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Artículo de método

Desarrollo de un Modelo Organotípicos multicelular tridimensional de la mucosa intestinal humanas cultivadas en condiciones de microgravedad

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DOI:

10.3791/54148

⸱

25 de julio de 2016

 ,  , 
1Center for Vaccine Development, Department of Pediatrics, University of Maryland School of Medicine, 2Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital for Children

En este artículo

Resumen

Las células que crecen en un entorno tridimensional (3-D) representan una mejora marcada sobre el cultivo de células en entornos 2-D (por ejemplo, frascos o platos). Aquí se describe el desarrollo de un modelo organotípico 3-D multicelular de la mucosa intestinal humana cultivadas en microgravedad proporcionada por la rotación de la pared de los vasos biorreactores (RWV).

Resumen

Dado que las células que crecen en un entorno tridimensional (3-D) tienen el potencial de salvar muchas lagunas de cultivo celular en ambientes 2-D (por ejemplo., Frascos o platos). De hecho, se reconoce ampliamente que las células cultivadas en frascos o platos tienden a DE-diferenciarse y perder características especializadas de los tejidos de los que se derivaron. Actualmente, existen principalmente dos tipos de sistemas de cultivo de 3-D, donde las células se sembraron en andamios que imitan la matriz nativa extracelular (ECM): (a) modelos estáticos y modelos (b) utilizando biorreactores. El primer gran avance fueron los modelos estáticos en 3-D. modelos en 3-D utilizando biorreactores como la pared de los vasos giratorio (RWV) biorreactores son un desarrollo más reciente. El concepto original de los biorreactores RWV fue desarrollado en el Centro Espacial Johnson de la NASA en la década de 1990 y se cree que superar las limitaciones de los modelos estáticos, tales como el desarrollo de hipoxia, núcleos necróticos. Los biorreactores RWV podrían eludir THes problema proporcionando la dinámica de fluidos que permiten la difusión eficiente de los nutrientes y el oxígeno. Estos biorreactores constan de una base rotador que sirve para soportar y rotar dos formatos diferentes de recipientes de cultivo que se diferencian por su tipo de fuente de aireación: (1) Slow giro Los buques laterales (STLVs) con un oxigenador de co-axial en el centro, o (2 ) Los buques de alta Relación de aspecto (HARVs) con la oxigenación a través de una membrana de transferencia de gas de caucho de silicona plana. Estos recipientes permiten la transferencia de gas eficiente, evitando la formación de burbujas y la consiguiente turbulencia. Estas condiciones resultan en el flujo laminar y la fuerza de corte mínima que los modelos de gravedad reducida (microgravedad) en el interior del recipiente de cultivo. Aquí se describe el desarrollo de un modelo organotípico 3-D multicelular de la mucosa intestinal humana compuesta de una línea de células epiteliales intestinal y linfocitos humanos primarios, células endoteliales y fibroblastos cultivadas en microgravedad proporcionada por el biorreactor RWV. </ P>

Introducción

El primer gran avance en la construcción de un modelo 3-D se informó a principios de la década de 1980 cuando los científicos empezaron a investigar los diferentes tipos de andamio (por ejemplo., Laminina, colágeno tipo I, colágeno IV y fibronectina) y cócteles de factores de crecimiento para mejorar célula a célula y ECM interacciones de modelos en 3-D "estáticos" 1-7. Desde entonces, el principal problema de estos modelos ha sido limitaciones en la transferencia de nutrientes y oxígeno dentro de las construcciones medianas y tejidos 8. En contraste con las células en el entorno in vivo que recibe un flujo constante de nutrientes y el oxígeno de los alrededores de las redes de los vasos sanguíneos, la naturaleza estática de estos modelos dificulta la distribución efectiva de ellos a las células. Por ejemplo, los agregados de células generadas en modelos estáticos in vitro que superan unos pocos milímetros de tamaño invariablemente desarrollar hipoxia, 9 núcleos necróticos. Los biorreactores RWV podrían eludir este problemaproporcionando la dinámica de fluidos que permiten la difusión eficiente de los nutrientes y 10-12 oxígeno. Sin embargo, hasta la fecha, el trabajo usando biorreactores RWV se han limitado a la inclusión de uno o dos tipos de células 13-17. Además, en lugar de una orientación espacial similar a tejidos nativos, las células forman agregados celulares. La razón principal de estas limitaciones ha sido la falta de un andamio capaz de incorporar las células de una manera integrada. Los andamios utilizados en los biorreactores RWV hasta la fecha consisten, con pocas excepciones, 16-18, sobre todo de microperlas sintéticas, cilindros tubulares o pequeñas hojas 13-15,19-23. Estos son materiales rígidos cuya composición y de flexibilidad no puede ser manipulado, y para el cual las células están unidas a su superficie. Por lo tanto, es poco probable que estos modelos proporcionar un sistema en el que evaluar, de una manera integrada, los diversos componentes celulares tales como las células del estroma (por ejemplo., Fibroblastos, células inmunes y endoteliales) que should dispersarse dentro del andamiaje para imitar el tejido humano.

Aquí se describe el desarrollo de un modelo organotípico 3-D multicelular de la mucosa intestinal humana compuesta de una línea de células epiteliales intestinal y linfocitos humanos primarios, células endoteliales, fibroblastos y 24. Estas células se cultivaron en condiciones de microgravedad proporcionar por el biorreactor RWV 13,25-30. En nuestro modelo de 3-D, el ECM posee muchas propiedades distintas, tales como una osmolalidad similar al medio de cultivo (por ejemplo., Las restricciones de difusión despreciables durante el cultivo) y la capacidad de incorporar las células y otras proteínas de la matriz extracelular pertinentes, así como la rigidez apropiado para ser utilizado en los biorreactores de 24. Los sistemas biológicos son muy complejas, y en los últimos años, ha habido un cambio en el foco de la investigación de la mucosa hacia el examen de las interacciones de las células con su entorno en lugar de estudiar en isolationorte. En particular, la importancia de las interacciones célula-célula para influir en la supervivencia celular y la diferenciación intestinal está bien documentada 31-34. En concreto, la comunicación entre las células epiteliales y su nicho tiene una profunda influencia en la expansión de las células epiteliales y la diferenciación 35. De hecho, es ampliamente aceptado que no sólo de célula a célula, pero también las interacciones célula-ECM son críticos para el mantenimiento y la diferenciación de las células epiteliales en modelos de cultivo de 3-D. Estudios previos han demostrado que las proteínas ECM intestino tales como el colágeno I 24,36,37, laminina y fibronectina 38 39 son instrumentales para influir en las células epiteliales intestinales para adquirir la orientación espacial similar a la mucosa nativo. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas tecnologías, como nuestro modelo en 3-D 24, que puede imitar es necesaria la diversidad fenotípica del intestino si los investigadores tienen la intención de recrear la arquitectura celular y estructural complejay la función del microambiente intestino. Estos modelos representan una herramienta importante en el desarrollo y evaluación de nuevos fármacos orales y candidatos vacunales.

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Protocolo

Declaración de la ética: Todas las muestras de sangre se obtuvieron de voluntarios que participaron en número de protocolo HP-00040025-1. La Universidad de Maryland Junta de Revisión Institucional aprobado este protocolo y autoriza la recogida de muestras de sangre de voluntarios sanos para los estudios incluidos en este manuscrito. El propósito de este estudio fue explicado a los voluntarios, y todos los voluntarios dieron su, firmado el consentimiento antes de la extracción de sangre.

Nota: Véase la Tabla 1 para la preparación suplemento de medio. Véase la Tabla 2 para la preparación de los medios de cultivo 3-D.

1. Preparación de recipientes de cultivo

  1. Desenroscar el tapón del orificio de llenado del recipiente de 50 ml-y rellenar con 50 ml de medio de cultivo estéril (por ejemplo, RPMI.). Realizar todos los procedimientos en condiciones estériles en una campana laminar.
  2. Coloque la tapa y limpie cualquier medio derramado sobre cualquier superficie con etanol al 70%.
  3. Deje que la embarcación incubcomió durante al menos 15 minutos a O / N a temperatura ambiente.
  4. Utilice el puerto de llenado para desechar el medio de cultivo y añadir 30 ml de medio de cultivo en 3-D.
  5. Limpie cualquier medio derramado sobre cualquier superficie con etanol al 70%.

2. Preparación de las células

  1. Línea celular epitelial humana (HCT-8) de 24,40.
    1. células de cultivo en RPMI suplementado con 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 50 mg / ml de gentamicina, 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 10 mM tampón y suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (FBS ) (suplemento 1). Al 70% de confluencia, las células divididas en una proporción de 1: 5.
  2. Fibroblastos de colon humano (células CCD-18Co) 24,41.
    1. Células de cultivo en medio de Basal de Eagle enriquecido con suplemento 1 en confluencia, las células divididas en una proporción de 1: 3..
  3. Células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) 24,42.
    1. Células de cultivo en medio basal endotelial (EBM) medio enriquecido con 100 mg / ml de heparina, 3 mg / ml de suplemento de crecimiento de células endoteliales (ECG), y complementan 1 Al 70% de confluencia, las células divididas en una proporción de 1:. 2.
  4. Los linfocitos / monocitos
    1. Aislar las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la sangre por centrifugación en gradiente de densidad utilizando técnicas estándar 43.
      1. Brevemente, utilizando una pipeta ml-10, añadir cuidadosamente 30 ml de sangre diluida (1: 1 de sangre: Tampón fosfato salino (PBS)) en un tubo de 50 ml que contiene-cónica 10 ml de medio de centrifugación por densidad. Después de la etapa de centrifugación, los linfocitos y monocitos residirán en la capa de "blanco" entre los medios de centrifugación de densidad y capas de plasma.
      2. Recoger la capa blanca con una pipeta de transferencia. Evitar la contaminación de granulocitos mediante la limitación de la colección de los medios de densidad de centrifugación. Después de lavar 43, uSE PBMC criopreservados como está o en N2 líquido.
        Nota: Es importante destacar que PBMC consiste en gran parte de los linfocitos y monocitos, con una pequeña proporción de las células dendríticas y otros tipos celulares.
  5. Crecer todas las células bajo condiciones de cultivo estándar a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5%.

3. Preparación de las células embebidas-colágeno

  1. Determinar el número de inserciones necesario en base a los números de las condiciones experimentales para ser puesta en marcha. Coloque el número apropiado de insertos en los pocillos de una placa de 6 pocillos.
  2. Preparar una suspensión de HUVEC y fibroblastos:
    1. Lavar los matraces dos veces en PBS y separar las células utilizando tripsina, 0,25% (1x) con etilendiaminotetraacetato 0,05% de tripsina-tetrasódico (Tripsina-EDTA). Añadir suficiente solución de tripsina para cubrir la totalidad de la superficie de cultivo celular. El desprendimiento ocurre generalmente dentro de 5 a 15 min
    2. Recogercélulas separadas en un 50 ml-tubo que contiene 30 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) -30% de SFB medio.
    3. Centrifugar el tubo a 500 xg durante 10 min.
    4. Resuspender las células en 30 ml de DMEM-30 medio FBS%.
    5. Contar el número total de células viables por dilución de 20 l de las células resuspendidas con 20 l de colorante azul de tripano. Cargar el hemocitómetro con la mezcla de células. CMSP viables serán de color blanco claro; inviable PBMC adquirirá el colorante y se convierten en azul.
      1. Resuspender cada tipo de células en DMEM-30 medio FBS% a una concentración de 5 - 8 x 10 7 células ml - 1.
  3. Preparar geles de colágeno que contienen células
    Nota: Cada recipiente requerirá la preparación de ~ 5 ml de gel de colágeno que contiene células.
    1. En un tubo de 50 ml-cónica preparar la mezcla de colágeno mediante la adición de 1 x medios DMEM, suplementado con 50 g / ml de gentamicina, 2 mM L-glutamina y 10% de calor-inactivated FBS más 3 mg / ml de colágeno bovino-I, 10 g / laminina ml, 40 mg / ml de colágeno IV, 10 mg / ml de fibronectina, 2 mg / ml de proteoglicanos de sulfato de heparina y NaOH 15 mM (para alcanzar el pH fisiológico).
    2. Cerrar el tubo y mezclar invirtiendo varias veces hasta que la mezcla esté completamente homogeneizada. Evitar la formación de burbujas.
      IMPORTANTE: Mantener la mezcla en hielo para evitar la gelificación.
      1. Paso crítico: Si la mezcla se desarrolla una apariencia ácida (color amarillento), añadir unas gotas de NaOH 1 N estéril para neutralizar la mezcla.
    3. Añadir HUVEC concentrado y fibroblastos a una densidad de 1,0 - 1,2 y 1,5 - 2,0 x 10 6 células / ml, respectivamente, a la mezcla enriquecida en colágeno (descrito anteriormente). Cierre los tubos y mezclar invirtiendo varias veces hasta que la mezcla esté completamente homogeneizada. Evitar la formación de burbujas. IMPORTANTE: Mantener la mezcla en hielo para evitar la gelificación.
    4. Añadir 4 - 5 ml del colágeno que contiene célulasgel para cada inserción, cargado previamente en un pozo de la placa 6, y se deja gelificar en la campana con poco o ningún movimiento durante 1 hora.
    5. Después de 1 hora, la transferencia de la placa de 6 pocillos a un 37 ° C, 5% CO2 durante 1 - 2 horas adicionales.
    6. Devolver la placa de 6 pocillos a la campana, y con la ayuda de unas pinzas esterilizadas y el bisturí asépticamente de corte de la membrana de la pieza de inserción de extraer el gel que contiene células de la membrana. Cortar el gel individual en cuadrados pequeños (~ 5 x 5 mm).
    7. Añadir los pequeños cuadrados que contienen células en un HARV de 50 ml usando el puerto de llenado.
  4. Preparar una suspensión de 8-HCT células epiteliales:
    1. Lavar los matraces dos veces en PBS y separar las células utilizando tripsina, 0,25% (1x) con el tratamiento con tripsina-EDTA. Añadir suficiente solución de tripsina para cubrir la totalidad de la superficie de cultivo celular. El desprendimiento ocurre generalmente dentro de 10 a 15 min.
    2. Recoger las células desprendidas en 30 ml de DMEM-FBS al 30% medio.
    3. CentrifUGE DMEM-30% de medio FBS que contiene tubo a 500 xg durante 10 min.
    4. Resuspender las células en 30 ml de DMEM-30 medio FBS%.
    5. Contar el número total de células viables como se describe en 3.2.5.
    6. Resuspender las HCT-8 células epiteliales en DMEM-30 medio FBS% a una concentración de 10 7 células ml - 1.
    7. Añadir 1 ml de los HCT-8 células epiteliales concentradas en el 50-ml HARV usando el puerto de llenado.
  5. Al utilizar el puerto de llenado, se añade medio de cultivo adicional 3-D hasta que el recipiente está casi llena (~ 20 ml).
  6. Coloque la tapa y limpiar el borde del orificio de llenado con un 70% de etanol.
  7. Colocar una jeringa en cada puerto de jeringa de la RWV: lugar un 5 ml-jeringa que contiene 3 - 4 ml de medio de cultivo 3-D en un puerto y una jeringa de 5 ml vacía en el otro puerto.
  8. Eliminar las burbujas visibles, tirando en la jeringa vacía mientras que aproximadamente el mismo volumen de medio se inyecta a través del otro puerto de jeringa.
  9. Coloque los vesseles en el biorreactor, conecte la alimentación y ajuste la velocidad de alrededor de 13 a 14 revoluciones por minuto.
    Nota: El paso crítico: puede necesitar velocidad de rotación para ajustar un par de veces durante un experimento para mantener las células en órbita dentro del recipiente, evitando así el contacto con las paredes del recipiente.
  10. Células de cultivo a 37 ° C, 5% de CO 2 en condiciones de microgravedad, proporcionados por el biorreactor RWV.
  11. Cambio medio de cultivo cada 3 - 4 días mediante la sustitución de aproximadamente 30 ml con medio de cultivo fresco 3-D.
  12. Después de 4 días (± 1 día), retire los buques del biorreactor y añadir linfocitos / monocitos a los vasos (2 x 10 7 / recipiente).
  13. Coloque los vasos de nuevo en el biorreactor a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 5 días adicionales (± 1 día).
  14. Después de los 5 días adicionales (día 9 del cultivo), añadir linfocitos / monocitos a los vasos (2 x 10 7 / recipiente) y seguir las culturas de hasta 12 días adicionales.
  15. Cambio medio de cultivo cada 3 - 4 días mediante la sustitución de aproximadamente 30 ml con medio de cultivo fresco 3-D.

4. Recolección de 3-D Los cultivos para Histología

  1. Con la ayuda de una pipeta de transferencia de la cosecha cada fragmento de gel pequeño, que ahora se llama "construir", en una placa de seis pocillos que contenía 10 ml de tampón de formalina 10%. Dejar durante 3 horas a temperatura ambiente o por 12 - 16 horas a 4 ° C.
  2. Preparar el procesamiento de tejidos y cassettes de inclusión mediante el etiquetado y la adición de dos piezas de almohadillas de espuma para biopsia en cada casete.
  3. Sumergir los casetes en tampón de formalina al 10%.
  4. Con la ayuda de fórceps colocar los constructos fijas entre las dos almohadillas de espuma.
  5. Sumergir los casetes en tampón de formalina al 10%.
  6. Continúe con los procedimientos estándar para la inserción, el seccionamiento y tinción 44.

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Resultados

Anteriormente hemos diseñado un modelo organotípico 3-D multicelular de la mucosa intestinal humana compuesta de una línea de células epiteliales intestinal y linfocitos humanos primarios, células endoteliales y fibroblastos cultivados en condiciones de microgravedad 24 (Figura 1). Los fibroblastos y las células endoteliales fueron incorporados en una matriz de colágeno I enriquecido con proteínas de la membrana basal intestino adicional 45

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Discusión

En este manuscrito, se describe el desarrollo de un modelo de bioingeniería de la mucosa intestinal humana compuesta de tipos de células incluyendo linfocitos múltiplos primarios humanos, fibroblastos y células endoteliales, así como líneas de células epiteliales intestinales 24. En este modelo 3-D, las células se cultivaron dentro de una matriz extracelular rica en colágeno en condiciones de microgravedad 24.

Como se ha descrito anteriormente, las características princ...

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Divulgaciones

Los autores declaran que se ha presentado una solicitud de patente no provisional de EE. UU. en la Oficina de Patentes y Marcas de EE. UU. (Número: 13/360,539).

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado, en parte, por las subvenciones federales de investigación R01 AI036525 y U19 de NIAID, NIH, DHHS y U19 AI082655 (CCHI) a MBS y por la subvención de los NIH DK048373 a AF. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas o los Institutos Nacionales de Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Biorreactor de recipiente de pared giratoria independiente (RWV) con rotor cuádruple;SyntheconRCCs-4DQPara hasta 4 embarcaciones. También están disponibles modelos con más o menos embarcaciones.
Caja desechable de 50 ml de recipienteSyntheconD-405con 4 recipientes
de células epiteliales HCT-8 ATCCCCL-244
CCD-18Co Fibroblastos ATCCCRL-1459
Células endoteliales de la vena umbilical humanaATCCCRL-1730HUVEC
Factor de crecimiento de fibroblastos-Básico SigmaF0291bFGF
Factor de células madre SigmaS7901SCF
Factor de crecimiento de hepatocitos SigmaH1404HGF
Endotelina 3SigmaE9137
LamininaSigmaL2020Aislado de ratón Engelbreth-Holm-Swarm
tumor Vascular Endotelial Factor de Crecimiento  SigmaV7259VEGF
Factor Inhibidor de la Leucemia Santa Cruzsc-4377(LIF
AdeninaSigmaA2786
InsulinaSigmaI-6634
3,3',5-triyodo-L-tironina SigmaT-6397T3
Toxina del CóleraSigmaC-8052
FibronectinaBD354008Aislada de plasma humano
apo-TransferrinaSigmaT-1147
HeparinaSigmaH3149
Sulfato de heparán   proteoglicanoSigmaH4777Aislado de la membrana basal de un ratón  Engelbreth-Holm-Swarm
tumor Colágeno IVSigmaC5533Aislado de placenta humana
Suero bovino fetal inactivado por calor Invitrogen10437-028
D-MEM, polvoInvitrogen12800-017
10% formalina– PBS Fisher ScientificSF100-4
Colágeno bovino tipo I  InvitrogenA1064401
Tripsina-EDTA Fisher ScientificMT25-052-CI
Piruvato de sodioInvitrogen11360-070
Gentamicina Invitrogen15750-060
Penicilina/estreptomicina Invitrogen15140-122
L-GlutaminaInvitrogen25030-081
HepesInvitrogen15630-080
Ham's F-12Invitrogen11765-054
Basal Medio EagleInvitrogen21010-046BME
RPMI-1640Invitrogen11875-093
Endotelial Medio basalLonzaCC-3156EBM-2
Suplemento de crecimiento de células endotelialesMillipore02-102ECGS

Referencias

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