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Artículo de método

Generación de un ratón humanizado hígado uso de células madre hepáticas humanas

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DOI:

10.3791/54167

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29 de agosto de 2016

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1Department of Regenerative Medicine, Graduate School of Medicine, Yokohama City University, 2Department of Advanced Gastroenterological Surgical Science and Technology, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 3Regenerative Medicine Research Center, Jiangsu University Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un nuevo modelo de hígado de ratón humanizado generado en ratones knockout celular mediado por el receptor de toxina Alb (TRECK)/SCID tras el trasplante de células madre hepáticas humanas inmaduras y expandibles.

Resumen

Se ha desarrollado un nuevo modelo animal que involucra ratones quiméricos con hígados humanizados establecido mediante trasplante de hepatocitos humanos. Estos ratones, en los que el hígado ha sido repoblado con hepatocitos humanos funcionales, podrían servir como una herramienta útil para investigar la biología de las células hepáticas humanas, el metabolismo de los fármacos y otras aplicaciones preclínicas. Uno de los factores clave necesarios para el éxito del trasplante de hepatocitos humanos a ratones es la eliminación de los hepatocitos endógenos para evitar la competencia con las células humanas y proporcionar un espacio y un microambiente adecuados para promover la expansión y diferenciación de las células del donante humano. Hasta la fecha, se han establecido dos modelos de ratones con lesiones hepáticas importantes que utilizan lacaretoacetato de fumario hidrolasa (Fah) y ratones activadores del uroplasminógeno (uPA). Sin embargo, los ratones Fah se utilizan principalmente con hepatocitos maduros y la aplicación del modelo uPA está limitada por la disminución de la reproducción. Para superar estas limitaciones, se utilizaron ratones knockout celular mediado por el receptor de toxina Alb (TRECK)/SCID para la diferenciación in vivo de hepatocitos humanos inmaduros y la generación de hígado humanizado. Las células madre hepáticas humanas (HpSC) repoblaron con éxito los hígados de ratones Alb-TRECK/SCID que habían desarrollado una insuficiencia hepática fulminante letal después del tratamiento con toxina diftérica (DT). Este modelo de hígado humanizado en ratones Alb-TRECK/SCID tendrá aplicaciones funcionales en estudios relacionados con el metabolismo de fármacos y las interacciones entre fármacos, y promoverá otros estudios in vivo e in vitro.

Introducción

Los ratones se utilizan comúnmente para las pruebas farmacéuticas ya que la investigación biomédica en humanos está restringida1; sin embargo, estos modelos no siempre son útiles ya que pueden simular incorrectamente los efectos observados en los humanos. La mayoría de los medicamentos de uso médico actual se metabolizan principalmente en el hígado. Sin embargo, el mismo fármaco puede metabolizarse en diferentes metabolitos en el hígado de ratón y humano debido a las diferencias entre especies. Por lo tanto, a menudo es difícil determinar durante el desarrollo si un fármaco potencial presenta algún riesgo para las aplicaciones clínicas2,3.

Para abordar este problema, se han desarrollado hígados de ratón "humanizados" mediante el cultivo de células hepáticas humanas dentrode ratones 4-6; estos modelos exhiben respuestas a fármacos similares a las observadas en el hígado humano. Los modelos de ratón primarios que se utilizan actualmente para la generación de hígado humanizado incluyen los ratones activadores del uroplasminógeno (uPA+/+)4,7, los ratones fumarialacetoacetato hidrolasa (Fah-/-)6 y los ratones timidina quinasa (TK-NOG) recientemente reportados.

Sin embargo, informes previos han demostrado que las células inmaduras humanas trasplantadas o las células madre son menos competitivas que los hepatocitos humanos adultos en hígados de ratón Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−)8-10. Además, los ratones Fah−/− proporcionan una ventaja de crecimiento solo para los hepatocitos diferenciados y no para las células progenitoras hepáticas inmaduras11. El trasplante de células madre hepáticas humanas (HpSC) en ratones TK-NOG en el laboratorio no ha tenido éxito. Por lo tanto, actualmente no existe un modelo de ratón útil para el injerto eficiente de células hepáticas inmaduras humanas.

Por lo tanto, desarrollamos un nuevo modelo de ratón Alb-TRECK/SCID que podría repoblarse de manera eficiente con hepatocitos inmaduros humanos. Este modelo de ratón transgénico expresa receptores del factor de crecimiento similar al EGF de unión a heparina humana (HB-EGF) bajo el control de un promotor de albúmina específico de las células hepáticas. Después de la administración de toxina diftérica (DT), estos ratones desarrollan hepatitis fulminante debido a la ablación condicional de los hepatocitos, lo que permite la residencia y proliferación de las células del donante12. A pesar de que los hepatocitos de ratón han sido trasplantados con éxito en ratones Alb-TRECK/SCID en estudios previos13,14, la generación de un hígado humanizado utilizando ratones Alb-TRECK/SCID aún no ha sido reportada.

En este estudio, se generaron hígados humanizados en ratones Alb-TRECK/SCID mediante trasplante de HpSCs. Este hígado humanizado proporciona un entorno in vivo para la diferenciación universal de células madre y la capacidad de predecir los patrones del metabolismo de los fármacos humanos y las interacciones entre fármacos.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices para la Protección de Animales de la Universidad de la ciudad de Yokohama.

1. Generación del modelo de lesión hepática aguda Ratón

  1. Añadir 1 ml de solución de NaCl al 0,85% con fenol (0,6 g de fenol en 100 ml de solución de NaCl al 0,85%) a 1 mg toxina de la difteria (DT) para hacer un ml de solución madre 1 mg / DT. Nota: DT a una concentración de 1 mg / ml se puede almacenar durante aproximadamente 2 años a 3 ° C a 8 ° C.
  2. En serie diluir la solución de 1 mg / ml de stock DT a 0,3 g / ml DT en solución con fenol 0,85% de NaCl y preparar una alícuota de la solución de DT / ml 0,3 g como una solución de trabajo. Nota: Esta solución de trabajo debe estar recién preparado.
  3. Para llevar a cabo experimentos utilizando una dosis subletal (~ 50% de letalidad), administrar ratones de 8 semanas de edad, una dosis / kg 1,5 g de DT.
    1. Realizar una inyección intraperitoneal de DT Manteniendo el ratón en decúbito dorsal e inserte el needle por debajo de la curva de las rodillas, hacia la izquierda o derecha de la línea media. Evitar la línea media para evitar la penetración de la vejiga. Ángulo de la aguja en aproximadamente 45 ° con respecto al cuerpo.
    2. Usando una jeringa de insulina, inyectar a los ratones con 100 l de recién preparada 0,3 g DT / ml por 20 g de peso del ratón. Por ejemplo, un joven de 18 g de ratón debe recibir 90 l de la disolución de TD / ml 0,3 mg.
  4. Después de la inyección DT 48 hr, recoger la sangre de la vena de la cola mediante la colocación el ratón en un retenedor y el calentamiento de la cola de ratón en un baño de agua a 37 ° durante aproximadamente 10 min para dilatar los vasos sanguíneos. Luego, haga una de 1 mm incisión en la cola de 2 cm de la punta con una hoja de bisturí afilado y recoger la sangre con un tubo capilar se.
    1. Centrifugar el tubo microcapilar que contiene la sangre a 1.500 xg durante 5 min y se recoge el suero, separando el sobrenadante y las células de pellets.
  5. Pipeta de 50 l de suero de ratón 1:20 diluida sobre GOT / AST-PIII se desliza. Se mide la absorbancia del producto de reacción (colorante azul) en 650 nm usando un analizador de química seca automático multiusos según el protocolo del fabricante.
    NOTA: La lectura de la aspartato aminotransferasa (AST) / actividad transaminasa glutámico oxalacético (GOT) se muestra automáticamente. 2 días después de la inyección de DT, aproximadamente el 60% de los ratones exhibieron valores de AST entre 12.000 - 16.000 UI / L y se considera que sufre de daño hepático agudo. Estos ratones se transfirieron a una nueva jaula y se utilizan como receptores de trasplante celular.

2. Preparación de las células madre hepáticas humanas

  1. Aislar células madre hepáticas humanas a partir de células de hígado fetal primarios humanos con un clasificador de células usando los antígenos de las células CDCP1, CD90, CD66 y para obtener una subpoblación CD90 + CDCP1 + CD66-, a continuación, sembrar la población de células aisladas en placas de cultivo recubiertas con colágeno IV, como se informó anteriormente 15. Utilizar células de hígado fetal primarios humanos de una embrionariaedad entre 14 y 18 semanas.
  2. Recoger las células madre hepáticas humanas cultivadas a 80% - 90% de confluencia en placas de cultivo de 100 mm, aspirar el medio de cultivo, se lavan las células con 10 ml de PBS, y luego retirar el PBS. Tripsinizar las células con solución de tripsina / EDTA 2 ml 0,05% durante 5 min a 37 ° C. Nota: Las células en más de un 90% de confluencia no son adecuados para el trasplante de células ya que la diferenciación de células puede influir en su capacidad proliferativa en ratones.
  3. Supervisar el estado de dispersión de las células bajo un microscopio. Cuando las células parecen estar flotando o que fluye libremente, detener la digestión enzimática mediante la adición de 8 ml de DMEM / F12 que contiene 10% de FBS.
  4. Suspender las células lentamente usando una pipeta serológica de 10 ml y la transferencia de las células en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las células durante 5 minutos a 100 x g y 4 ° C.
  5. resuspender cuidadosamente el sedimento celular en 10 ml de DMEM / F12 que contiene 10% de FBS y determinar el número de células usando una cámara del microscopio contando.
  6. Dividir las células en 1,0 x 10 6 células por 50 l de PBS alícuotas para cada ratón individual y almacenar en hielo hasta el trasplante.

3. intraesplénicos trasplante de células madre hepáticas humanas

  1. Colocar una jaula limpia en un 37 ° C almohadilla eléctrica.
  2. Anestesiar al ratón usando isoflurano inhalación (1 a 1,5% (vol / vol) en 2 L de oxígeno por min) colocándolo debajo de la boquilla. Alternativamente, utilizar tubos que contienen una gasa empapada con isoflurano.
    1. Asegúrese de que el ratón se anestesia pellizcando suavemente la almohadilla de la pata trasera. Si se provoca un reflejo de la rodilla, coloque el ratón de nuevo en la cámara. Utilice ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
  3. Afeitar el sitio quirúrgico usando una maquinilla eléctrica y aplicar el 70% (/ vol vol) de etanol y povidona yodada para esterilizar. A continuación, hacer una incisión en la piel de 1 cm en el flanco izquierdo justo por debajo del reborde costal de las costillas, seguido de una incisión enla pared abdominal, así como el peritoneo.
  4. Descubra con cuidado el bazo. Utilice una jeringa microinyección de 100 l con un 32-G de aguja 1/2-pulgada para inyectar directamente 1,0 x 10 6 células madre hepáticas humanas en 50 l de PBS en el bazo de cada ratón. Inclinar la aguja en un ángulo de 5 ° para inyección.
    1. Asegúrese de que la profundidad de la inyección es menor que la mitad del espesor del bazo. La aguja debe entrar en el bazo en un extremo (la cabeza) y depositar las células en el otro extremo (la cola).
  5. Para evitar fugas de las células después de la inyección, aplicar una suave presión con el dedo durante 2 minutos y luego retirar la aguja.
  6. Coloque el bazo de nuevo en el cuerpo del ratón y cerrar la cavidad con una sutura continua normal para la musculatura y la piel.
  7. La transferencia de los ratones en una jaula de 37 ° C pre-calentado inmediatamente después del trasplante. Para garantizar el ratón es capaz de respirar sin dificultad, colocar el ratón sobre su lado en la jaula, unamiccional contacto entre la ropa de cama de la jaula y el sitio de la cirugía.
  8. Monitorear los ratones hasta que el efecto de la anestesia para asegurar las suturas permanecen cerrados y los ratones de regreso a las condiciones pre-cirugía.
  9. Asegurar que los ratones se proporcionan con el agua potable normal y alimentos. Después de 1 hora, volver a la jaula para la habitación del ratón del centro de animales y controlar los ratones diariamente.

4. Detección de Trasplantados hepática hepatocitos humanos de células madre derivadas de células en el hígado de ratón

Nota: Para los siguientes procedimientos, la eutanasia a todos los animales utilizando una sobredosis de ketamina y xilazina seguido por dislocación cervical.

  1. A los 4 - 6 semanas después del trasplante, la eutanasia a los ratones y abrir la cavidad abdominal mediante la reducción simultánea del cutis y la fascia utilizando tijeras quirúrgicas.
  2. Diseccionar el tejido conectivo por encima del peritoneo, con las tijeras como un esparcidor, y cortar el peritoneo a lo largo de la línea alba para abrir el peritonealcavidad.
  3. Levantar el esternón con fórceps, perforar el diafragma, y ​​cortar a través de cada lado del esternón a través de la faja cervical.
  4. Cortar la vena cava en el lado dorsal del hígado y tire del esófago a través del hígado en la dirección anterior. Retire el diafragma a fin de eliminar el hígado.
    Nota: Tenga cuidado de mantener la punta de las tijeras apuntando hacia arriba con el fin de evitar cualquier daño a los órganos torácicos debajo. El timo tiene una tendencia a aferrarse de vez en cuando en el lado dorsal del esternón y esto debe evitarse cuidadosamente.
  5. El uso de la membrana como un mango, empezar a tirar el hígado fuera de la cavidad abdominal. La vena cava interior estará llevando a cabo el hígado en su lugar. Cortar el interior de la vena cava; tener cuidado de no liberar prematuramente la suprarrenal derecha.
    Nota: Los ratones tienen un hígado de cuatro lóbulos que consiste en un lóbulo medio, lóbulo izquierdo, lóbulo derecho y el lóbulo caudado. La vesícula biliar se suspende en la pequeña bifurcación deel lóbulo medio.
  6. Separar los lóbulos de uno al otro en las uniones e integrarlos en el compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Congelar los PTU que contiene el tejido hepático en las rejillas de metal en el criostato.
  7. Cortar secciones de la muestra de 5 micras de grosor usando un criostato a -18 ° C y montarlos en portaobjetos de microscopio RT. Guarde el archivo a -80 ° C. Preparar los portaobjetos para hematoxilina y eosina (H & E) y tinción de inmunofluorescencia de acuerdo con procedimientos previamente reportados 16.

5. Detección de Albúmina Humana secreción y cálculo de la tasa quimérico

  1. Para medir la reconstitución de hígado humano, realizar albúmina humana ELISA utilizando suero y una albúmina ELISA kit humano de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. Calcular la tasa de hígado quimérico humanizado por tiempo real PCR análisis de los niveles de expresión en todo el hígado humanizado. Determinar el ex relativarelación de nivel pression de actina humano específico para cruz actina humano-ratón (relación 1) y la relación de actina de ratón específico para cruz actina humano-ratón (relación 2). La tasa quimérico se calcula como cociente / 1 (relación 1 + relación de 2).

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Resultados

Alb-Treck / hepatocitos ratones SCID expresan el receptor de DT gen HB-EGF humano bajo el control de un promotor de albúmina y exhiben efectos citotóxicos después de la administración DT 12. Para evaluar los efectos del tratamiento DT sobre la lesión hepática, dosis de DT de 1,5 g / kg se inyectaron en ratones SCID de 8 semanas de edad, Alb-Treck / y los cambios patológicos en la administración DT h después de hígado 48 fueron evaluados histológicamente. En comparación con los...

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Discusión

Estudios recientes han demostrado que el hígado de ratón se puede repoblada con hepatocitos humanos, incluidos los hepatocitos adultos y células madre hepáticas proliferativas 17. Estos hígados repobladas han sido utilizados como modelos experimentales preclínicos para las pruebas de metabolismo de fármacos y el descubrimiento y el desarrollo 18 de drogas; Además, han proporcionado un entorno in vivo para la maduración y la diferenciación celular 19. El principal objetivo del pr...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos que divulgar.

Agradecimientos

Deseamos agradecer al Proyecto de Genética de Mamíferos, Instituto Metropolitano de Ciencias Médicas de Tokio, por proporcionar los ratones. También agradecemos a S. Aoyama e Y. Adachi del Instituto de Investigación de Toxicología y ADME (Absorción, Distribución, Metabolismo, Excreción), Sekisui Medical Company Ltd., Japón, y a K. Kozakai e Y. Yamada por su ayuda con el análisis LC-MS/MS. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT) de Japón a Y-W.Z. (18591421, 20591531 y 23591872); por el proyecto innovador y empresarial de Jiangsu para la introducción de talentos de alto nivel y el proyecto de planificación de ciencia y tecnología de Jiangsu (BE2015669); y por subvenciones a H.T. para la Promoción Estratégica de la Investigación y el Desarrollo Innovadores (S-innovation, 62890004) de la Agencia de Ciencia y Tecnología del Japón.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Albúmina humanaSigmaA6684Ratón
Humano CK19DakoM088801Ratón
Núcleos humanosMilliporeMAB1281Ratón
humano CK8/18ProgenGP11Conejillo de indias
CDCP1Biolegend324006 Ratón
CD90BD559869Ratón
CD66BD551479Ratón
GOT/AST-PIIIFujifilm14A2X10004000009
DMEM/F-12Gibco11320-033
FBSBiowestS1520
0.05% Tripsina-EDTA Gibco25300-054
Toxina DiftéricaSigmaD0564-1MG
Albúmina Humana ELISA KitBethyl LaboratoriesE88-129
Jeringa (1 ml)TerumoSS-01T
32G Aguja de 1/2"TSKPRE-32013
O.C.T.Compuesto(118 ml)Sakura Finetek Japón4583
Clasificador de celdas de alta velocidad MoFloBeckman CoulterB25982
DRI-CHEM 7000Fujifilm14B2X10002000046

Referencias

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