Desarrollo de un Modelo Organotípicos multicelular tridimensional de la mucosa intestinal humanas cultivadas en condiciones de microgravedad

Summary

Las células que crecen en un entorno tridimensional (3-D) representan una mejora marcada sobre el cultivo de células en entornos 2-D (por ejemplo, frascos o platos). Aquí se describe el desarrollo de un modelo organotípico 3-D multicelular de la mucosa intestinal humana cultivadas en microgravedad proporcionada por la rotación de la pared de los vasos biorreactores (RWV).

Abstract

Dado que las células que crecen en un entorno tridimensional (3-D) tienen el potencial de salvar muchas lagunas de cultivo celular en ambientes 2-D (por ejemplo., Frascos o platos). De hecho, se reconoce ampliamente que las células cultivadas en frascos o platos tienden a DE-diferenciarse y perder características especializadas de los tejidos de los que se derivaron. Actualmente, existen principalmente dos tipos de sistemas de cultivo de 3-D, donde las células se sembraron en andamios que imitan la matriz nativa extracelular (ECM): (a) modelos estáticos y modelos (b) utilizando biorreactores. El primer gran avance fueron los modelos estáticos en 3-D. modelos en 3-D utilizando biorreactores como la pared de los vasos giratorio (RWV) biorreactores son un desarrollo más reciente. El concepto original de los biorreactores RWV fue desarrollado en el Centro Espacial Johnson de la NASA en la década de 1990 y se cree que superar las limitaciones de los modelos estáticos, tales como el desarrollo de hipoxia, núcleos necróticos. Los biorreactores RWV podrían eludir THes problema proporcionando la dinámica de fluidos que permiten la difusión eficiente de los nutrientes y el oxígeno. Estos biorreactores constan de una base rotador que sirve para soportar y rotar dos formatos diferentes de recipientes de cultivo que se diferencian por su tipo de fuente de aireación: (1) Slow giro Los buques laterales (STLVs) con un oxigenador de co-axial en el centro, o (2 ) Los buques de alta Relación de aspecto (HARVs) con la oxigenación a través de una membrana de transferencia de gas de caucho de silicona plana. Estos recipientes permiten la transferencia de gas eficiente, evitando la formación de burbujas y la consiguiente turbulencia. Estas condiciones resultan en el flujo laminar y la fuerza de corte mínima que los modelos de gravedad reducida (microgravedad) en el interior del recipiente de cultivo. Aquí se describe el desarrollo de un modelo organotípico 3-D multicelular de la mucosa intestinal humana compuesta de una línea de células epiteliales intestinal y linfocitos humanos primarios, células endoteliales y fibroblastos cultivadas en microgravedad proporcionada por el biorreactor RWV. </ P>

Introduction

El primer gran avance en la construcción de un modelo 3-D se informó a principios de la década de 1980 cuando los científicos empezaron a investigar los diferentes tipos de andamio (por ejemplo., Laminina, colágeno tipo I, colágeno IV y fibronectina) y cócteles de factores de crecimiento para mejorar célula a célula y ECM interacciones de modelos en 3-D "estáticos" ^1-7. Desde entonces, el principal problema de estos modelos ha sido limitaciones en la transferencia de nutrientes y oxígeno dentro de las construcciones medianas y tejidos ^8. En contraste con las células en el entorno in vivo que recibe un flujo constante de nutrien....

Protocol

Declaración de la ética: Todas las muestras de sangre se obtuvieron de voluntarios que participaron en número de protocolo HP-00040025-1. La Universidad de Maryland Junta de Revisión Institucional aprobado este protocolo y autoriza la recogida de muestras de sangre de voluntarios sanos para los estudios incluidos en este manuscrito. El propósito de este estudio fue explicado a los voluntarios, y todos los voluntarios dieron su, firmado el consentimiento antes de la extracción de sangre.

Nota: Véase la Tabla 1 para la preparación suplemento de medio. Véase la Tabla 2 para la preparación de los medios de cultivo 3-D.

Results

Anteriormente hemos diseñado un modelo organotípico 3-D multicelular de la mucosa intestinal humana compuesta de una línea de células epiteliales intestinal y linfocitos humanos primarios, células endoteliales y fibroblastos cultivados en condiciones de microgravedad ²⁴ (Figura 1). Los fibroblastos y las células endoteliales fueron incorporados en una matriz de colágeno I enriquecido con proteínas de la membrana basal intestino adicional ⁴⁵ (es .......

Discussion

En este manuscrito, se describe el desarrollo de un modelo de bioingeniería de la mucosa intestinal humana compuesta de tipos de células incluyendo linfocitos múltiplos primarios humanos, fibroblastos y células endoteliales, así como líneas de células epiteliales intestinales ^24. En este modelo 3-D, las células se cultivaron dentro de una matriz extracelular rica en colágeno en condiciones de microgravedad ^24.

Como se ha descrito anteriormente, las características princ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biorreactor de recipiente de pared giratoria independiente (RWV) con rotor cuádruple;	Synthecon	RCCs-4DQ	Para hasta 4 embarcaciones. También están disponibles modelos con más o menos embarcaciones.
Caja desechable de 50 ml de recipiente	Synthecon	D-405	con 4 recipientes
de células epiteliales HCT-8	ATCC	CCL-244
CCD-18Co Fibroblastos	ATCC	CRL-1459
Células endoteliales de la vena umbilical humana	ATCC	CRL-1730	HUVEC
Factor de crecimiento de fibroblastos-Básico	Sigma	F0291	bFGF
Factor de células madre	Sigma	S7901	SCF
Factor de crecimiento de hepatocitos	Sigma	H1404	HGF
Endotelina 3	Sigma	E9137
Laminina	Sigma	L2020	Aislado de ratón Engelbreth-Holm-Swarm
tumor Vascular Endotelial Factor de Crecimiento	Sigma	V7259	VEGF
Factor Inhibidor de la Leucemia	Santa Cruz	sc-4377	(LIF
Adenina	Sigma	A2786
Insulina	Sigma	I-6634
3,3',5-triyodo-L-tironina	Sigma	T-6397	T3
Toxina del Cólera	Sigma	C-8052
Fibronectina	BD	354008	Aislada de plasma humano
apo-Transferrina	Sigma	T-1147
Heparina	Sigma	H3149
Sulfato de heparán   proteoglicano	Sigma	H4777	Aislado de la membrana basal de un ratón  Engelbreth-Holm-Swarm
tumor Colágeno IV	Sigma	C5533	Aislado de placenta humana
Suero bovino fetal inactivado por calor	Invitrogen	10437-028
D-MEM, polvo	Invitrogen	12800-017
10% formalina– PBS	Fisher Scientific	SF100-4
Colágeno bovino tipo I	Invitrogen	A1064401
Tripsina-EDTA	Fisher Scientific	MT25-052-CI
Piruvato de sodio	Invitrogen	11360-070
Gentamicina	Invitrogen	15750-060
Penicilina/estreptomicina	Invitrogen	15140-122
L-Glutamina	Invitrogen	25030-081
Hepes	Invitrogen	15630-080
Ham's F-12	Invitrogen	11765-054
Basal Medio Eagle	Invitrogen	21010-046	BME
RPMI-1640	Invitrogen	11875-093
Endotelial Medio basal	Lonza	CC-3156	EBM-2
Suplemento de crecimiento de células endoteliales	Millipore	02-102	ECGS