Artículo de método

El análisis fenotípico y funcional de las células reguladoras T activadas Aislado de la coriomeningitis linfocítica crónica por el virus ratones infectados

DOI:

10.3791/54138

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22 de junio de 2016

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1Department of Biochemistry, College of Life Science & Biotechnology, Yonsei University

En este artículo

Resumen

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Aquí, describimos un protocolo para analizar el fenotipo de células T reguladoras (Treg) aisladas de ratones infectados por el virus de la coriomeningitis linfocítica crónica e ingenua. Además, proporcionamos un proceso para evaluar la actividad supresora de las células Treg.

Resumen

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Células reguladoras T (T reg), que expresan Foxp3 como un factor de transcripción, son subconjuntos de células T CD4 +. Células T reg desempeñan papeles cruciales en la tolerancia inmune y el mantenimiento de la homeostasis mediante la regulación de la respuesta inmune. La función principal de las células T reg es la de suprimir la proliferación de células T efectoras T (FEP) y la producción de citoquinas tales como IFN-γ, TNF-α e IL-2. Se ha demostrado que la capacidad de las células T reg 'para inhibir la función de las células T eff es mayor durante la infección por patógenos persistente y el desarrollo del cáncer. Para aclarar la función de las células T reg en condiciones de reposo o inflamadas, una variedad de ensayos de supresión in vitro utilizando células de ratón o de reg T humanas se han ideado. El objetivo principal de este estudio es desarrollar un método para comparar las diferencias en el fenotipo y la función supresora de descanso entre y reg T activadasCélulas. Para aislar reg células T activadas, los ratones fueron infectados con el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) clon 13 (CL13), una cepa crónica de LCMV. Células T reg aisladas del bazo de ratones infectados por LCMV CL13 exhiben tanto el fenotipo activado y actividad supresora mejorada en comparación con las células en reposo T reg aisladas de ratones no tratados previamente. A continuación, se describe el protocolo básico para el análisis ex vivo fenotipo de distinguir reg células T activadas de descansar células T reg. Además, se describe un protocolo para la medición de la actividad supresora de las células T reg totalmente activadas.

Introducción

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Células T reguladoras (Treg) expresan caja forkhead P3 (Foxp3) como un factor de transcripción para su desarrollo y función 1. Además, las células T reg expresan varias otras moléculas tales como CD25 2, el gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3) 3, inducida por glucocorticoides factor de necrosis tumoral receptor 4, y linfocitos T citotóxicos asociada a la proteína 4 (CTLA-4) 5 en su superficie o región intracelular. Durante la infección crónica con diversos tipos de agentes patógenos tales como virus, bacterias 6,7 8,9, y parásitos 10-12, o en el curso de....

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Protocolo

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En este estudio, los ratones se mantuvieron en una instalación específica libre de patógenos del Centro de Investigación de Animales de Laboratorio de la Universidad de Yonsei de Yonsei. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de Corea Administración de Alimentos y Drogas utilizando los protocolos aprobados por el Comité Internacional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Investigación de Animales de Laboratorio de Yonsei en la Universidad de Yonsei.

1. Preparación de soluciones

  1. Preparar 2% de medio RPMI diluyendo suero bovino fetal (FBS) al 2% y penicilina-estreptomicina al 1% en R....

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Resultados

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Hemos generado ratones con infección por el virus persistente mediante la inyección de ellos con 2 x 10 6 pfu de LCMV CL13 por vía intravenosa. Para investigar los cambios fenotípicos en las células T reg y las células T durante la infección conv virus crónica, linfocitos esplénicos obtenidos de ratones no tratados previamente y infectadas se tiñeron con diversos anticuerpos y se analizaron por citometría de flujo. A los 16 d PI, PD-1 se regula.......

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Discusión

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Aunque existe sólo un pequeño número de células T reg en ratones y seres humanos, es importante para entender su función ya que desempeñan un papel crucial en la regulación de la respuesta inmune y el mantenimiento de la tolerancia inmune. El número y supresores funciones de T reg células aumenta durante una infección por el virus crónica 15-20, así como la progresión del cáncer 13,14. Esto es probablemente debido a la estimulación de antígeno continuado. Para evaluar la T

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Divulgaciones

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S.-J.H. tiene una patente y recibe regalías de patentes relacionadas con la vía PD-1. Los otros autores no tienen conflictos de intereses financieros.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación en Ciencias Básicas a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de Educación (2015R1A6A3A01020610 a HJP) y una subvención del Proyecto Coreano de Investigación y Desarrollo de Tecnología de la Salud, Ministerio de Salud, Bienestar y Asuntos Familiares, República de Corea (HI15C0493 a SJH).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
FITC Rat Anti-Mouse CD4RM4-5BD Biosciences553047
Cytofix/CytopermBD Biosciences554714
Placas de cultivo de tejidos con fondo en U BDBiosciences 353077
TampónBD Biosciences554655
FITC Rat Anti-Mouse CD257D4BD Biosciences553072
Filtro de células, 70 mmBD Biosciences352350
Filtro de células, 40 mmBD Biosciences352340
Violeta Brillante 421 Anti-ratón CD279 (PD-1)29F.1A12BioLegend135217
Violeta Brillante 605 Anti-Ratón CD4RM4-5Biolegend100547
APC Anti-Ratón/Rata Foxp3 FJK-16seBioscience17-5773
Foxp3/Conjunto de tampones de tinción de factor de transcripcióneBioscience00-5223
GE Life SciencesSH30256
ACK TampónGibcoA10492-01
L-glutamina, soluciónGibco 25030
Penicilina-estreptomicina, 10.000 U/mlGibco 10378-016
tinción de células muertas en infrarrojo cercano LIVE/DEADtechnologiesL-34975
CD8a+ Kit de aislamiento de células T, ratónMiltenyibiotec130-104-075
CD4+ CD25+ Kit de aislamiento de células T reglamentarias, ratónMiltenyibiotec130-091-041
MACS Columnas de separación, columnasLDMiltenyibiotec130-042-901
MACS Columnas de separación, columnasMiltenyibiotec130-042-401
EDTA, 0,5 m (pH 8,0)PromegaV4231
2-MercaptoethanolSigma Life ScienceM7522
SueroThermo Fisher ScientificSH30919.03
CellTrace Kitde proliferación celular violetaCitómetro
BD Canto IIBD Biosciences
de fijación PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a 53-6.7 eBiosicence 45-0081 Ratón IFN-gamma Platinum ELISA eBiosicence BMS606 RPMI 1640 GE Ciencias de la Vida SH30027 PBS (1x) de lisado de 200 mM Kit de Life LS fetal bovino de flujo Thermo Fisher Scientific C34557Flowjo TreeStar Hematocytomer Marienfeld superior

Referencias

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  1. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  2. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M.

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