Intracerebroventricular y por inyección intravascular de partículas víricas y fluorescentes microperlas en el cerebro neonatal

Resumen

Aquí, describimos un método simple de inyección intracerebroventricular e intravascular de partículas virales o microperlas fluorescentes en el cerebro de ratón neonatal. El patrón de localización del virus y las nanopartículas podría detectarse mediante evaluación microscópica o mediante hibridación in situ.

Resumen

En el estudio de la patogénesis de la encefalitis viral, el método de infección es crítica. La primera de las dos principales vías de infección en el cerebro es la vía hematógena, que implica la infección de las células endoteliales y pericitos del cerebro. La segunda es la vía intracerebroventricular (ICV). Una vez dentro del sistema nervioso central (CNS), los virus pueden propagarse al espacio subaracnoideo, meninges, y el plexo coroideo a través del líquido cefalorraquídeo. En modelos experimentales, las etapas más tempranas de la distribución viral SNC no están bien caracterizadas, y no está claro si están infectadas inicialmente sólo ciertas células. Aquí, hemos analizado la distribución de partículas de citomegalovirus (CMV) durante la fase aguda de la infección, llamada viremia primaria, después de la inyección ICV o intravascular (IV) en el cerebro del ratón neonatal. En el modelo de inyección ICV, se inyectaron 5 l de CMV murino (MCMV) o microperlas fluorescentes en el ventrículo lateral en el midpoint entre el oído y el ojo usando una jeringa de 10 l con una aguja de 27 G. En el modelo de la inyección IV, se usó una jeringa de 1 ml con una aguja de 35 G. Un transiluminador se utiliza para visualizar la vena superficial temporal (facial) del ratón neonatal. Infundido 50 l de MCMV o microperlas fluorescentes en la vena temporal superficial. Los cerebros se recogieron a diferentes puntos de tiempo después de la inyección. Genomas MCMV se detectaron utilizando el método de hibridación in situ. microperlas fluorescentes o proteína fluorescente verde que expresan partículas MCMV recombinantes se observaron por microscopía fluorescente. Estas técnicas se pueden aplicar a muchos otros patógenos para investigar la patogénesis de la encefalitis.

Introducción

Cuando se estudia la encefalitis viral, la distribución inicial de las partículas virales es muy importante para comprender la patogénesis de la enfermedad y para identificar dianas virales en el cerebro. La mayoría de los virus varían en tamaño de 20 a 300 nm, aunque la pandoravirus es de más de 700 nm de tamaño ^1. La distribución de las partículas virales en la fase aguda de la infección puede depender del tamaño de las partículas, la distribución de los receptores celulares, o la afinidad de los receptores celulares en busca de virus. En modelos animales, intracerebroventricular (ICV), intraperitoneal, placentarios directa, y por vía intravenosa (IV) in....

Protocolo

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Hamamatsu de la Escuela de Medicina.

1. Preparación de MCMV (cepa Smith) y recombinante M32 mejorada-proteína verde fluorescente (EGFP) -MCMV

1. Generar recombinante M32-EGFP-MCMV acuerdo con el método de la siguiente manera (1/2 a 1/9) y como se ha descrito previamente ^8.
2. Utilice virus recombinantes derivados de la cepa Smith de MCMV de tipo salvaje (número de acceso: U68299). Insertar EGFP (4.361 pares de bases; pb) entre 37089 y 41450 pb (M32 - M31 locus) en el genoma por recombinación hom....

Resultados

En estudios sobre la patogénesis de la encefalitis viral, el método de infección es importante. La ruta hematógena representa una infección aguda de las células endoteliales y pericitos del cerebro, mientras que la ruta ICV representa una infección aguda a través de la difusión de CSF a través del espacio subaracnoideo, alcanzando a las meninges y el plexo coroideo. Para el análisis de la primera distribución de partículas en la encefalitis aguda, hibridación in situ pa.......

Discusión

En modelos animales, ICV, intraperitoneal, placenta directa, e infecciones IV se han utilizado para estudiar la patogénesis de la encefalitis viral. Nos centramos en los modelos de ICV e inyección IV de ratones recién nacidos por la simplicidad de los procedimientos y el beneficio de la inyección directa de partículas en la región de destino. Aunque la infección intraperitoneal es un método fácil, partículas virales propagan por vía sistémica a través de un proceso indirecto ^5,24. infección placentaria direct.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tris; tris(hidroximetil)- aminometano	Sigma-Aldrich	T-6791
HCl	Sigma-Aldrich	H-1758
pEGFP-N1 vector	Clontech	#6085-1
D-sorbitol	Sigma-Aldrich	S-1876
SPHERO TM Poliestireno Fluorescente Rojo Nilo 0.04 - 0.06	Spherotech, Inc.	FP-00556-2
SPHERO TM Poliestireno Fluorescente Rojo Nilo 0.1 - 0.3	Spherotech, Inc.	FP-0256-2
SPHERO TM Poliestireno Fluorescente Rojo Nilo 1.7 - 2.2	Spherotech, inc.	FP-2056-2
10% suero de ratón	DAKO	X0910
C57BL/6 ratón	SLC, Inc.
Ratón ICR	SLC, Inc.
Jeringas de microlitro modificadas (serie 7000)	la compañía
	Saito Medical
A Wee Sight Transilluminator	Phillips Healthcare	1017920
O.C.T.Compound	Sakura Finetek	4583
RNase A	Sigma-Aldrich	R4642
Nonidet(R) P-40	Nacalai	25223-04
tampón de citrato (pH 6) x 10	Sigma-Aldrich	C9999-100ml
pepsina	Sigma-Aldrich	P6887
EDTA	dojindo	N001
Formamida	TCI	F0045
Sulfato de dextrano sal sódica	Sigma-Aldrich	42867-5G
Denhardt's Solución (50x)	ThermoFishcer sceintific	750018
Levadura ARNt (10 mg/ml)	ThermoFishcer sceintific	AM7119
SSC 20x	Sigma-Aldrich	S6639
DAPI	ThermoFishcer sceintific	D1306
n-Hexane	Sigma-Aldrich	296090
superfrost plus glass	ThermoFishcer sceintific	12-55-18
Cytokeep II	Nippon Shoji Co.
Griffonia simplicifolia isolectina B4	Vector laboratories, Inc.	L1104
Anti-Ratón CD31 (PECAM-1) PE	ebioscience	12-0311
ProLong	Oro ThermoFishcer sceintific	P36934
BIOREVO	KEYENCE	BZ-9000E

Aguja de calibre 35 de Hamilton