestra (en el rango pico-moles). Estos dos aspectos hacen la técnica muy adecuada para el estudio de grandes proteínas de membrana que son difíciles de expresar en más de miligramocantidades.

El uso de la espectroscopia EPR en combinación con el etiquetado de giro dirigida al sitio fue desarrollado por Wayne Hubbell y sus colegas, y ha sido adaptado para el estudio de una variedad de tipos de proteínas. 12-24 de datos de EPR se han utilizado para investigar estructuras secundarias, los cambios en la proteína conformación, profundidades de inserción de membrana y proteína-proteína / interacciones proteína-ligando.

El método consiste en la sustitución de cisteína en las posiciones de interés mediante mutagénesis dirigida al sitio. Para garantizar el etiquetado específico del sitio, es necesario sustituir cisteínas nativas con otro aminoácido (por ejemplo., Serina) para crear una plantilla de cisteína menos. Por el momento, el marcador de espín más popular es un MTSL específico de tiol: (1-oxi-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirrolina-3-metil) methanethiosulfonate que se une a la proteína a través de un puente de enlace disulfuro. Debido a su alta especificidad, tamaño relativamente pequeño (un poco más grande que el triptófano), y flexibilidad de la región de engarce, este marcador de espín se ha demostrado que tienen una excelente reactividad incluso con una cisteína enterrado. Además, para maximizar la reactividad, la reacción de marcaje de la proteína se lleva a cabo en forma solubilizada con detergente. Después de la separación del exceso de giro libre etiqueta por cromatografía de exclusión molecular, la proteína es reconstituido en liposomas o sistemas bicapa lipídica imitando de composición definida. En general, la mutagénesis cisteína es bien tolerado en la mayoría de las partes de la proteína, y el tamaño relativamente pequeño de la escisión de la sonda provoca perturbación mínima a las estructuras secundaria y terciaria. Para asegurarse de que la modificación conserva funciones de tipo salvaje, los canales marcados y reconstituidos se pueden estudiar por medio de mediciones de patch-clamp.

La proteína marcada con funcional se somete a continuación a mediciones espectroscópicas, que esencialmente proporcionan tres tipos principales de información: 12,14,15,20,22,23,25-27 dinámica spin-sonda por lineshanálisis de los simios; accesibilidad de la sonda con agentes de relajación paramagnéticas; y distribución a distancia. 27 distancias EPR se miden por dos enfoques diferentes. La primera se basa en la técnica de onda continua (CW), donde ensanchamiento espectral que surge de las interacciones dipolares entre spin-etiquetas (en el 8 - Rango de distancia a 20). Se utiliza para determinar la distancia 28,29 El segundo es un pulsada-EPR método en el que las mediciones de distancia pueden extenderse hasta 70 Å. 30-34 en doble Electron Electron Resonancia (ciervo), se analizan las oscilaciones de la amplitud de espín-eco para determinar las distancias y las distribuciones de distancia. Aquí el eco de espín se modula a la frecuencia de la interacción dipolar. Juntos, estos parámetros se utilizan para determinar la topología de proteínas, elementos estructurales secundarios, y los cambios conformacionales en proteínas.

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Protocolo

1. Site-Directed Mutagenesis y Cys mutaciones

  1. La clonación y mutagénesis
    NOTA: GLIC de tipo salvaje (wt) 35 tiene una cisteína sola nativo (C27), que está mutado a serina para crear un fondo en cisteína menos. Mutaciones de cisteína se introducen en el fondo cisteína menos por mutagénesis dirigida al sitio usando cebadores que llevan un codón de cisteína en la posición deseada 36.
    1. Mezclar 5 l de tampón de reacción 10x, 1 l de 100 ng / l cisteína menos GLIC plantilla de ADN 35, 0,5 l de cada uno de 40 mM de avance y retroceso de imprimación 36, 1 l de dNTPs (100 mM), y 41 l de agua desionizada . Pipetear la muestra un par de veces para mezclar a fondo, centrifugado (6000 rpm) y, finalmente, añadir 1 l de ADN polimerasa.
    2. Ajuste el termociclador con el siguiente protocolo:
      1. Desnaturalización a 95 ° C durante 4 minutos.
      2. Desnaturalización a 95 ºC durante 30 s.
      3. Recocering a 55 ºC durante 1 min.
      4. Alargamiento a 68 ºC durante 10 minutos (aproximadamente 1 min por kb de longitud plásmido).
      5. Repita los pasos 1.1.2.2 - 1.1.2.4 durante 18 ciclos.
      6. Una última elongación a 68 ºC durante 10 min.
      7. Mantenimiento de la temperatura a 4 ºC
        NOTA: La temperatura de hibridación se calcula sobre la base de la cartilla Tm.
    3. Añadir 1 l de DpnI a la mezcla de reacción, se mezcla a fondo por pipeteo, y girar hacia abajo (6.000 rpm) durante 1 min. Incubar durante 2 horas a 37 ° C.
  2. Transformación
    1. Descongelar E. Las células competentes de E. coli en hielo. Alícuota de 30 l de células en un tubo de transformación estéril 14 ml y se añade 1 l de ADN digerido a las células. Mezclar con un toque en el lado del tubo. Incubar durante 20 minutos en hielo.
    2. Se coloca el tubo en un baño de agua 42 ° C durante 45 segundos y luego vuelva a colocarlo en hielo durante 2 min. Añadir 400 l de medios SOC estéril y agitar las células en una incuBator a 37 ºC durante 1 hora.
    3. Plate 100 l de células en placas de LB que contenían kanamicina (50 mM) y 1% de glucosa. Se incuban las placas O / N a 37 ºC.
    4. Cosechar una sola colonia de la placa e inocular en 5 ml de O / N culturas que contienen medio LB / kanamicina. Incubar el cultivo O / N (~ 16 horas) a 37 ºC en un agitador incubador.
    5. Extraer el ADN de la cultura / N O por minipreparación 37. Cuantificar el rendimiento de ADN usando un espectrofotómetro mediante la medición de la absorbancia a 260 nm de longitud de onda. La concentración debe ser ~ 100 - 200 ng / l. Confirmar la presencia de la mutación mediante estrategias de secuenciación de ADN recombinante estándar 38,39.

2. Expresión y purificación GLIC

  1. Transformación
    1. Siguiendo los pasos descritos en la sección 1.2, 30 l de transformar células competentes C43 con 1 l (~ 100 - 200 ng / l) del plásmido que contiene el gen que codifica la GLIC junto con una proteasa -3C sitio de escisión de rinovirus humano (HRV) (Para la secuencia del plásmido y el gen, se refiere al texto suplementario) 35 (de la etapa 1.2.5).
    2. Plate 100 l de células en placas de LB-agar que contenían 1% de glucosa y 50 g / ml de kanamicina, y incubarlos O / N (~ 16 h) a 37 ºC en una incubadora.
    3. Comprobar visualmente en busca de colonias y asegurarse de que no se cultivan sobre-o muestran la presencia de colonias satélites. sellar rápidamente las placas con parafilm y almacenar a 4 ºC.
  2. Configuración de O / N-culturas y Preparación de medios de cultivo
    1. Elija una sola colonia aislada mediante la inoculación de asa de alambre y transferir a un matraz de 100 ml estéril que contiene 20 ml de caldo Luria (LB) suplementado con glucosa estéril al 1% y 50 mg / ml de kanamicina. Incubar ellos O / N (~ 16 h) a 37 ºC en un agitador a 250 rpm.
    2. 900 ml de caldo Terrific (TB) medios de autoclave (Ver Medios de Comunicación y Memoria Intermedia de Composición) en 2,8frascos de vidrio L Fernbach para el cultivo bacteriano en el ciclo de vapor de agua a 121 ºC durante 20 min.
  3. La creación de grandes cultivos de crecimiento
    1. Añadir 100 ml de tampón de fosfato de potasio estéril (Ver Medios y Composición Buffer) a los medios de TB en autoclave. Añadir glucosa estéril (0,2% de concentración final), kanamicina (50 mg / ml) y 10 ml de la cultura O / N. Incubar a 37 ºC en un agitador a 250 rpm.
    2. Comprobar la densidad óptica a 600 nm de longitud de onda (DO 600) usando un densitómetro o un espectrofotómetro cada hora hasta que alcanza 0,5 (~ 2 h). En este punto reducir la velocidad a 150 rpm y bajar la temperatura a 18 ºC. Supervisar el OD 600 cada 30 minutos hasta que alcanza 0,8 (~ 1 h).
    3. Añadir 50 ml de glicerol y continuar agitando el cultivo hasta que la DO 600 alcanza 1,0-1,2 (~ 15 - 30 min).
      NOTA: En estas condiciones, se tarda alrededor de una hora para el cultivo hasta alcanzar los 18 ºC de temperatura de 37 ºC. Es importante que el glicerol se añade al cultivo después de que se haya enfriado a 18 ºC.
    4. Inducir a las células con 200 mM IPTG (isopropil-tio-β-galactosidasa) y restablezca el agitador de nuevo a 250 rpm y se incuba adicionalmente durante ~ 16 horas a 18 ºC.
  4. Protein Purification
    1. Asegúrese de que el OD 600 al final de 16 horas es de ~ 16 - 18. Cosecha de las células en botellas de centrífuga de 1,0 L por centrifugación a 8.500 x g, 4,0 ºC durante 15 minutos. Decantar el sobrenadante y pesar la botella con el sedimento celular. Calcular el peso de la pastilla restando el peso de la botella de vacío del peso total.
      NOTA: El peso sedimento celular esperado es de ~ 30 - 35 g / L. Aunque, es de señalar que puede haber variabilidad en la final OD 600 y sedimento de células de peso a través de mutantes.
    2. Vuelva a suspender el sedimento bacteriano en 150 ml de helado de tampón A (NaCl 100 mM, Tris 20 mM, pH 7,4) por 1,0 l de cultivo. Añadir DNasa I (100 mg / ml) y proteasinhibidores de e (fluoruro de fenilmetil sulfonilo (1 mM), leupeptina (2,0 mg / ml), aprotinina (2,0 mg / ml), y pepstatina A (1 mg / ml)).
    3. Homogeneizar las células haciéndolas pasar a través de un disruptor de células en una habitación fría 4,0 ºC. Repetir el proceso tres veces para que la mayor parte de las bacterias se lisa. Centrifugar las células a 14.000 xg durante 15 min y la pipeta el sobrenadante y transferir a un tubo de centrífuga limpio. Se desecha el precipitado, que contiene células lisadas por la ONU y los cuerpos de inclusión.
    4. Centrifugar el sobrenadante a 168.000 xg durante 1 hr. Cuidadosamente se decanta el sobrenadante sin perturbar el sedimento de membrana.
    5. En común el sedimento de membrana a partir de 1 l de cultivo y volver a suspender en tampón A (suplementado con 10% de glicerol) a un volumen final de 50 ml. Añadir 0,5 g de n-Docecyl-β-D-maltopiranósido (DDM) a la suspensión de membrana y inclinar la cabeza durante 2 horas a 4,0 ºC.
    6. Después de la solubilización de la membrana, eliminar los restos celulares del lisado por centrifugación a 168.000 xg durante 1 hora. Mientras tanto preparar resina de amilosa. Añadir 3 ml de resina utilizando una pipeta en una columna de cromatografía de polipropileno vacía. Lavar la resina haciendo pasar 10 volúmenes de lecho de agua 3 veces y después con 10 volúmenes de lecho de tampón A que contiene DDM 0,5 mM.
    7. Después de la centrifugación, tome suavemente el sobrenadante usando una pipeta y transferir a un tubo cónico de 50 ml limpio. Para lotes de unión, añadir resina de amilosa preequilibrada al tubo cónico. Obligar a la proteína extraída de resina de amilosa por nutación la mezcla durante 2 horas a 4.0 ºC.
    8. Pasar toda la suspensión a través de una columna de cromatografía y se recoge el flujo a través. A continuación, pasar todo el flujo a través recogido sobre la resina por segunda vez para maximizar la unión.
    9. Pasar 10 volúmenes de lecho de tampón A con DDM 0,5 mM, Tris 0,5 mM (2-carboxietil) fosfina (TCEP) y 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para eliminar las proteínas no unidas.
    10. Eluir la proteína GLIC con 10 ml de Buffer A que contiene maltosa 40 mM, además de DDM mM TCEP 0,5 y 0,05 mM. TCEP evita la oxidación de la cisteína cadenas laterales. Recoger todo el eluato.
    11. Se concentra la proteína eluida usando concentrador centrífugo (peso molecular de corte = 50 KDa) a 4 - 6 mg / ml y añadir proteasa HRV-3C (200 g por 10 mg de proteína) y se incuba O / N a 4,0 ºC.
      NOTA: determinar la finalización de la digestión de la proteasa mediante la ejecución de las muestras en gel SDS PAGE (véase el paso 2.5.5 y Figura 1).
  5. Site-Directed Spin-etiquetado
    1. Hacer unos 100 l de 200 mM de de (1-oxi-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirrolina-3-metil) MTSL 40 en DMSO y almacenar las acciones a -20 ° C en alícuotas de 25 l.
    2. Utilice la muestra digerida por proteasa para el spin-etiquetado con MTSL. Añadir exceso de 10 veces molar de MTSL spin-etiqueta (monómero GLIC: MTSL en proporción molar 1:10). Incubar en hielo durante 1 hr. Añadir un segundo disparo del marcador de espín en un exceso molar de 5 vecesrelación e incubar durante otra hora.
      NOTA: Para las posiciones enterradas (con baja eficacia de marcado giro, se describen a continuación), se añade un exceso molar de 30 veces de marcador de espín y se incuba la proteína durante 6 horas.
    3. Pasar la muestra a través de una columna de exclusión por tamaño Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) que es pre-equilibrada con tampón A y DDM 0,5 mM para separar la MBP escindida y el exceso de giro libre de la etiqueta de pentámeros Glic. Recoger fracciones de 1 ml para un total de 30 ml de elución. Reunir las fracciones que contienen pentámeros Glic (Figura 1). Siga las instrucciones del fabricante para ejecutar la FPLC.
    4. Determinar la concentración de la muestra usando un espectrofotómetro mediante la medición de la absorbancia a 280 nm de longitud de onda. Coeficiente de extinción molar y el peso molecular estimado de monómero GLIC son 49.850 M -1 cm -1 y 36.380 Da, respectivamente. Se concentra la solución de proteína usando un concentrador centrífugo (MolecularUmbral de peso = 50 kDa) a una concentración final de ~ 8-10 mg / ml y colocarlo en hielo. La muestra está ahora lista para la reconstitución.
    5. Como un control de calidad adicional para asegurar que la preparación es bioquímicamente homogénea, ejecute un (β-ME 1,0%) en gel de SDS-PAGE reductor.
      NOTA: El gel Coomassie manchado debe mostrar una sola banda a ~ 33 kDa correspondiente al monómero GLIC (Figura 1).
    6. Para los mutantes de giro marcado con sospechosos de exhibir ensanchamiento dipolar, bajo-etiquetar las muestras en presencia de etiqueta diamagnético 41. Incubar la proteína se eluyó con MTSL 0,1 veces e incubar en hielo durante 1,0 hr. Después, añadir un exceso molar de 20 veces de etiqueta diamagnético (1-acetoxi-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirrolina-3-metil) metano tiosulfonato.
      NOTA: El reactivo diamagnético se utiliza aquí es iso-estérico al marcador paramagnético con una química idéntica etiquetado.
    7. Incubar la muestra en hielo durante 2 hr. Pasar la muestra a través de un sizcolumna de cromatografía de exclusión e que es pre-equilibrada con tampón A y DDM 0,5 mM como en el paso 2.5.3.
  6. Eficiencia de etiquetado giro
    1. eficiencia Spin-etiquetado se define como la relación de la concentración spin-etiqueta a la concentración de la cadena lateral de cisteína (GLIC-monómero). Para determinar la eficiencia de spin-etiquetado de la muestra, la intensidad integrada de la muestra se compara con un estándar de concentración conocida mediante un gráfico de calibración. Hacer que las soluciones de un estándar de EPR (tal como 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxilo: TEMPO) en un intervalo de concentraciones (10 a 250 m) por disolución en agua.
    2. Medir la señal de EPR para cada una de estas soluciones y determinar el área bajo la curva (doble integración de la señal de EPR) para cada concentración (como se describe en los pasos 6.1). Generar una curva de calibración poniendo en el área medida como una función de la concentración de TEMPO y encajando con una línea recta.
      NOTA: El sonun bajo una señal de EPR derivado es una mejor descripción de la intensidad espectral de la amplitud de pico a pico. La integración de la primera derivada de la señal de EPR dará el espectro de absorción, una segunda integración dará entonces el área bajo el espectro de absorción (que es proporcional a la concentración de giro). Garantizar una línea de base constante, tanto en el campo bajo y la región de campo alto del espectro.
    3. Medir la concentración de la proteína spin-marcado en el detergente usando un espectrofotómetro (como en la etapa 2.5.4). Ahora medir la señal de EPR de la muestra y luego determinar el área de la integral doble de la señal de EPR siguientes pasos en la sección 6.1. Mediante el uso de la curva de calibración, determinar la concentración de la etiqueta que corresponde a la señal de EPR medido. Calcular la eficacia de marcado de giro como la relación molar de marcador de espín y la concentración de proteínas.

3. La reconstitución GLIC en asolectina Membranas

  1. Preparación de liposomas
    1. Enjuague un 25 ml matraz de fondo redondo limpio con 5 ml de cloroformo y se seca el matraz en una corriente de N 2 de gas en la campana de humos. Transferencia de 10 mg de asolectina (soja polar extracto de 25 mg / ml de stock en cloroformo) en el matraz y se secan los lípidos bajo una corriente continua de N 2 gas.
      NOTA: La selección de lípidos para la reconstitución se basa en los resultados de los experimentos en la sección 4.
    2. Cuando el cloroformo se ha evaporado, se coloca el matraz en un vacío durante 1 hora para asegurar un secado completo. Añadir 1 ml de tampón de reconstitución A al lípido seco y agitar vigorosamente el matraz para obtener el pellet de lípidos en suspensión.
    3. Para preparar vesículas unilamelares pequeñas, sonicar la suspensión de lípidos en un sonicador de baño de agua fría hasta que la solución de la vesícula se vuelve más o menos translúcida y no se observan grumos (aproximadamente 10 - 15 min). A esta mezcla, agregar DDM a una concentración final de 4 mM y se incuba a TA durante 30 min.
  2. Reconstitución
    1. Añadir la proteína purificada de la etapa 2.5.4 a la mezcla de lípidos.
      NOTA: La proporción de proteína a lípido depende del tipo de experimento. Para medidas de corriente macroscópicas, un 1: 10.000 se utiliza la relación. Para los estudios de EPR, la reconstitución se realiza a una proteína superior a la proporción de lípidos (1: 2500) para maximizar la señal. Se muestra previamente que a estas concentraciones, no la agregación lateral se observa 42.
      NOTA: cantidad de trabajo típico de GLIC para EPR es ~ 1 mg, aunque se basan en la posición sondeado, cantidades inferiores pueden funcionar tan bien.
    2. Incubar la muestra a 4 ºC durante 1 hora con rotación suave luego se diluye la muestra a 15 ml con tampón A.
      NOTA: En este paso la concentración de detergente por debajo de la concentración micelar crítica (CMC).
    3. Eliminar el detergente residual en la suspensión mediante la adición de perlas de poliestireno (con poros hidrófobos que atrapan detergentes). Añadir 80 mg de las perlas limpio e incubar los liposome suspensión O / N en un nutator a 4 ºC.
      1. Para preparar las perlas para uso, pesar ~ 100 mg y transferirlos a un tubo cónico de 50 ml. Añadir 10 ml de metanol, agitar vigorosamente, centrifugar las perlas a 8.000 xg durante 2 minutos y decantar el metanol. Repita este proceso de metanol lavar tres veces. Repetir el mismo proceso con 30 ml de agua desionizada, se lavan tres veces.
    4. El día siguiente, transferir el liposoma a un tubo de ultracentrífuga de 25 ml utilizando un filtro de columna para eliminar las perlas y diluir aún más la muestra a 25 ml. Centrifugar las muestras a 168.000 xg durante 2 horas. Se decanta el sobrenadante y resuspender el sedimento usando 100 l de tampón B.

4. Determinar óptima de lípidos Composición para la reconstitución por FRET

  1. Utilice una transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) de ensayo basado para determinar la composición de la membrana que mantiene la proteína monodispersa.
  2. purificar en peso GLIC (con la cisteína nativa, C27) siguiendo los pasos descritos en la sección 2. Etiqueta de la proteína en un 10: 1 (etiqueta / monómero) relación molar, ya sea con fluoresceína-maleimida o maleimida tetrametilrodamina usando los pasos en la sección 2.5.
  3. Después de pasos de la sección 3.2 para la reconstitución, preparar tres muestras diferentes para cada composición de lípidos a ensayar; En primer lugar, marcado con fluoresceína GLIC en una relación molar de 1:. 1500 (pentámero: lípido) En segundo lugar, marcado con rodamina GLIC en una relación molar de 1: 1.500 (pentámero: lípidos). En tercer lugar, la mezcla detergente de fluoresceína y rodamina solubilizado etiquetados GLIC (relación 1: 1 molar). Reconstituir esta mezcla de 1: 750 (pentámero: lípido) relación.
    NOTA: Se utilizaron tres sistemas lipídicos: asolectina, POPC: POPG (proporción 3: 1 molar), y E. extracto polar coli. La relación de la reconstitución de proteínas a los lípidos en el experimento de FRET es más alta que la utilizada para las mediciones de EPR (1: 750 en comparación con 1: 1500 utilizado para los estudios de EPR).
  4. Diluidola suspensión de liposomas (para reducir la señal de dispersión de la luz; ~ 5 l en 995 l de tampón A), entonces la pipeta la muestra en una cubeta de cuarzo y colocarlo en un fluorímetro.
  5. Establecer la longitud de onda de excitación a 490 (que corresponde a los máximos de absorción para el donante: fluoresceína). Uso de las instrucciones del fabricante, registrar los espectros de emisión de 500 nm a 660 nm.
    NOTA: Para la muestra GLIC marcado con fluoresceína, verá un pico a 518 nm (correspondiente a la emisión de fluoresceína) con ningún pico a 572 nm (correspondiente a la emisión de rodamina). Para la muestra GLIC marcada con rodamina, no verá un pico a 518 nm pero en lugar de a 572 nm que surge de la excitación directa de rodamina a 490 nm. Para la muestra que contiene tanto las etiquetas de fluoresceína y rodamina, una disminución de la intensidad de pico de fluoresceína y un aumento correspondiente en el pico rodamina es una señal de FRET que es probable un indicador de la agregación lateral de la proteína en la membrana.
  6. Supervisar ella amplitud de la emisión de rodamina a 572 nm en varios intervalos de tiempo (desde 0 - 24 h) de grabación en cada hora durante las primeras 6 horas y después de O / N de incubación (Figura 2). Para cada intervalo, medir la intensidad de fluorescencia a 572 nm (para la rodamina: Ia) y en 518 nm (para la fluoresceína: Id). Restar la contribución de la activación directa de rodamina (muestra 2 en el paso 4.3) de Ia (IAC). Determinar la relación de FRET como Iac / (Iac + Ib). Comparación de FRET a diferentes intervalos de tiempo ya través de diferentes composiciones lipídicas.
    NOTA: Como control, realizar el paso 4,5 y 4,6 para las muestras de detergentes solubilizado y comparar los espectros de emisión a los de liposomas reconstituidos. Usar una mezcla equimolar de proteína marcada en detergente (descrito en el paso 4.3) y diluir en tampón A suplementado con 0,5 mM DDM. Se espera que las muestras de detergentes mostrar señal de FRET mínima.

5. Mediciones funcionales de patch-clamp grabaciones

  1. preparar proteoliposomes para las mediciones de patch-clamp en exactamente la misma forma que para los estudios de EPR (Sección 3.1).
    NOTA: Sin embargo, ajustar la proteína: lípido relación basada en el tipo de medición se realizará (monocanal vs grabaciones macroscópicos). Flash-congelar los proteoliposomas en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C hasta su uso. Típicamente, reconstituir GLIC en 1: 10.000 de proteína: lípido (relación molar) para las corrientes macroscópicas y relación molar 1: 50.000 para las grabaciones de un solo canal.
  2. liposomas descongelación en hielo. Enjuague un portaobjetos de vidrio limpio con agua y etanol y se seque por completo. Coloque una gota 10 l de la proteoliposoma en el centro de la diapositiva y O seco / N en un desecador a 4 o C bajo vacío.
  3. Re-hidrato de los proteoliposomas secas mediante la adición de 20 l de tampón B (NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,0) y colocar el portaobjetos en un petriplate en la parte superior de un papel de filtro húmedo. Cubrir la placa y permite la rehidratación de proceder durante aproximadamente 2 horas.
    NOTA: Este proceso de Yields gigantes liposomas multilamelares que son propicias para parchear partir.
  4. Tire de pipetas de parche de los capilares de paredes delgadas de vidrio de borosilicato (~ 1 - 2 m de diámetro) usando la punta del fabricante de ajuste recomendado en el extractor de pipeta. El calor de uñas utilizando un fuego de forjar a una resistencia de 1,5 - 2MΩ cuando se llena con tampón B.
  5. Llenar la cámara de registro con Tampón B con una pipeta y adjuntar el electrodo de tierra Ag / AgCl. Utilizando una punta de pipeta de 2 l, agitando suavemente los liposomas a partir del borde y la transferencia de 1 l de la suspensión en la cámara de registro. Espere unos minutos para que los liposomas se depositen en el fondo.
  6. Llenar el parche pipeta con Tampón B usando una aguja de jeringa no metálico y montarlo en la cabeza-etapa de amplificación. Identificar un vesículas aisladas sola parchear. Aplique una ligera presión positiva para evitar que el parche pipeta se obstruya, e inserte la punta en la cámara de grabación.
  7. Aplicar los impulsos de ensayo para medir la pipeta soldna vez y compensar la tensión de la pipeta de desplazamiento. Acercarse a la vesícula, y cuando se hace el contacto, aplicar una ligera presión negativa para tirar suavemente la vesícula contra la pipeta parche para formar un sello gigaohmio.
  8. Monitor de la resistencia de la pipeta durante todo el proceso. Una vez que se forma el sello gigaohmio, retirar la pipeta cuidadosamente lejos del liposoma para formar un parche de dentro a fuera. Apague el impulso de prueba.
  9. Establecer el potencial de mantenimiento de -100 mV, y aplicar un pulso de pH. se obtuvo pH bajo utilizando 10 mM de citrato de sodio tampón C (NaCl 150 mM, citrato 10 mM, pH 3,0). (Figura 3)
    NOTA: Las grabaciones se realizan con una frecuencia de muestreo de 10 kHz para macroscópica y 40 kHz para las mediciones de un solo canal.

6. Las mediciones de EPR

  1. Continuo-Wave EPR Espectroscopia
    1. Transferir la suspensión de liposomas a partir del paso 3.2 en un tubo de 200 l y sedimentar las muestras usando una centrífuga. Desechar el supernatant y muestra está lista para las mediciones de EPR.
      NOTA: Para las mediciones de EPR, es importante para eliminar la mayor cantidad de tampón de la muestra de liposomas como sea posible. Dado que las muestras acuosas absorben la parte eléctrica del horno de microondas que resulta en la calefacción y la pérdida de sensibilidad.
    2. Para llevar a cabo el intercambio de tampón, la transferencia de 20 l de sedimento de liposomas utilizando una pipeta a un tubo de microcentrífuga. Añadir 180 l de tampón D (NaCl 100 mM, citrato 10 mM, pH 3,0) y se incuba a 42 ºC baño de agua durante 5 min. Se centrifuga la muestra, separar el sobrenadante con una pipeta y repetir el proceso tres veces para asegurar el intercambio de tampón completa.
      NOTA: Como alternativa, intercambio de tampón puede hacerse sometiendo las muestras a múltiples ciclos de congelación / descongelación.
    3. Gas capilares de plástico permeables son apropiados para mediciones tanto de la línea espectral-formas y accesibilidad de disolvente. Toque en el capilar en el proteoliposoma peletizado para extraer la muestra dentro y sellar el extremo con cera de hueso.
      NOE: Típico volúmenes de muestra son ~ 5 l y una concentración de giro deseable es 150 mM. Si el objetivo es medir formas de línea por sí sola, se puede utilizar tubos capilares de cuarzo OD 0,4 mm. Si es necesario, una pipeta se podría utilizar para el llenado de la muestra en el interior del capilar.
    4. Operar el espectrómetro
      1. Realizar mediciones de CW-EPR a temperatura ambiente (292 - 297 K) en un espectrómetro de banda X equipado con un resonador dieléctrico de acuerdo con el manual de instrucciones de los fabricantes.
      2. Encienda el enfriador de agua, fuente de alimentación, y la consola puente de microondas. Permitir que el sistema se equilibre térmicamente durante aproximadamente 30 minutos antes de la grabación. Abra el software de adquisición.
      3. Insertar la muestra de tubo / capilar en el resonador, asegúrese de que la sección del tubo de llenado de la muestra está en el centro de la cavidad del resonador. Sintonizar el resonador de acuerdo con las instrucciones en el manual del espectrómetro.
      4. Registre el primer espectro de absorción derivado de barrido de campo enuna potencia incidente de microondas de 1,0 mW, una frecuencia de modulación de 100 kHz y una anchura de barrido de 100 G. determinar la potencia óptima para el experimento mediante la realización de un experimento de saturación de potencia progresiva, donde la altura de pico a pico de la primera CW derivado señal de EPR se mide como una función de la raíz cuadrada de la potencia de microondas incidente.
        NOTA: En poderes de microondas más bajas, la intensidad de la señal aumenta en proporción a la raíz cuadrada de la potencia siempre la población de equilibrio de los estados de espín se ve afectada. Sin embargo, si se aumenta aún más el poder, la relajación spin-red ya no puede mantener la diferencia de población de equilibrio de los dos estados de espín y la amplitud de la señal comienza a meseta o "saturar". Más allá de este punto, la amplitud de la señal en realidad puede disminuir con el aumento observar potencia debido a la inversión de población de sates de espín. Además, para los espectros ensanchada con las alas extensas donde una línea de base plana bien definida no es viposible, ampliar el ancho de barrido a 150 - 200 G para evitar la pérdida zona.
      5. Comience con el uso de una modulación de amplitud de 1,0 G.
        NOTA: Este valor es dependiente de la muestra y se ajustó a disminuir el ruido de baja frecuencia en la señal. Si se utiliza un valor demasiado grande, puede distorsionar o ampliar la señal.
      6. Ajuste el tiempo de constante de tiempo y la conversión a 20,48 ms, tiempo de barrido a 20.97 seg, y la resolución de 1024 puntos.
        NOTA: La constante de tiempo se basa también en la muestra y se ajusta para filtrar el ruido de alta frecuencia.
      7. Después de la primera exploración, establezca el campo central en el centro de la señal de EPR y selecciona anchura de barrido de tal manera que la traza incluye la señal de línea de base y suficiente a cada lado.
        NOTA: También, para mejorar la relación señal / ruido, aumentar el número de exploraciones en base a la fuerza de la señal de EPR. Incluir anchura de barrido y el número de puntos
      8. Medir la accesibilidad de la etiqueta de selección para agentes de colisión relajante O2 o ácido etilendiamindiacético (Niedda) protocolos de saturación utilizando energía 27 descrito en el paso 6.1.4.4.
        NOTA: Preparar Niedda como se ha descrito previamente 26.
      9. En primer lugar perfundir la muestra en la cavidad con N2 durante 5 min (para eliminar O 2). Medir los espectros para cada potencia de microondas entre 5 - 35 dB en pasos de 3 dB con una anchura de barrido de 30 G.
      10. Entonces perfundir la muestra en la cavidad con aire durante 10 minutos y medir los espectros en diferentes potencias de microondas (5 - 35 dB en pasos de 3 dB) como en la etapa 6.1.4.9.
      11. Incubar 20 l de sedimento de liposomas con 180 l de Niedda 50 mM (en tampón B o tampón D) en un 42 ºC cubeta de agua durante 5 minutos. Centrifugar la muestra y eliminar el sobrenadante utilizando una pipeta. Cargar la muestra en el capilar y colocarlo en la cavidad del resonador. Repita el paso 6.1.4.9.
        NOTA: El principio detrás del experimento es que la interacción con relaxina paramagnéticog agentes a través de intercambio de espín Heisenberg impedirían la saturación de la inversión de la señal y de la población. Niedda soluble en agua y soluble en lípidos O molecular 2 se utilizan como reporteros para el agua (tanto a granel como vestíbulos intraprotein) y la membrana posiciones en la proteína expuestos, respectivamente.
  2. Análisis de los datos:
    NOTA: El análisis de los datos EPR implica los siguientes pasos: 14,22,23,25-27
    1. Calcular la movilidad de la sonda de giro (? H o -1), como la inversa de la anchura de la línea central de la primera espectro de absorción de derivados. ? H o -1 es un reflejo de la libertad motional o la dinámica de la sonda.
    2. Calcular el parámetro de la accesibilidad (П), que es una estimación de la accesibilidad de la sonda a otros agentes relajantes de colisión paramagnéticas, utilizando los pasos descritos a continuación.
      NOTA: Interacción de la escisión de la sonda con agentes paramagnéticos relajantemejora la velocidad de relajación spin-red (T 1) del nitróxido por intercambio de espín Heisenberg. 27
      1. Estimar el parámetro de accesibilidad (П) a partir de los experimentos de saturación de potencia (6.1.4.8) en el que la vertical, amplitud pico a pico de la línea central del primer espectro EPR ​​derivado se mide a diferentes potencia de microondas. 25 Trace la amplitud de la señal como una función de la raíz cuadrada de la potencia de microondas y en forma con la siguiente ecuación 27.
        figure-protocol-1
        NOTA: Donde A es la amplitud de la señal, es una medida de la homogeneidad de la saturación de la línea de resonancia (que es por lo general entre 0,5 y 1,5), I es un factor de escala, P es la potencia incidente, y la representa la valor en el que la primera derivada es la amplitud de la mitad de su valor no saturado.
  3. Calcular? P medio como la diferencia en P 1/2 valores en la presencia (O 2 o Niedda) y ausencia (perfundidos con N 2) de los agentes paramagnéticos relajante. Calcular el parámetro de la accesibilidad (П) usando la ecuación:
    figure-protocol-2
    NOTA: En caso de referencia P 1/2 y? H o Referencia son el valor de saturación de potencia máxima y la mitad del ancho de la línea central, respectivamente, para el estándar de referencia (como DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil)) 27.

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Resultados

Caracterización bioquímica de los mutantes Glic spin-etiquetados

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente típicamente producir proteína de fusión MBP-GLIC en el intervalo de 10 a 12 mg / l de cultivo. Aunque este valor puede variar en los diferentes mutantes, en particular para las posiciones enterradas dentro de la proteína, el rendimiento puede verse comprometida de manera significativa. En estos casos,...

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Discusión

espectroscopia EPR ha demostrado ser un enfoque estructural sin precedentes en la cuantificación de los cambios conformacionales en proteínas de la membrana en un entorno casi nativo. Este enfoque nos permite un vistazo a los detalles moleculares de la dinámica de proteínas que están ocultas en alta resolución de estructuras de cristalografía de rayos X y la crio-microscopía electrónica. Sin embargo, es importante tener en cuenta las limitaciones técnicas de este enfoque que puede afectar a la aplicabilidad general a ot...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Estamos muy agradecidos a los miembros actuales y anteriores del laboratorio Chakrapani para la lectura crítica y los comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención (1R01GM108921) y la Asociación Americana del Corazón (NCRP Desarrollo Científico de Grant 12SDG12070069) y Carolina del Sur.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Mutagénesis dirigida al sitio y mutaciones
10x Tampón de reacción PfuUltra HFAgilent Technologies600380-52
dNTPSNueva Inglaterra BioLabs Inc‎N0447L10 mM cada uno dNTP
pfu Ultra ADN polimerasaAgilent Technologies600380-512.5 U/ul
DPNINueva Inglaterra BioLabs Inc‎R0176S20,000 U/ml
XL10 GOLDAgilent Technologies200314
medios SOCNueva Inglaterra BioLabs Inc‎B9020S Kanamicina
Fisher ScientficBP905
LB mediosInvitrogen127957084
Miniprepkit QIAGEN27106
C43 células competentesLucigen60446
Expresión y purificación
de glucosaFisher ScientficD16
TriptonaFisher BioreactivosBP1421-500
Extracto de levaduraAmrescoJ850
GlicerolFisher BioreactivosBP229
K2HPO4Amresco0705
K2HPO4Amresco0781
IPTG (isopropil-tio-β-galactósido)Oro BiotecnologíaI2481C25
Trizma BaseSigma Life ScienceT1503
NaClSigma-AldrichS7653
DNase ISigma Life ScienceDN25
PMSFAmrescoM145
LeupeptinaAmrescoJ580
PepstatinaAmrescoJ583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside)AnatraceD310S
Resina de amilosaNew England BioLabs Inc‎E8021L
TCEPAmrescoK831
EDTAFisher ScientficBP118
MaltosaAcros Organics329915000
Superdex 200 GLGE Healthcare17-5175-01
Polipropileno vacío Columna de cromatografíaBioRad731-1550
Etiquetado de giro dirigido al sitio
MTSL (1-oxil-2,2,5,5-tetrametil-3-pirrolina-3-metilo) MetanetiosulfonatoToronto Reaserch chemicals IncO873900
1-acetoxi-2,2,5,5-tetrametil-Δ 3-pirrolina-3-metilo) metanetiosulfonatoToronto Reaserch chemicals IncA167900
DMSOJ.T. Baker9224-01
Reconstitución
Lípidos de asolectinaÁlpidos polares Avanti Inc541602C
Biobeads (perlas de poliestirina)Bio Rad152-3920
MetanolProductos químicos de FisherA413
FRET
Fluoresceína-maleimidaThermoFisher ScientificF-150
Tetrametilrodamina-maleimidaThermoFisher ScientificT-6027
POPCAvanti lípidos polares Inc850457C
POPGAvanti lípidos polares Inc840457C
E.coli extracto lipídico polarAvanti lípidos polares Inc100600C
HEPESSigma Life ScienceH3375
Medición
TPX capilares de plástico BrukerER221
EDDA (Etilendiamina-N, ácido N'-diacético)Aldrich158186
Ni(OH)2Aldrich283622
de Cys(EPR

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