FRET Imaging en hidrogeles tridimensionales

Resumen

formación de imágenes por resonancia Förster transferencia de energía (FRET) es una poderosa herramienta para estudios de biología celular en tiempo real. Aquí se presenta un método para las células de formación de imágenes de FRET en fisiológicos microambientes tridimensional (3D) de hidrogel utilizando microscopía de epifluorescencia convencional. Se describe un análisis de sondas FRET ratiometric que produce coeficientes lineal en el intervalo de activación.

Resumen

Obtención de imágenes de Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) es una herramienta poderosa para el examen de la biología de células en tiempo real. Los estudios que utilizan FRET emplean comúnmente cultura de dos dimensiones (2D), que no imita la de tres dimensiones (3D) microambiente celular. Se presenta un método para llevar a cabo la emisión de imágenes se inactivó FRET usando microscopía de campo amplio de epifluorescencia convencional de células dentro de un entorno de hidrogel 3D. Aquí se describe un método de análisis para las sondas FRET ratiometric que produce coeficientes lineal en el intervalo de activación de la sonda. Medición de los niveles intracelulares de adenosina cíclico monofosfato (cAMP) se demuestra en los condrocitos bajo estimulación forskolina usando una sonda para EPAC1 de activación (ICUE1) y la capacidad de detectar diferencias en cAMP de señalización depende del tipo de material de hidrogel, en el presente documento un hidrogel fotorreticulación (PC-gel, polietileno glicol dimetacrilato) y un hidrogel termosensible (TR-gel). En comparación con los métodos 2D FRET,este método requiere poco trabajo adicional. Laboratorios ya que utilizan imágenes de FRET en 2D pueden adoptar fácilmente este método para realizar estudios celulares en un microambiente 3D. Además, puede estar aplicada a la detección de drogas de alto rendimiento en 3D microtejidos ingeniería. Además, es compatible con otras formas de formación de imágenes FRET, tales como la medición de anisotropía y de formación de imágenes de vida de fluorescencia (FLIM), y con plataformas avanzadas de microscopía confocal usando, por impulsos, o la iluminación modulada.

Introducción

la señalización celular es complejo y trascendental para numerosos campos, incluyendo la farmacología, la ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Se necesitan herramientas de investigación útiles para mejorar nuestra comprensión de la biología celular y el desarrollo de materiales óptimos para la regeneración de tejidos. Formación de imágenes por resonancia Förster transferencia de energía (FRET) es una herramienta esencial que permite el análisis de la activación del receptor, conformación molecular, y las interacciones supramoleculares (por ejemplo., Proteína / formación de complejos de ADN) en las células vivas. FRET es un tipo de transferencia de energía no radiante entre fluoróforos ^1. Tiene una eficiencia que es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre un fluoróforo donador y fluoróforo aceptor. Por lo tanto, puede proporcionar información sobre la distancia espacial entre dos moléculas diferentes en las distintas regiones o de una molécula en la escala nanométrica (típicamente 1 - 10 nm) ^2. Los fluoróforos donante y aceptor pueden ser diferentes mtipos olecule (hetero-FRET), en la que el donante tiene la mayor emisión de energía (longitud de onda más corta), o del mismo tipo (homo-FRET). de imágenes FRET se puede realizar en las células fijas o en vivo, pero en general se utilizan células fijadas para obtener imágenes de las interacciones moleculares en alta resolución espacial cuando los sistemas confocal de alta velocidad no están disponibles. Las células vivas se utilizan para estudiar las interacciones y procesos que son inhibidas o alterado por fijación, tales como la respuesta en tiempo real ³ de señalización intracelular.

estudios de células vivas que emplean FRET uso de imágenes bidimensionales (2D) cultivos celulares en parte debido a la simplicidad y el fondo inferior (sin emisión desde fuera de las células planas). Sin embargo, los cultivos 2D también alteran numerosos procesos celulares en comparación con el microambiente fisiológico y cultivo en tres dimensiones (3D) ^4,5. Por ejemplo, la célula originaria de la célula y las interacciones célula a la matriz extracelular se alteran drásticamente en cultivo 2D que lleva a la EASAIA observó cambios en la morfología celular y la polaridad ^6. Microdominios de membrana (por ejemplo., Caveolas y balsas de lípidos) y la señalización del receptor están fuertemente regulados por el ambiente de cultivo, en parte porque se unen componentes del citoesqueleto ^7,8 y la estructura de la forma celular y del citoesqueleto están fuertemente regulados por el ambiente de cultivo espacial ^9. Mecanotransducción no sólo está influenciada por la matriz de 3D, sino por las más complejas condiciones de carga secundarios engendrada en entornos 3D en comparación con cultivos 2D ^10. Por último, la permeabilidad de matrices 3D es menor que el medio de cultivo, en general con una disminución de la difusión y el aumento de la unión de moléculas de señalización celular en comparación con cultivos 2D. Con los cultivos 3D uno es capaz de crear y observar un microambiente más similar a la fisiológica con respecto al adhesivo, química, y las señales mecánicas. Interacciones célula a célula puede ser promovida y las propiedades adhesivas se puede controlar wITH la estructura, la composición y arquitectura (patrón) del material 3D ^11-13. Las propiedades mecánicas del material del mismo modo se pueden adaptar por la composición y estructura de ^14,15. El cultivo de células en hidrogeles, por tanto, los permisos de FRET estudios sobre células primarias que de otro modo de-Diferenciar o cambio en el fenotipo usando técnicas convencionales, por ejemplo., Las células de cartílago articular. Por lo tanto, se necesita un método para permitir a los ensayos de FRET en cultivos 3D en vivo.

andamios de hidrogel son ideales para los estudios basados ​​3D FRET, ya que pueden hacerse ópticamente transparente y adaptados para controlar el microambiente y para proporcionar señales celulares. Los hidrogeles a base de polímeros naturales se han utilizado en el cultivo celular durante décadas, incluyendo gelatina y fibrina ^16. Un mayor control sobre el microambiente celular se puede lograr con la modificación química de estos polímeros y con el uso de polímeros sintéticos ^17,18. hidrOGEL rigidez mecánica y la permeabilidad puede ser controlado cambiando su composición polimérica y el tamaño de malla (polímero y la densidad de reticulación) ^19,20. Además, los hidrogeles se pueden hacer bioactivo a través de la incorporación de factores de crecimiento y ligandos celulares. Debido a estas posibilidades, el desarrollo de hidrogeles para biodetección, administración de fármacos, y aplicaciones de ingeniería de tejidos es un área muy activa de investigación ^21. La impresión en 3D de los hidrogeles también está en desarrollo para la fabricación de micro-tejidos y -órganos ^15. Por lo tanto, FRET de formación de imágenes de células en hidrogeles no sólo es útil como un medio para aproximar el comportamiento celular fisiológica, sino también como una herramienta para estudiar y optimizar el crecimiento del tejido de ingeniería.

sondas FRET ratiometric binarios son muy útiles en el estudio de la señalización celular y pueden ser utilizados en cultivos de hidrogel. Para obtener una lista parcial de los fluorescentes publicado y sondas FRET, consulte la página web de la célula Migración Consorcio ^{22. El tipo más común de la sonda contiene dos fluoróforos diferentes que están asociados o conectados por un elemento de reconocimiento (s) (región sensible analito). Estas regiones se someten a un cambio conformacional, asociación o disociación después de la detección del analito (por ejemplo., La unión de un ion o molécula, escisión enzimática de la región) que altera la distancia entre fluoróforos y, por tanto, la magnitud FRET (mayor o menor) 23. Un tipo de sonda menos común pero útil se basa en un cambio sensible analito en la superposición espectral de los dos fluoróforos, que altera la magnitud de FRET. "De cadena sencilla" sondas ratiometric utilizan un par fluoróforo unido en una sola molécula. Sondas "de cadena dual" utilizan pares de fluoróforo en moléculas separadas, pero su expresión se pueden acoplar con el mismo casete de expresión 24. A diferencia de los estudios con la expresión solo fluoróforo (por ejemplo., Proteínas de fusión fluorescentes), los estudios con radiométricasondas FRET no requieren dual transfección para controlar la eficiencia de transfección o la viabilidad celular. Sondas FRET Ratiometric son relativamente insensibles a la eficacia de transfección cuando se expresa por encima de un umbral mínimo (concentración insensible) 23,25. Ellos son insensibles a las fluctuaciones de la fuente de excitación y otros factores del entorno intracelular (por ejemplo., PH, iones) siempre y cuando ambos fluoróforos son igualmente sensibles. Además, su respuesta no está sujeta a un retraso de la transcripción, a diferencia de fluorescente y bioluminiscente de promotor-indicador construye 26,27.}

sondas FRET radiométrica se emplean fácilmente y con frecuencia en los sistemas de microscopio de campo amplio de epifluorescencia convencionales. microscopios de campo amplio se prefieren sobre los sistemas confocal de barrido de línea de imágenes de células vivas, debido a las preocupaciones sobre el costo del sistema, blanqueo fluoróforo, y la captura de los cambios de señal con suficiente resolución temporal. Además, anal sola célulaanalysis sobre una gran población de células es posible con un escenario y la captura de imágenes motorizada a través de múltiples campos de visión. Widefield microscopía requiere un análisis basado intensidad de las señales de la sonda hetero-FRET. Aunque el análisis de la intensidad no requiere un hardware complejo como otros métodos de FRET, se necesita más trabajo posterior a la adquisición para corregir los efectos de comportamientos fluoróforo y configuraciones del sistema microscopio / ²⁸ imágenes. La intensidad de emisión de un fluoróforo capturado es una función de la energía de excitación, fluoróforo rendimiento cuántico, y el filtro y la cámara combinada / detector sensibilidad espectral y la linealidad ^2. Estos pueden ser diferentes para el donante y el aceptor y requerirán de calibración para el análisis cuantitativo. Además, las imágenes de la emisión del aceptor está influenciada por la superposición espectral de los fluoróforos (excitación de aceptor por la luz de excitación del donante y de purga a través de la emisión de donante en los espectros de emisión del aceptor) ^2.4; de cadena sencilla "sondas son internamente normalizada porque sus fluoróforos son equimolar a nanoescala, mientras que los fluoróforos de" cadena "de doble sondas pueden existir en diferentes estequiometrıas lo largo de una célula ^25,28 Si los fluoróforos de." De una sola cadena " sondas son de brillo similar (en función del coeficiente de extinción y el rendimiento cuántico), los efectos de la sensibilidad del detector no lineal son corrección pequeña y sólo para la fluorescencia de fondo y la sensibilidad de rendimiento / detector cuántico acoplado que se necesita ^23. Así, "de una sola cadena" sondas FRET radiométrica se implementan con mayor facilidad en la microscopía de campo amplio ^24.

En este trabajo se describe una técnica sencilla para realizar FRET de imágenes de células vivas en los cultivos de hidrogel 3D usando un microscopio de campo amplio de epifluorescencia convencional. Puede ser fácilmente adoptada por los laboratorios ya se llevan a cabo experimentos de FRET en 2D, además de los laboratorios interesados ​​en interla señalización celular en microtejidos. Aquí se demuestra con el método de medición basado en imágenes de FRET de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) en los niveles de condrocitos vivos dentro de foto-reticulación (PC-gel, polietileno glicol dimetacrilato) y la respuesta térmica (TR-gel, Matrigel) hidrogeles. Una sonda FRET radiométrica se utiliza sobre la base de EPAC1 (ICUE1) para detectar los niveles de cAMP en respuesta a forskolina, un agonista de química para la adenilil ciclasa, que cataliza la conversión de ATP a AMPc. cAMP es uno de los principales segundos mensajeros que median G señalización del receptor acoplado a proteína y activa varios factores, incluyendo las proteínas de intercambio de aguas abajo directamente activadas por cAMP (EPAC). Los fluoróforos se separan sobre cAMP unión al dominio de EPAC que resulta en una disminución de FRET. Se describe aquí es la preparación de los materiales de hidrogel, la transfección de células con la sonda ICUE1, y la incrustación de las células en hidrogeles 3D. El procedimiento experimento 3D traste y el análisis de imágenes necesariopara evaluar la actividad de la sonda por célula se explican. También se discuten las limitaciones inherentes de análisis FRET en 2D y 3D utilizando microscopía de campo amplio. La técnica presentada aquí es una mejora sobre los métodos 2D existentes, ya que permite el análisis en un contexto más fisiológica y requiere menos corrección de la imagen y la calibración. Gran utilidad reside en el hecho de que muchos materiales transparentes se pueden utilizar mientras que las preferencias de células y transfección se pueden mantener.

Protocolo

1. Preparación de Materiales

1. Preparar polietilenglicol dimetacrilato (PEGDM, 4000 MW) por methacrylating glicol de polietileno, según métodos descritos por Lin-Gibson et al. ^29. Alternativamente, PEGDM puede ser comprado.
2. Sintetizar el fotoiniciador, litio fenil-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), a través de un proceso de dos pasos en donde se hace reaccionar primero con cloruro de dimetil phenylphosphonite 2,4,6-trimetilbenzoil través de una reacción de Michaelis-Arbuzov y luego la sal de litio creado por la adición de bromuro de litio en 2-butanona, de conformidad con Majima et al. ^30.
   Nota: Como alternativa, otros fotoiniciadores se pueden comprar, pero LAP muestra mejor biocompatibilidad y la eficiencia de reticulación ^31.
3. Funcionalizar el cubreobjetos de vidrio para permitir la unión del hidrogel para el vidrio y de este modo evitar el movimiento durante la exploración.
   1. En una campana química con el equipo de protección personal adecuado, el uso3- (trimetoxisilil) propil metacrilato de acuerdo con el protocolo del fabricante para PC-geles y silanos epoxi (3-glicidoxipropiltrimetoxisilano) Tr-geles de ^31. Nota: Como alternativa, los portaobjetos recubiertos previamente se pueden comprar. Tenga en cuenta que la hoja de la cubierta debe ser mayor que la del plato de PDMS en el paso 3.8.

La transfección de la célula 2.

1. En una campana de cultivo de tejidos y utilizando técnicas estériles, descongelación y la placa de las células deseadas en sub-confluencia (50 - 70%), los condrocitos en el presente documento de la especie bovina en 15.000 células / ^cm2 en 6 pocillos placas de cultivo no tratados. Nota: Cualquier tipo de célula de referencia puede ser utilizado, incluyendo las células de anclaje independiente.
   1. Permiten que las células se recuperen durante un día en una incubadora a 37 ° C. Antes de los pasos posteriores, retire medio, lavar con PBS, y se añade medio de 2 ml de fenol y libre de suero por pocillo.
2. Al día siguiente, para cada pocillo, añadir 100 l de medio de fenol y libre de suero, así como 3reactivo de transfección l a un tubo de ensayo de vidrio en autoclave. Para mezclar, agitar el tubo a la ligera. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Limitar cualquier tipo de exposición a la luz.
3. Añadir 1 g de FRET sonda de ADN y agitar suavemente. Se incuba la mezcla a temperatura ambiente y protegido de la luz durante 30 minutos.
   Nota: En este experimento ICUE1 plásmido se utilizó (cortesía del Dr. Jin Zhang ^33). Los fluoróforos en ICUE1 son proteína fluorescente cian (CFP, donante) y proteína amarilla fluorescente (YFP, aceptante). La proporción de reactivo de transfección con el plásmido de ADN se necesitar un ajuste para la transfección óptima de diferentes tipos de células.
4. Distribuir la mezcla preparada (~ 104 l) gota a gota a cada uno de los 6 pocillos que contienen células más 2 ml de fenol y medio libre de suero. No pipetear arriba y abajo. Hacer girar suavemente la placa para mezclar.
5. Se incuba a 37 ° C durante 48 horas. Nota: confluencia inhibe la eficiencia de la transfección y altera la expresión endógena de los receptores.

3. Fabricación dePDMS Moldes para fundición de hidrogel y Cultura

1. Para preparar una gran placa de vidrio a emitir el polidimetilsiloxano (PDMS) sobre, limpiar el cristal primero con jabón, enjuague con una copiosa cantidad de agua, y luego se seca con isopropanol seguido por el aire.
   1. Se trata el vidrio con un reactivo siliconado según el protocolo del fabricante de modo que el PDMS se pueden despegar fácilmente después del curado. Enjuague reactivo residual fuera de la superficie con tolueno sobre un recipiente de captación. Deje que la superficie se seque al aire completamente antes de usar o de calor a 100 ° C para acortar el tiempo de espera.
2. Seleccione una altura de hidrogel (por ejemplo, 1 mm) y calcular 1,2 veces el volumen de PDMS necesarios para cubrir el portaobjetos de vidrio con PDMS de este espesor usando las dimensiones de la lámina de vidrio y la altura de hidrogel. Nota: PDMS no se encoge.
   1. Mezclar los componentes del kit de PDMS en una relación de 10: 1 en peso en un vaso de precipitados. Una vez que se mezcla bien, colocar el vaso debajo de la casa de vacío para desgasificar. relIEVE el vacío si las burbujas comienzan a desbordar el recipiente y repetir.
      Nota: Otros espesores de hidrogel se pueden usar, pero a costa de un aumento de fondo y un aumento de la opacidad si centrifugación (etapa 6.2) no se utiliza.
3. Envuelva el papel de aluminio alrededor de la base y los lados del vaso para contener el PDMS. Con cuidado, se vierte la cantidad deseada de PDMS desgasificados sobre este vidrio rodeado de papel de aluminio. Medir la altura de PDMS. Tenga en cuenta que la altura de los PDMS será la altura máxima del hidrogel. Si se crean las burbujas de cuando se vierte, desgasificar de nuevo o hacerlas explotar con una espátula o una aguja.
4. Coloque el PDMS sin curar en una superficie plana en un horno a 100 ° C durante 2 horas, o dejarlo a temperatura ambiente durante 24 horas.
5. Retirar con cuidado el PDMS de la superficie una vez que se ha curado. Perforar la forma deseada (por ejemplo, punzón cilíndrico de 3 mm) para los hidrogeles.
   Nota: fotorreticulación rendirá cilindros PC-gel ligeramente más estrecho que el diámetro del molde debidoa enfriamiento rápido de la reacción por el oxígeno molecular en el PDMS.
6. Esterilizar el PDMS perforadas. Para los experimentos a corto plazo, se sumergen de PDMS en etanol al 70% durante 1 hora.
7. Montar el molde mediante el ajuste de la base de los PDMS esterilizados con un cubreobjetos de vidrio estéril de un espesor adaptado a la corrección de objetivo de microscopio. Ponga a un lado para su uso en el paso 6.
8. Fabricar un plato más grande PDMS utilizando los métodos anteriores (con un pozo más ancho y más alto que el hidrogel) para contener el hidrogel y medio. Cabida a un volumen de medio de al menos 10 veces más que el hidrogel para sumergir el hidrogel y para minimizar la dilución de analito.

4. Preparación de hidrogel precursores Soluciones

1. En una campana de cultivo de tejido y el uso de técnicas estériles, preparar el hidrogel soluciones de precursor apropiado para el estudio inmediatamente antes de la adición de células. Preparar PC-gel a partir del precursor de polímero de la siguiente manera.
   1. Mezclar el polvo PEGDM en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2) a 10% (w / v).
   2. Añadir el fotoiniciador (por ejemplo, LAP) a una concentración final de 0,005 hasta 0,01% (w / v) y se mezcla mediante pipeteo. Cubrir la solución con papel de aluminio o escudo de la luz como LAP es sensible a la luz.
      Nota: Aquí se utiliza el factor de reducción del crecimiento de la matriz extracelular TR-gel como se suministra por el fabricante.

5. suspensión de células en hidrogel Soluciones

1. En una campana de cultivo de tejido y el uso de técnicas estériles, aspirar el medio de los pocillos.
2. Añadir PBS a los pocillos y trasladarlo a continuación a enjuagar bien monocapas de células unidas.
3. Disociar las células del sustrato de cultivo usando 2 a 3 ml por 25 cm ² de la solución de disociación celular. Agite con cuidado, y luego se incuba a 37 ° C durante 10 - 20 minutos o hasta que se disocian. Dé un toque firme plato si es necesario para desalojar las células.
   Nota: Las soluciones de disociación celular alternos están disponibles con una selección limitada a aquellos que no lo hacen iMpact la vía de señalización que se analiza por los receptores de interés escindir.
4. Después se separan las células, añadir 2 ml de medio de fenol y libre de suero, suspender las células, y contar las células con un hemocitómetro. Nota: medio libre de suero químicamente definido (por ejemplo, complementado con insulina, transferrina y selenio) pueden también ser utilizados.
5. Alícuota el número deseado de células en función del tipo de células en viales estériles y pellet (por ejemplo, 2.0 x 10 ⁶ células por vial).
6. Eliminar el sobrenadante, añadir el volumen deseado de precursor de hidrogel y suspender las células mediante pipeteo. Utilizar un volumen de precursor que rendirá 2 x 10 ⁵ células / cm ² en el plano xy al visualizar el eje z del hidrogel como se derrumbó (por ejemplo, 1,0 ml por vial para un hidrogel de 1 mm de espesor que contiene 2 x 10 ⁶ células / ml). Tenga cuidado de no producir burbujas.
   1. Pasar rápidamente al siguiente paso para limitar los efectos negativos sobre la viabilidad celular ^{34 <}/ Sup>.

6. Preparación de hidrogel

1. En una campana de cultivo de tejido y el uso de técnicas estériles, añadir el precursor de hidrogel que contiene la célula a los moldes de fundición preparados en la etapa 3 (por ejemplo, 7,1 l por 3 mm de diámetro x 1 mm de alto) de molde. Crear un hidrogel adicional, de acuerdo con los mismos métodos descritos, a utilizar para la calibración del sistema de formación de imágenes de microscopio y la sonda de calibración (si la eficiencia inherente de la sonda es desconocido).
2. Centrifugar el precursor de hidrogel antes de la gelificación / reticulación para optimizar imágenes mediante el confinamiento de las células a un solo plano focal y la minimización de la señal de plano que contiene células preparado (Figura 1). Ajuste el tiempo de centrifugación y la fuerza para el tipo de célula y la viscosidad del precursor (400 g durante 4 min).
3. Gel o reticular la solución
   1. Para el hidrogel de PC-gel, irradiar el precursor que contiene células con un UV-A fuente de luz (λ = 365 nm) durante un tiempo de exposición igual a3,2 J / cm ² por milímetro de espesor a photocrosslink.
      Nota: Utilice un espesor mínimo de 1 mm en el cálculo. Las exposiciones deben caer en el rango de 1-5 minutos. Utilice el tiempo de exposición mínimo. Evitar el exceso de irradiación de las células, lo que disminuiría la viabilidad y blanquear el donante PPC. Sin embargo, los tiempos de exposición de menos de 60 s no se recomiendan debido a la irradiación de alta intensidad conduce a radicales de auto-extinción y la mala viabilidad celular.
   2. Para el hidrogel TR-gel, colocar el molde lleno en un plato de petri y se mueven a una incubadora a gelate térmicamente. Incubar a 37 ° C durante 30 min.
4. Después de la gelificación o reticulación del hidrogel, retirar el molde de fundición hidrogel PDMS y reemplazarlo con el plato grande PDMS preparado (a partir del paso 3.5). Presione el PDMS abajo en el cristal con una espátula estéril para adherirlo.
   1. Coloca este PDMS plato con cubreobjetos en un recipiente estéril, tal como una placa de Petri. Añadir medio libre de suero libre de fenol o químicamente definido míDium (medio libre de suero complementado con insulina, transferrina y selenio (paso 5.4)) al pozo creado con el plato de PDMS y cubreobjetos para mantener el hidrogel sumergido. Incubar a 37 ° C durante 30 min.
      Nota: Si se utiliza un plato especializado con un cubreobjetos, a continuación, colocar el cubreobjetos en eso y poner parecida medio.
   2. Alternativamente, lleve a cabo este paso, el día antes de imágenes FRET para permitir que las sondas se recuperen como las longitudes de onda de irradiación se superponen con el espectro de excitación del donante PPC.

7. 3D Imaging FRET

1. Retirar la cápsula de PDMS con el hidrogel de la placa de Petri, preparado en el paso 6.4, y fijarlo en un soporte de muestras ajustable para la platina del microscopio XY (Figura 2). Coloque el soporte de la muestra sobre la platina del microscopio. Aplique aceite al objetivo si es necesario. Utilice un objetivo de al menos 40 veces y de alta apertura numérica (NA) (es decir, 1,3 NA) para capturar el fluoróforo relativamente débillas emisiones e.
2. Configurar los campos de visión (FOV) para la adquisición de la imagen: Seleccionar celdas para obtener imágenes mediante imágenes de luz transmitida y verificar la transfección con imágenes de fluorescencia. Elija por lo menos 15 células diferentes.
   1. Seleccionar las células que no son ni demasiado brillante ni demasiado oscura (que de otro modo podría llevar a la sonda sobre-saturación o baja sensibilidad) y con la relación de FRET entre 0.0 y 1.0 (que de lo contrario indica un daño o deterioro de la sonda binario). Luego apague la luz para limitar la exposición.
   2. Seleccione FOV cerca del centro del hidrogel y con las células de interés dentro del campo de iluminación relativamente plana (Ver Figura 3B y Paso 9.2 más adelante).
3. Configurar los ajustes de la cámara para los canales de imagen FRET. Puede elegir entre unas pocas células cerca del centro del campo de visión para optimizar las configuraciones "ópticos" (es decir., Exposición y ganancia por canal imagen).
   Nota: La nomenclatura varía continuación depending del software utilizado para operar el microscopio y la cámara. El software de microscopio, NIS-Elements, se utiliza aquí para la captura y análisis de imagen.
   1. Para el análisis FRET de sondas de cadena simple, seleccionar dos canales de imagen por FOV: Templado de emisión (QE), que es la emisión del donador bajo excitación del donante y emisión del aceptor bajo excitación del aceptor (AEM).
      Nota: Para la sonda ICUE1 PPC-YFP, un par de excitación PPC y filtro de emisión de QE (418 - 442 ex 458 - 482 em) y una excitación y emisión par YFP AEM (490 - 510 ex 520 - 550 em) son usados.
   2. Ajuste la exposición de QE y AEM para adquirir la intensidad de señal máxima sin saturación (y si se utiliza un CCD, con la ganancia mínima posible) para reducir al mínimo el ruido de fondo. Mantener las configuraciones ópticas el mismo para ambos fluoróforos y durante todo el experimento, así como entre los grupos experimentales para evitar sesgar los resultados (es decir, potencia de excitación, el tamaño de iris, la exposición y ganancia de la cámara) (Figure 3A).
   3. Adquirir canales de imagen adicionales para permitir más opciones de análisis después de la adquisición (por ejemplo, la emisión sensibilizada corregida (CSE) de imágenes (ver Discusión)). Para la sonda ICUE1 PPC-YFP, adquirir la excitación (Ex) y los canales de emisión (Em) de _donantes Ex - _donante Em (QE, seleccione PPC-PPC en el software del microscopio), Ex _donante - _aceptor Em (SE, seleccione PPC- YFP), ex _aceptor - _aceptor Em (AEM, seleccionar YFP-YFP), y el _receptor Ex - configuraciones _{de donantes} Em (YFP-PPC) (véase la Figura 3A).
4. Configurar la velocidad de captura para la adquisición de la imagen de lapso de tiempo.
   1. Disminuir la velocidad de captura aunque limitado por el hardware. Para los ensayos a corto plazo (por ejemplo, 30 - 60 min), representan alrededor de 12 adquisiciones por minuto para cada campo de visión (frecuencia de muestreo de 5 segundos) para capturar la cinética de señalización. Utilice la frecuencia de muestreo mínima necesaria para evitar signinificativamente photobleaching la sonda.
   2. Ajuste la velocidad de adquisición escribiendo la periodicidad de las capturas en el software del microscopio. Para los ensayos a largo plazo (por ejemplo., 24 h), comience por la alta velocidad de adquisición de capturar la respuesta de impulso inicial y luego cambiar a una velocidad de adquisición de baja, por ejemplo, cada 5 a 10 minutos.
5. Seleccione "Ejecutar ahora" en el software del microscopio para iniciar las imágenes de adquisición de imágenes y captura durante 5 minutos para establecer una línea base para la respuesta de la sonda en el FOV designados.
6. Después de 5 min de adquisición de imágenes, la pipeta en el agonista o antagonista de analito deseado (por ejemplo, Forskolin a 100 nM), mezclar mediante pipeteo, y continuar de imágenes.

8. Calibración de FRET

1. La calibración del sistema: usar el hidrogel de calibración adicional, fabricado como se describe en el paso 6, para adquirir imágenes Aem de al menos 6 células representativas utilizando los mismos criterios FOV, configuraciones ópticas, y conjunto de cámaraajustes de imagen utilizado para FRET anterior (pasos 7.1, 7.2, y 7.3).
   Nota: se necesita Cuantificación del rendimiento cuántico y la sensibilidad espectral (QS) para el sistema de sonda y de formación de imágenes de microscopio combinada para "absoluta" FRET análisis pero no para FRET "relativo".
   1. Photobleach el fluoróforo aceptor mediante la selección de una larga exposición de 5 minutos a la luz de excitación a intensidad máxima (excitación en el canal AEM). Utilizar una apertura estrecha para blanquear sólo las células de interés. Compruebe que la señal de AEM es al menos un 10% más baja que la señal original mediante la comparación de la intensidad de la señal histograma (ventana "LUT") antes y después de photobleaching. Continuar photobleaching si la pérdida de señal es menor que 90%.
      Nota: Asegúrese de que el fluoróforo donante no se blanquea durante este procedimiento mediante el uso de filtros de excitación Aem que no se superponen con el espectro de excitación del donante.
   2. Adquirir la emisión del donador bajo excitación de los donantes con el fluoróforo aceptor ahora blanqueada (Dem) nosing la misma configuración óptica como para QE en el paso 7.3.
   3. Calcula QS por píxel como Dem dividida por AEM después de la corrección de fondo, como en la sección 9 a continuación. QS = Dem / AEM
   4. Calcular el promedio QS entre las células de los promedios móviles.
2. Estimar la eficiencia de FRET inherente de la sonda (Ei) usando la muestra de calibración. Provocar el máximo de la sonda FRET y calcular Ei = 1 - QE / (AEM x QS) como en la sección 9 a continuación. Alternativamente, use Ei = CSE / AEM, o Ei calcularon usando un ensayo de punto final convencional para la eficiencia de FRET con Ei = 1 - (QE / DEM).
   Nota: Ei es necesaria para cuantificar la fracción absoluta de sondas activadas (FAP, es decir, la fracción de sondas analito de unión), pero no es necesario para "relativo" FRET análisis.
   1. Saturar respuesta de la sonda estimulando la cultura con un agonista de analito producción / activación para las sondas que aumentan en FRET tras la interacción con el analito.
   2. Interactio inhibir la sondan con el analito usando un antagonista de la señalización para las sondas que disminuyen en FRET tras la unión del analito. Nota: En el caso de la sonda ICUE1, suprimir los niveles de AMPc con un inhibidor de la adenil ciclasa, tales como 2 ', 5'-didesoxiadenosina (específica) o 3-isobutil-metil-xantina (no específica).

9. Relación de FRET Cálculo

1. Dibujar y designar una región de interés (ROI) por FOV cerca de las células para definir el nivel de fondo (Figura 3B) en cada FOV con el tiempo, pero restringir el retorno de la inversión a la zona de iluminación relativamente homogénea sobre el centro de la imagen (Figura 4A ). Véase la discusión para una explicación de las opciones de corrección de fondo.
   1. Con el software de microscopio: Seleccione la flecha en el "Icono de retorno de la inversión del fondo" y seleccionar "Dibujo elíptica retorno de la inversión de fondos" (otras formas funcionarán). Asegúrese de que "mantener la actualización del fondo de compensación" está seleccionado. activar vieala del retorno de la inversión de fondo haciendo clic en el icono de retorno de la inversión del fondo. Como alternativa, utilice el "Icono de retorno de la inversión" y las propiedades de ROI establecidos como "retorno de la inversión Uso como fondo" y "regiones de interés son diferentes en cada multipunto".
   2. Con ImageJ: Utilice la barra de herramientas para seleccionar la herramienta de dibujo circular. A continuación, añadir la forma al gestor de retorno de la inversión a través del menú "Analizar → Herramientas → Administrador de retorno de la inversión". Establecer un color diferente para el retorno de la inversión de fondo en el Administrador de retorno de la inversión si se desea.
   3. Para cada canal FOV y la imagen (por ejemplo, QE y AEM), restar el valor medio en el fondo de retorno de la inversión por punto de tiempo para crear una imagen corregida por canal, por ejemplo, SQE _{t, p} = QE _{t, p} - bqe _{t, p} donde t es el tiempo de adquisición, p es el campo de visión (es decir, la posición xy), y bqe y BAEM son los valores escalares de la señal dentro de la ROI de fondo. Utilice las funciones aritméticas de imagen disponibles en el software.
      1. Won el software de microscopio, utilizar el "Icono de retorno de la inversión del fondo" y seleccione "Antecedentes Reste Uso de retorno de la inversión". En la ventana emergente, seleccione "Cada imagen" bajo "fondo Reste ROI en" y seleccione "Todos los marcos" en "Aplicar a".
         Nota: un retorno de la inversión de fondo debe ser definida en cada campo de visión para que esta función funcione correctamente (por ejemplo, la función no restar correctamente los fondos para FOV con ROI de fondo si alguna FOV tiene ROI fondo no definidos.).
      2. Con ImageJ, utilice la "Sustracción BG de retorno de la inversión" macro escrito por Michael Cammer (http://microscopynotes.com/imagej/macros/).
   4. Guardar la serie de tiempo corregido de imágenes mediante la opción "Guardar como" para los siguientes pasos de análisis.
2. Definir una ROI alrededor de la célula usando una máscara binaria para cada celda bajo análisis en cada FOV (Figura 4B). Utilizar el canal de AEM para umbral de la imagen por FOV en el inicio of experimento, identificar los límites de las celdas, y se define el rendimiento de la inversión. Guarde el rendimiento de la inversión.
   1. Con el software de microscopio: Para cada trama (es decir, FOV), utilice primero el menú "Binary → Definir Umbral" y seleccione "se aplica a fotograma actual". Ajustar el valor umbral inferior para seleccionar las células. A continuación, utilice la función "Binary → Cerrar" para llenar los huecos en la máscara binaria si es necesario. A continuación, use el icono de retorno de la inversión para seleccionar "copia binaria de retorno de la inversión"; la capa binaria se elimina automáticamente.
      1. Anexar regiones de interés para los fotogramas siguientes a la piscina existente del rendimiento de la inversión. Eliminar cualquier ROI espuria. Siguiente "botón derecho del ratón" en el rendimiento de la inversión y asegurarse de que sus propiedades son "Uso como estándar retorno de la inversión" y "regiones de interés son diferentes en cada multipunto".
      2. Con ImageJ: Para cada campo de visión, primero utilice el menú "Imagen → Ajustar → Umbral". A continuación, utilice "Analizar → Analizar Partículas" Mostrar con contornos y añadir al Administrador seleccionado. Utilizar"Binary → Cerrar" para llenar "huecos" en la máscara binaria si es necesario. Eliminar espuria ROI. plugins gratuitos están disponibles para automatizar este proceso.
3. Se calcula la relación de FRET a base de QE en cada píxel, SQE / SAEM para el análisis relativo (ver paso 10) y E _QE = SQE / (x QS SAEM) para el análisis absoluta (véase el paso 10) con QS obtenido en el paso 8.1. Usa la división de coma flotante de las imágenes. Vea la sección de discusión para una explicación de las derivaciones de relación.
   1. Con el software de microscopio: Utilice el menú "Imagen → Operaciones imagen" y seleccionar "Punto Flotante".
   2. Con ImageJ: Use el "Proceso → Imagen Calculadora" función o el plug-in "Calculator_Plus.java". Nota: Como alternativa, la macro "pH_ratioMacro" .txt "puede ser adaptado para calcular los coeficientes de FRET Se emplea la macro corrección de fondo se ha descrito anteriormente y está disponible en.
4. Exportar la relación media por célula (es decir, por cada ROI) en un software de hoja de cálculo y gráficos.
   1. Con el software de microscopio: Use el botón de exportación ND en el control de análisis de "Las estadísticas de ROI" o el botón "Exportar hoja de cálculo" en el control de análisis de "Análisis de tiempo".
   2. Con ImageJ: Primero, seleccione el menú "Analizar → Conjunto de ajustes" y asegúrese de que el "valor medio" y "desviación estándar" son seleccionados. A continuación, utilice el Administrador de ROI y seleccione el botón "Medida". Guardar la ventana de resultados generados.

10. Análisis de razones FRET

1. Calcular la proporción de FRET celular promedio en el tiempo de las relaciones medias por celda (exportado en el paso 9.4). Tenga en cuenta la línea de base de FRET relaciones (la relación antes de administrar el analito) en este cálculo.
   Nota: hoja de cálculo y software de gráficos se utiliza aquí para trazar la línea de base-subtractuado relaciones medias de FRET y su error estándar de la media (SEM), utilizando una regresión lineal en la línea de base como en el paso 10.1.2 y 10.1.3 a continuación (Figuras 5 y 6).
   1. Análisis relativa (magnitud de la respuesta): Normalizar cada curva a una muestra de referencia (por ejemplo, muestra sin tratar.).
   2. Análisis absoluta (curso de tiempo de respuesta): Shift las curvas a un punto de inicio común mediante la normalización de cada curva con su línea de base FRET relación.
      1. En el software de hoja de cálculo y de gráficos, intercalar los datos (columnas de proporciones promedio por célula) con nuevas columnas, de manera que cada columna original se empareja con una nueva columna que contiene sólo datos de relación para el período de línea de base (antes de proporciones añaden analito). Seleccione "Insertar columna" para insertar una columna vacía después de cada columna de datos. A continuación, copie los datos de referencia en las columnas vacías pareadas.
      2. En el software de hoja de cálculo y gráficos, seleccione "Insertar → Nuevo → Análisis Transform Retire la línea de base "y luego ajustar" la columna seleccionada "a" todos los demás ", seleccione" asumen la línea de base es lineal ", y seleccione" diferencia "en" Cálculo ".
      3. Se calcula la relación celular normal y la estadística descriptiva. En el software de hoja de cálculo y gráficos, seleccione "Insertar → Nuevo → Análisis Los análisis XY → Fila Medias con SD o SEM" y luego seleccione "Fila significa con SEM" en la ventana emergente.

Resultados

Todos los precursores, células y moldes de fundición de hidrogel se prepararon como se ha descrito anteriormente. Las soluciones precursoras cargados de células fueron fundidas en moldes de PDMS y después se centrifugaron antes de la gelificación / fotorreticulación para inmovilizar las células cerca del cubreobjetos y facilitar FRET análisis de imágenes (Figura 1). Los hidrogeles con cubreobjetos adjuntos se colocaron dentro de los pozos preparados de formación de imágenes de PDMS para imágenes microscópicas (Figura 2). Las configuraciones ópticas y los parámetros de adquisición de imágenes se fijaron a continuación como se muestra en la Figura 3A. La captura de los cuatro canales de imagen relacionados FRET para los pares de fluoróforo CFP-YFP se demuestra (véase la sección "Conf óptico." En la Figura 3), como se necesita para las sondas no binarios. Sin embargo, en este trabajo sólo se requieren dos imágenes de la sonda de cadena simple ICUE1 binario, QE = "PPC PPC" y AEM = "YFP YFP" (emisión de excitación). Múltiples FOV (posición xyse seleccionaron s) en el que varias células residían dentro de la zona de iluminación homogénea (Figura 3B). Después de la adquisición de lapso de tiempo, se exportaron los datos de la señal de la sonda. ROIs para la corrección de fondo de señales de los canales y para el análisis de células fueron designados utilizando imágenes de umbral Aem desde el comienzo de los experimentos (Figura 4). Las células fueron seleccionados de entre el grupo de células como los que expresan suficiente (no demasiado tenue), pero no demasiado alto (excesivamente brillante) sonda (Figura 4B). Las relaciones de QE y SE FRET por píxel en cada adquisición se calcularon utilizando la división de coma flotante de los antecedentes resta canales de imagen. La relación media FRET por célula (es decir, por ROI) se calculó, normalizada a la señal de línea de base antes de la estimulación (es decir, una regresión en la línea base se resta de todos los puntos de tiempo), y se representaron con barras de error como el error estándar de la media (SEM). Tanto el QE y en base CSE relaciones de FRETproteger la actividad cAMP aumentado en los condrocitos bajo estimulación forskolina (100 nM, Figura 5). La relación QE FRET era más sensible a la corrección de fondo que la relación CSE FRET debido a que la señal de QE fue menor debido al bajo nivel basal de actividad de cAMP en los condrocitos embebidos dentro de los hidrogeles. Ambos tipos de hidrogel (TR-gel y PC-gel) mostraron un aumento en la relación de FRET con el tiempo (Figura 6), lo que indica una respuesta de señalización cAMP aumentado a la adición de forskolina. Como se indica por la relación QE FRET, condrocitos en hidrogeles PC-gel muestran un cambio mayor en cAMP (como se muestra) y un nivel basal elevado de AMPc (E _QE = 0,19 en gel de PC-vs. E _QE = 0,09 en TR-gel, no se muestra en la línea de base se resta la figura).

Figura 1: Distribución de casillas en fotoentrecruzado de hidrogel (PC-gel) A: El precursor de células cargadas de hidrogel se centrifugó para maximizar el número de células en un plano focal cerca del cubreobjetos. B: Esto aumenta el número de células en el campo de visión y reduce al mínimo la señal de fondo de fuera de las células de avión. (Barra de escala = 200 m) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: hidrogel en PDMS Plato
El hidrogel se coloca dentro de un alto PDMS bien (10x volumen de hidrogel) con una base cubreobjetos de imágenes microscópicas y la estimulación analito. Los hidrogeles PC-gel son transparentes y unido al cubreobjetos para que permanezcan en su lugar durante todo el ensayo. Los PDMS bien se pueden hacer más grande para contener 10 veces más medio que el volumen de hidrogel usando un punzón de biopsia más amplia, además de alhicker hoja de PDMS. (Barra de escala = 2 mm) Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Configuración de Adquisición de imágenes de FRET
R: La adquisición se ha configurado para la captura de imágenes cada 7 segundos a varias ubicaciones. Para el cálculo relación QE FRET, sólo se necesitan dos canales de imagen para la sonda ICUE1 usada aquí (sonda de una sola cadena binaria), QE = "CFP CFP" y Aem = "YFP YFP" (emisión de excitación) bajo el "Conf óptico". columna en la pestaña λ del software microscopio. Se seleccionaron FOV (posiciones "XY") en el que varias células residían en el área de iluminación homogénea: B. La trama por debajo de la imagen muestra la intensidad de iluminación a lo largo de la línea azul arrowedque atraviesa por el centro del campo de visión FOV. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Selección de regiones de interés para el análisis de imágenes de FRET
A: Una región de interés (ROI) libre de células fue seleccionada para corregir la señal de fondo en cada canal. Una imagen de un hidrogel libre de células en lugar puede ser usada para la substracción de fondo si la densidad celular o la migración es alta, o si una máscara de sombreado no se utiliza cuando las células no se encuentran dentro de un campo de iluminación homogénea. B: Las regiones de interés celulares fueron seleccionados mediante umbralización imagen y enmascaramiento binaria del canal de AEM. Selección de un retorno de la inversión más grande que las células afectará negativamente el cálculo del coeficiente medio de FRET por célula debido a la inclusión de proporciones extracelulares generados a partir de fondo nOise. No se recomienda el cálculo de la relación de FRET celular utilizando la media de cada canal por célula, ya que subestima la relación. (Barra de escala = 50 micras) Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: comparación de las relaciones de FRET en respuesta térmica de hidrogel (TR-gel)
Tanto QE y proporciones de FRET a base SE detectan el aumento de la actividad cAMP en los condrocitos bajo estimulación forskolina. Forskolin es un agonista de la adenil ciclasa que induce la producción de AMPc. FRET disminuye cuando la sonda se une ICUE1 cAMP, y por lo tanto la relación de QE FRET (E _QE = SQE / (SAEM x QS)) aumenta. Por el contrario, la proporción SE FRET disminuye y por lo tanto se traza como E _SE = 1 - CSE / SAEM. En condrocitos hidrogel incrustado, el QE FRET relación es más sensible a la corrección de fondo a la relación de FRET SE QE porque la señal es baja, debido a la baja actividad de cAMP basal. Las barras de error = SEM, n = 25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Comparación de la relación de FRET en diferentes hidrogeles
Los condrocitos en ambos tipos de hidrogel respondieron a la estimulación con forskolina un aumento de la actividad cAMP como lo demuestra el aumento de la relación QE FRET con el tiempo. El tipo de hidrogel impactos la respuesta celular a través de varios efectos, incluyendo las diferencias en la permeabilidad a la forskolina y en la actividad de cAMP celular basal (E _QE = 0,19 en gel de PC-vs. E _QE = 0,09 en TR-gel, que no se muestra). Las barras de error = SEM, n para TR-gel= 25, n para PC-gel = 15. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Este trabajo demuestra cómo las imágenes FRET se puede utilizar para analizar la señalización celular en hidrogeles 3D. Mientras que los estudios anteriores han demostrado FRET obtención de imágenes de células sembradas en los sustratos de hidrogel de ^35-37, de las interacciones extracelulares con hidrogeles ^38, y de las moléculas atrapadas en hidrogeles ^39-41, esta es la primera publicación para describir imágenes FRET análisis intracelular base de células embebidas dentro de hidrogeles 3D. El trabajo resuelve varios problemas de implementación cuando se traduce de imágenes FRET de 2D a 3D. En primer lugar, se necesitan objetivos gran apertura numérica para formación de imágenes FRET para reunir señal de emisión suficiente, pero limitan la profundidad de campo. Las células aquí se dejan sedimentar ligeramente a través de centrifugación para aumentar el número de células en un plano focal cerca del cristal para compensar esto. En segundo lugar, los andamios de hidrogel 3D se deriva a través del campo de visión durante la formación de imágenes que complica el análisis. Los hidrogeles aquí están unidos al coverslip de modo que permanecen fijos durante todo el experimento. En tercer lugar, la selección de composiciones de hidrogel adecuados para 3D FRET es esencial porque los hidrogeles pueden dificultar la visualización de las células. se utilizan hidrogeles Aquí transparentes de PC-gel y TR-gel. Sin embargo, la recolección de las células con centrifugación a un plano focal cerca del cubreobjetos se puede utilizar para celdas de imagen en hidrogeles con mayor diffraction.The elección de hidrogel depende de las condiciones microambiente que deberá ser simulado, que se pueden encontrar en una revisión en hidrogeles ⁴² . En cuarto lugar, se emplea un cálculo alternativo aquí para la relación de FRET de la sonda ICUE1 de cadena única (es decir, E = _QE QE / CAEM) para minimizar el número de canales de imagen necesarios para el análisis y de este modo minimizar photobleaching. La relación media FRET por célula se calcula como el promedio de las proporciones por píxel dentro de una célula para minimizar la subestimación de la relación de FRET real. Por último, un análisis radiométrico lineal y mediospara calcular la fracción activa de sondas binarios de cadena sencilla se describe.

Hay varios aspectos críticos de la realización de experimentos exitosos FRET usando microscopía de campo amplio. Con respecto al hardware, la cámara debe ser lo suficientemente sensible para resolver pequeños cambios en la señal, dejando cámaras CMOS científicos más recientes y de electrones multiplicando CCD adaptan mejor que los CCD convencionales. Para analizar mejor la distribución espacial de la relación de FRET, la cámara debe, como mínimo, poseen el doble de la resolución espacial de la función de dispersión de punto del objetivo (criterio de Nyquist). Esto hace que los sistemas de doble visión menos adecuado para la tarea. Más importante es seleccionar una velocidad de adquisición de la exposición y la imagen apropiada para el par FRET dado a fin de minimizar photobleaching de los fluoróforos. Una disminución de la tasa de adquisición se recomienda medida que aumenta la duración de la prueba. El uso de ruedas de filtros rápidos aumenta la velocidad de adquisición y el número de FOV para el análisis, mientras que evitaning las cuestiones de registro de imágenes con visualización dual y cubos de filtros torreta. El campo de iluminación no homogénea complica corrección para la fluorescencia de fondo que surge de la autofluorescencia de la muestra y el ruido del sistema de la cámara. Algunos hidrogeles, particularmente los que contienen proteínas de colágeno son altamente autofluorescent ^43,44. Las relaciones de FRET se subestiman y sin corrección de fondo. Aquí empleamos un simple método de corrección de fondo que se basa en el campo de iluminación relativamente plana que a menudo se puede configurar con iluminación epi-fluorescencia a lo largo del centro de la imagen (Figura 3B, Etapa 7.2). Por lo tanto, este método restringe las células de interés para aquellos dentro de este campo de iluminación. La corrección de fondo se describe aquí no tiene en cuenta la autofluorescencia celular en las longitudes de onda de lectura de la sonda binario. En tal caso, las células no marcadas (sin sonda de transfección) deben ser reflejados en las mismas condiciones y antecedentes resta. A mix de células marcadas y no marcadas se puede usar y las células no marcadas seleccionado para el retorno de la inversión de fondo. Los métodos alternativos que proporcionan para el análisis de células en todo el campo de imagen incluyen el uso de una máscara de sombra, varias regiones de interés del fondo, o muestras idénticas sin células y un protocolo está disponible bajo petición.

Específico para imágenes 3D FRET, respuesta de la sonda es muy sensible a la permeabilidad de hidrogel al analito (Figura 6). Por lo tanto las mismas regiones de hidrogel se comparan a través de los tratamientos experimentales, preferiblemente en un punto de simetría geometría como por ejemplo cerca del centro de andamio, como se usa aquí. Alternativamente, las cámaras de microfluidos / biorreactores pueden emplearse para perfundir rápida y uniformemente el hidrogel con una solución de analito ^45. Una señal de FRET puede no ser detectado (relación señal a ruido es demasiado bajo) cuando la autofluorescencia del hidrogel es demasiado alto; un hidrogel más delgada o una sonda diferente (diferentes fluoróforos) deben ser utilizados.Con respecto a las imágenes en 3D FRET en hidrogeles fotoentrecruzado, se recomienda el uso de la exposición de irradiación de menos y longitudes de onda fuera de los espectros de excitación de los fluoróforos de la sonda. LAP se puede usar con una fuente de luz visible a 405 nm para minimizar aún más el potencial de daño celular ^31,46. Sin embargo, se recomienda el uso de la irradiación LAP con 365 nm, porque esto minimiza la decoloración de la sonda. 365 nm se encuentra en el extremo de cola del espectro de excitación del donante PPC, mientras que 405 nm se encuentra en el pico de excitación. Alternativamente, la expresión sonda se puede dejaron recuperar durante un día. El uso de sondas binarios minimiza los problemas de sensibilidad a las diferencias en los niveles de expresión y en la difusión molecular de los fluoróforos donante y aceptor. sondas no binarias se pueden usar, pero con SE en lugar de formación de imágenes QE y corrección adicional para espectral de purga a través de la excitación y espectros de emisión (ver abajo). Por otra parte, la baja disponibilidad comercial y la complejidad en el diseño de sondas FRETpuede ser un obstáculo. El factor más crítico para el éxito de los experimentos se mantiene la corrección adecuada y el análisis de las señales de fluorescencia.

Un cálculo alternativo de la relación de FRET es utilizado por varias razones adicionales además de la reducción al mínimo de photobleaching. Para las sondas de una sola cadena binarios, la relación frecuente es emisión del aceptor bajo excitación donante (emisión sensibilizada, SE) para la emisión del donador bajo excitación donante (emisión se inactivó, QE), es decir, FRET ratio = SE / QE ^25,47,48. SE / QE es relativa no lineal a los cambios en la eficiencia de FRET ^21,22,47. A saber, la relación tiene una relación exponencial no lineal para inherente eficiencia FRET de la sonda (Ei) ^{(trabajo no publicado Donius, AE, Taboas, JM. (2015)),} con la relación más lineal para Ei menos de aproximadamente 15%. SE / QE también subestimar la fracción de sondas activadas (FAP, es decir, la fracción de sondas analito de unión). Therefore, el análisis de SE / QE requiere una dosis de equilibrio engorroso estudio de respuesta y ajuste de la curva. Afortunadamente, las relaciones de SE o QE a la emisión del aceptor bajo excitación del aceptor (AEM) son lineales con respecto a Ei y la FAP, es decir, las relaciones de FRET SE / Aem y QE / Aem. SE / Aem se utiliza a menudo para sondas binarias y sólo requiere la calibración de punto final (sin actividad de la sonda y la actividad de la sonda completa), pero la señalización celular basal hace esto difícil. Para eliminar la necesidad de calibración de punto final, SE puede ser corregida (CSE) para la superposición espectral de donantes y de excitación del aceptor y de emisión de espectros (espectral derrame) y para el rendimiento cuántico y la sensibilidad espectral (QS) de los fluoróforos de la sonda combinados y microscopio sistema de imagen. La relación SE FRET corregido basado en CSE define la eficiencia de FRET observada de las sondas dentro de cada píxel de una imagen, es decir, E _SE = CSE / Aem. El software comercial y libre está disponible para corregir SE para estos efectos yse remite al lector a la obra de Chen y Periasamy 2006 para una explicación detallada de los métodos ^50. Sin embargo, el cálculo de E _SE requiere captura de tres canales de imagen por punto de tiempo (SE, QE, AEM). Por lo tanto, en este trabajo también empleamos una relación de FRET alternativo E _QE = 1 - QE / CAEM, que requiere la captura de sólo dos canales de imagen (QE y AEM). El cálculo de E _QE de estos canales sólo requiere la corrección de AEM para QS (CAEM = Aem x QS). QS = Dem / AEM se estima fácilmente utilizando dos imágenes de la muestra de uno de calibración, donde Dem es la emisión del donador bajo excitación de los donantes con blanqueada aceptor. El FAP en cualquier instante puede calcularse mediante la comparación de E _SE o E _QE a la Ei de la sonda.

En última instancia, la selección de relación de FRET (E _SE = CSE / AEM vs E = _QE QE / CAEM) debe basarse en la consideración del tipo de sonda y los canales con mejor señal. tanto unapproaches incluyen corrección de ruido de fondo de las imágenes por trama como se describió anteriormente para dar cuenta de los cambios en la autofluorescencia lo largo del tiempo. Ellos asumen ninguna superposición de la luz de excitación AEM en el espectro de excitación Dem, que suele ser el caso debido a sondear la configuración del filtro de diseño y el microscopio. sondas de cadena simple pueden utilizar y selección se basa en la mejor señal de la sonda (luminosidad) para que el ruido de la cámara y de la señal de fondo en SE y canales de alivio cuantitativo. Para la sonda ICUE1 y las condiciones experimentales utilizadas aquí (tipos de células y de hidrogel), SE tiene una señal más fuerte que el QE. Sondas de cadena doble requieren el uso de E _SE debido a la distribución no equimolar de donante y aceptor fluoróforos. Para sondas que disminuyen de FRET a analito como ICUE1, traste eficiencia puede ser "invertido" para presentar un cambio de señalización positiva tras la unión del analito como lo hacemos aquí, con E _SE = 1 - CSE / AEM o E _QE = QE / (AEM x QS).

Análisis de THe FAP es sensible a la corrección adecuada de las relaciones de FRET y para la estimación de la IE. Se puede estimar con la misma muestra de calibración utilizado para QS y un punto final convencional FRET ensayo de eficacia que Ei = 1- (QE / DEM) (imagen QE seguido de aceptor photobleaching y una imagen Dem) ^28, pero hay que tener cuidado para minimizar blanqueo accidental del donante. Se describe una versión modificada en la que se sustituye la estimación del Dem basado en Aem ajustado por QS, es decir, Ei = 1 - (QE / (AEM x QS)). Alternativamente, Ei = CSE / Aem puede ser utilizado. Estimación de la IE en las células vivas requiere que todas las sondas de ser conducidos a la plena FRET. Esto es difícil de lograr en la práctica para las sondas, tales como ICUE1 que disminuyen en FRET tras la unión del analito. Un cálculo in vitro basado en el uso de Ei lisados ​​celulares y analito purificado es lo mejor, pero fuera del alcance de este trabajo. Aquí se recomienda el uso de 2 ', 5'-didesoxiadenosina para disminuir cAMP en las células. Sin embargo, un FAP relativa puede be calculado utilizando una estimación Ei derivada del nivel basal de señalización. Por estas razones, los estudios más a menudo informan de la relación de FRET (como se hace aquí) o una FAP relativo basado en la calibración de punto final, donde la línea de base de señalización antes de añadir agonista es el límite inferior y la señal después de la adición de un segundo agonista que satura de señalización es el superior ligado. Forskolin se utiliza a menudo como un agonista de control para saturar señal de cAMP. Alternativamente, un análogo de cAMP puede ser utilizado como 8-Bromoadenosine 3 ', 5'-monofosfato cíclico. Se recomiendan controles positivos utilizados en la realización de estudios para identificar cambios potenciales en la vía de señalización entre los tratamientos experimentales.

Cálculo de la respuesta promedio de señalización por célula requiere la consideración de varios factores. En primer lugar, la relación media FRET debe calcularse como el promedio de las proporciones en cada píxel dentro de una célula, es decir, (Σ (QE/cAem)) / (número de píxeles), en lugar de la ratio de la QE media y AEM en una célula, es decir, (ΣQE) / (ΣcAem). Aunque este último no requiere una cuidadosa enmascaramiento como ruido de fondo es bajo, subestima gravemente la verdadera razón media de FRET. Sin embargo, las relaciones de píxeles requieren cálculos de punto flotante y el enmascaramiento binaria cuidado del área de la celda para definir el rendimiento de la inversión y evitar la inclusión de relaciones espurias generadas por el ruido de fondo fuera de la célula. Toda la zona de la celda debe ser cuantificada para evitar sesgar los resultados en forma de la célula. puede necesitar el enmascaramiento que redefinirse con el tiempo dependiendo de los cambios en la forma celular y la migración. Alternativamente, ROIs más grande que la célula se puede utilizar si se definen los criterios de exclusión para eliminar proporciones de píxel a partir de señales Aem que caen muy por debajo de los niveles celulares y están cerca de los niveles de fondo y QE. Los métodos de análisis se describe detalladamente los pasos básicos utilizados en este trabajo para el análisis FRET sin software / plugins especializados. fabricantes de microscopios y otros vendedores ofrecen módulo adicionals para su software de microscopio, que apoyan radiométrica automatizada y FRET análisis. Del mismo modo, el software ImageJ dominio público tiene varios plugins disponibles para el análisis de partículas y FRET, como RiFRET. En segundo lugar, la relación de FRET promedio basado en píxeles subestima la verdadera relación media de la estructura celular en 3D porque se utiliza una imagen 2D. Las señales 2D representan y media a lo largo del eje z. Cálculo de la distribución espacial de las relaciones de 3D ​​FRET en las células vivas no es posible sin la formación de imágenes en 3D de alta velocidad (por ejemplo., Utilizando microscopía confocal disco giratorio). Este es un problema tanto para los cultivos 2D y 3D, pero tiene un efecto mayor en 3D como más de la estructura celular existe fuera del plano. Esto es de gran preocupación para las sondas que localizan a las estructuras celulares, tales como la membrana plasmática sonda EPAC1 PM-ICUE. Ver Spiering et al. 2013 para sugerencias para corregir los efectos de espesor celular en cálculos de la relación ^24. Análisis de la distribución de Aem se puede utilizar paradetectar si la sonda se acumula en las regiones del plano de formación de imágenes de células y ajustado. Esto también ayudará a interpretar la distribución espacial de las relaciones de FRET y eliminar resultados espurios, por ejemplo., La identificación de la saturación de la sonda (es decir, una región de baja AEM tendrá baja concentración de sonda y puede presentar saturación de la sonda y alta relación de FRET). En tercer lugar, los diferentes niveles de línea de base FRET pueden indicar una diferencia en la eficacia de la transfección, la sonda de expresión, o la señalización basal entre los grupos experimentales. "El análisis relativo" (Paso 10.1.1) ayuda a eliminar la deriva en la proporción de FRET con el tiempo si está presente. Se facilita la comparación de la magnitud relativa de las respuestas entre muestras, pero impide comparación con el curso de tiempo de respuesta para la muestra de referencia (parcela de control es una línea plana). "Análisis absoluta" (Paso 10.1.2) facilita la comparación de la tasa de respuesta a través de muestras, pero dificulta la comparación de la magnitud de la respuesta, ya que cada línea se escala por un dissimIlar constante. Los estudios a menudo utilizan una regresión lineal sobre la línea de base para corregir la deriva en la relación de FRET con el tiempo.

El método 3D FRET descrito es una forma útil y práctica de fabricar y realizar las imágenes de lapso de tiempo de los teléfonos hidrogeles 3D cargados, que se pueden aplicar a otras sondas y de modalidades de imágenes. Otro sistema de FRET, además de sondas binarios de cadena única requerirá más compleja corrección de señales basado intensidad, como se discutió anteriormente. Alternativamente, las imágenes de vida de fluorescencia de FRET (FLIM-FRET) se puede utilizar para calcular la eficiencia de FRET a través de un cambio en la vida de emisión del donante de la sonda. A diferencia de FRET a base de intensidad, Flim-FRET es insensible al ruido de fondo, espectral derrame, la eficiencia cuántica, y el detector de sensibilidad espectral ^2. Sin embargo, los sistemas de Flim son costosas, complejas y poco común, y funcionan mejor con fluoróforos con caries exponente sola y sin Flim escorrentía ^49. El método descrito también se puede utilizar con more microscopios avanzados (por ejemplo., FRET-TIRF, la anisotropía de fluorescencia, y FRET correlación espectral). La aplicación de este método para imágenes en 3D con confocal de alta velocidad y la microscopía multifotónica facilitará el análisis de la distribución subcelular de la respuesta de señalización e incrementar la exactitud del análisis de señalización. Este método permitirá 3D FRET estudios avanzados de biología celular en microambientes celulares 3D simulado. Como tal, se puede aplicar fácilmente a la farmacología y las necesidades de medicina regenerativa, incluyendo el estudio de señalización intercelular y cribado de la respuesta al fármaco en microtejidos a base de hidrogel de ingeniería.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Polidimetilsiloxano (PDMS) [Sylgard 184 Kit de elastómeros]	Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives)	NC0162601	Reactivos
Dimetacrilato de polietilenglicol (PEGDM)	Preparado según Lin-Gibson con PEG de Sigma Aldrich	95904	Reactivos
3-(trimetoxisilil)propilmetacrilato	Sigma Aldrich	M6514	Reactivos
3- glicidoxipropiltrimetoxisilano	Sigma Aldrich	440167	Reactivos
Dimetil fenilfosfonito	Sigma Aldrich	149470-5g	Reactivos
Cloruro de 2,4,6-trimetilbenzoilo	Reactivos	AC244280100	Fisher Scientific
2-butanona	Fisher Scientific	Reactivos	de AC149670010
Bromuro de litio	Fisher Scientific	AC199871000	Reactivos
Isopropanol	Sigma Aldrich	190764	Reactivos
Sigmacote (reactivo siliconizante)	Sigma Aldrich	SL2	Reactivos
Tolueno	Fisher Scientific	AC36441-0010	Reactivos
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Hyclone	SH3025601	Reactivos
Opti-MEM Medio de suero reducido, sin rojo de fenol (medio libre de fenol y suero)	Life Technologies	11058-021	Reactivos
FuGENE HD Reactivo de transfección (reactivo de transfección)	Promega	E2311	Reactivos
Cellstripper (célula solución de disociación)	Corning	25-056-CI	Reactivos
Factor de crecimiento Reducido Matrigel, libre de fenol	Reactivos	de 356231
de Corning Forskolin	Sigma Aldrich	F6886	Reactivos
Puntas de pipeta (10,200,1,000 μ l)	Fisher Scientific	02-707-474, 02-707-478, 02-707-480	Equipo de laboratorio desechable
Guantes de examen sin polvo	Fisher Scientific	19-149-863B Equipo de	laboratorio desechable
Papel de aluminio	Fisher Scientific	01-213-100	Equipo de laboratorio desechable
Punzón de biopsia (3 mm)	Miltex	3332	Equipo de laboratorio desechable
Cubreobjetos de vidrio	Fisher Scientific	12-544C Equipo de	laboratorio desechable
Cubreobjetos de vidrio prerrevestidos (epoxisilano)	Arrayit	CCSL	Equipo de laboratorio desechable
Portaobjetos de vidrio	Fisher Scientific	12550D	Equipo de laboratorio desechable
Viales estériles (15 ml, 50 ml cónicos)	Fisher Scientific	14-959-70C, 14-959-49A Equipo de	laboratorio desechable
Placa de cultivo celular (6- Equipo	laboratorio desechable		351146
Epifluorescente con platina motorizada	Nikon	MEA53100 (Eclipse TiE Invertida)	Equipo de laboratorio grande/no desechable
Portamuestras ajustable para etapa XY Nikon 77011393			Equipo de laboratorio no desechable
Objetivo 60X (1.3 NA) (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)	Nikon	MRD01605	Equipo de laboratorio no desechable
Fuente de luz CFP/YFP y soportes de filtro de excitación/emisión (fuente de luz y rueda Lambda, sistema de filtro de emisión Lambda)	Nikon (distribuidor de Sutter Instrument)	77016231, 77016088	Equipo de laboratorio no desechable Juego de
filtros CYF/YFP	Nikon (Chroma Technology Corp)	77014928	Equipo de laboratorio no desechable
Cámara (ORCA Flash 4.0 v1)	Nikon (Hamamatsu revendedor)	77054076	Equipos de laboratorio no desechables
NIS-Elements 40.20.02 software de microscopio)	Nikon	MQS31100	Equipos de laboratorio no desechables
Prisma (hoja de cálculo y software de gráficos)	GraphPad Software, Inc	Versión 6	Equipo de laboratorio no desechable
OmniCure S1000 Sistema de lámpara de curado puntual UV con filtro de 365 nm u otra fuente de luz (λ = 365 o 405)	OmniCure	S1000	Equipo de laboratorio grande/no desechable
Pipette Aid	Drummond Scientific Co.	DP-100	Equipo de laboratorio no desechable
Hemacitómetro	Hausser Scientific	Reichert Bright-Line 1475	Equipo de laboratorio no desechable
Cámara de desecación al vacío/desgasificador	Cualquier		equipo de laboratorio grande/no desechable Campana de
cultivo de tejidos	Cualquier		equipo de laboratorio grande / no desechable
Campana de gases químicos	Cualquier		equipo de laboratorio grande/no desechable
Horno	Cualquier		equipo de laboratorio grande/no desechable
Espátula	Cualquier		equipo de laboratorio no desechable
Vaso de precipitados	Cualquier		equipo de laboratorio no desechable
Incubadora	Cualquier		equipo de laboratorio grande/no desechable