Generación de Parabiotic embriones de pez cebra por fusión quirúrgica de Desarrollar blástulas

Resumen

Este protocolo proporciona instrucciones paso a paso sobre cómo generar embriones parabióticos de pez cebra de diferentes orígenes genéticos. Cuando se combina con las capacidades de imagen sin precedentes del embrión de pez cebra, este método proporciona un medio excepcionalmente poderoso para investigar las funciones autónomas de las células frente a las no autónomas de las células para los genes candidatos de interés.

Resumen

parabiosis quirúrgica de dos animales de diferentes orígenes genéticos crea un escenario único para el estudio de células intrínseca frente a las funciones de las células extrínseca de genes candidatos de interés, los comportamientos migratorios de las células, y las señales secretadas en los entornos genéticos distintos. Porque los animales parabiotic comparten una circulación común, nada de sangre o factor transmitida por la sangre de un animal se intercambiarán con su pareja y viceversa. Así, las células y los factores moleculares derivadas de uno antecedentes genéticos pueden ser estudiados en el contexto de un segundo fondo genético. Parabiosis de ratones adultos se ha utilizado ampliamente para la investigación del envejecimiento, cáncer, diabetes, obesidad, y el desarrollo del cerebro. Más recientemente, parabiosis de embriones de pez cebra se ha utilizado para estudiar la biología del desarrollo de la hematopoyesis. En contraste con los ratones, la naturaleza transparente de embriones de pez cebra permite la visualización directa de las células en el contexto parabiotic, por lo que es un método única y poderosa para la investigación de fmecanismos celulares y moleculares undamental. La utilidad de esta técnica, sin embargo, está limitada por una curva de aprendizaje para la generación de los embriones de pez cebra parabiotic. Este protocolo proporciona un método paso a paso sobre cómo fusionar quirúrgicamente el blástulas de dos embriones de pez cebra de diferentes orígenes genéticos para investigar el papel de los genes candidatos de interés. Además, los embriones de pez cebra parabiotic son tolerantes a choque térmico, por lo que el control temporal de la expresión génica posible. Este método no requiere una sofisticada puesta a punto y tiene amplias aplicaciones para el estudio de la migración celular, la especificación del destino, y la diferenciación in vivo durante el desarrollo embrionario.

Introducción

Creación de mosaicos genéticos (quimeras) entre los de tipo salvaje y animales modificados genéticamente es una estrategia bien establecida y clásica para la investigación de células intrínseca frente funciones de las células extrínseca de genes candidatos ^1-6. Blastula trasplante en el pez cebra ha sido ampliamente utilizado para generar embriones quiméricos para estudios de células autonomía ^7-9. Dependiendo del tejido de interés, sin embargo, puede ser un reto para apuntar predecible células del donante en el tejido deseado (por ejemplo, sangre) ^{1-3, 7-9.} Genetistas de ratón han utilizado mucho los métodos quirúrgicos parabiotic para generar organismos unidos con una circulación compartida ^10-14. Debido a que los animales parabiotic comparten un torrente sanguíneo común, las interacciones entre las células que se originaron de un animal con células de los demás animales de un fondo genético diferente pueden ser estudiados ^10-16. Recientemente, el grupo de Karima Kissa elegantemente demostrado la capacidad de crecomió embriones de pez cebra unidos y luego utilizar este sistema para estudiar madre hematopoyéticas y la migración de células progenitoras (HSPC) ^15. Además, parabiosis pez cebra se utilizó recientemente para investigar el papel de cadherina endotelial 5 en células madre hematopoyéticas de la emergencia (HSC) y la migración, ¹⁶ y para estudiar el papel de las células del estroma en el nicho de HSPC durante el desarrollo de pez cebra ^17.

A diferencia de los ratones, embriones de pez cebra son transparentes y permiten la visualización directa de las células durante el desarrollo parabiotic, haciendo que el sistema únicamente de gran alcance. La utilidad de parabiosis en el pez cebra, sin embargo, está limitada por una curva de aprendizaje, y la cirugía parabiotic en los embriones delicados puede ser técnicamente difícil sin una instrucción detallada y demostración visual. El objetivo de este protocolo es proporcionar un conjunto de instrucciones claras, paso a paso para acompañar tutoriales basados ​​en vídeo sobre cómo generar embriones de pez cebra para el estudio de parabioticfunciones de las células extrínseca de un gen (s) candidato por fusión quirúrgica de desarrollar blástulas temporal, celular intrínseco, o. modificaciones clave y recomendaciones adicionales para aumentar la supervivencia parabiont y nuevas aplicaciones experimentales se incluyen.

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Infantil de Boston. Este protocolo se modificó a partir de un método publicado previamente ^15.

1. Preparación de los reactivos (días o semanas de anticipación)

1. Preparar 1,5% de agarosa recubiertas de platos. Añadir 1,5 g de agarosa a 100 ml de medio de pez cebra E3 en un matraz Erlenmeyer. El calor, disolver la agarosa, y luego vierta aproximadamente 5 ml en 100 mm de diámetro x 20 mm placas de Petri profundas.
   Nota: Estos se utilizan para dechorionation de embriones (Paso 3.1) y para la cirugía parabiotic (paso 3.3). Almacenar placas revestidas con agarosa a 4 ° C durante unas semanas; sacarlos de la nevera y calentar a ta la mañana del día de la cirugía parabiotic.
2. Preparar 4% de celulosa de metilo. Disolver 4 g de polvo de metilcelulosa en 100 ml de E3 en un matraz Erlenmeyer con una barra de agitación. Colocar el matraz en una placa de agitación a 4 ° C, ajuste a la velocidad más baja, y dejar que se mezclepara un máximo de 2 días.
   1. utilizar de forma intermitente una espátula para romper los grumos blancos de metilcelulosa. Los cristales metil celulosa no se disuelven completamente a esta concentración. Cuando la solución se vuelva clara y aparece homogénea sin grumos blancos restante, parte alícuota de la solución en 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se congelan a -20 ° C para almacenamiento a largo plazo.
      Nota: Las concentraciones más bajas de metil celulosa se pueden utilizar; Sin embargo, este porcentaje más alto, más viscosa de celulosa de metilo ha dado los mejores resultados.
3. Preparar la solución de Ringer alta de calcio (HCR). Para hacer 400 ml de solución HCR, mezcla 8 ml de NaCl 5 M (116 mM final), 400 l de 3M KCl (2,9 mM final), 800 l de 5M _{de CaCl2} (10 mM final), y 2 ml de HEPES 1 M (5 mM final) con 390 ml de medio E3.
   Nota: La solución de tienda HCR a 4 ° C durante unas semanas; calentar a ta la mañana del día de la cirugía parabiotic.
4. Preparar 5 - 6 pipetas Pasteur modificados para la transferenciasonar blástula pares. Brevemente calentar el extremo de la pipeta sobre un mechero Bunsen. Entonces, el uso de grandes pinzas, doblar el extremo de la pipeta a aproximadamente 45 ° C mientras todavía está caliente.
   1. Para asegurarse de que no hay bordes afilados que puedan dañar embriones, sostenga la punta de la pipeta brevemente en la llama durante unos 3 seg. Esto suavizará / esmalte al final de la pipeta. Esta pipeta Pasteur de vidrio modificada se utiliza en conjunción con una bomba de pipeta 10 ml (Figura 1) en el paso 3.5 a continuación.
5. Preparar herramientas de aguja de vidrio para la costura quirúrgica de pares de blástula. Tire 2 - 3 agujas de vidrio como se hizo para la microinyección de embriones de pez cebra. Utilizar el laboratorio de película para fijar cada aguja de vidrio en el extremo de una aguja burlas leña o con mango de plástico (Figura 1A). El uso de pinzas, rompa el extremo de la aguja en un diámetro de aproximadamente 20 - 30 micras. Use un micrómetro de platina para guiar este paso (Figura 1B).
   Nota: El tamaño del needle punta es importante. Si la punta es demasiado grande se hace difícil de controlar con precisión y puede causar un daño excesivo. Si la punta es demasiado pequeño, es difícil bobinado suficientemente los embriones.

2. La creación de parejas reproductoras de pez cebra y percepción de los embriones (día -1 al día 0)

1. Configurar parejas de adultos de pez cebra. Configurar el pescado la noche anterior se va a realizar la cirugía parabiosis. Utilice divisores para separar machos y hembras. Para aumentar las probabilidades de que se obtengan los embriones deseados, la creación de varias parejas de cada línea. Nos encontramos con que normalmente 20 - 50% de las parejas se generan.
2. A la mañana siguiente, tire de los divisores y permitir el apareamiento. Recoger los embriones utilizando un colador de té de malla fina, y luego transferirlos a una placa de Petri que contiene medio de embrión E3 ^18.
3. Micro-inyectar embriones como desee (por ejemplo, con 25 pg de ADN de plásmido, el ARNm pg 200, o con 1 a 6 ng morfolino) dentro de 1 h de colección. Permitirlescrecer hasta la etapa 256 de células. Si la construcción de expresión de ADN se coloca bajo el control de un promotor de choque térmico (por ejemplo, la hsp70, la Figura 4B), controlar el momento de la expresión génica por desconchado térmico los parabionts a 37 ° C en una etapa posterior (por ejemplo., En 36 hpf ).
   Nota: Como alternativa a un transgén fluorescente, dextrano fluorescente se puede añadir a la DNA, RNA, o la mezcla de inyección de morfolino (por ejemplo, dextrano, azul cascada a 2 mg / ml). El tinte de dextrano no interfiere con el desarrollo normal y permitirá el embrión inyectado para ser identificado bajo la luz fluorescente apropiada después de la fusión parabiotic. Alternativamente, la parabiosis de una cepa pigmentado (por ejemplo, AB) con una cepa no pigmentado (por ejemplo, Casper) podría ser utilizado para identificar el embrión inyectado en etapas posteriores.
4. Incubar los embriones a 28,5 ° C.Use un estereoscopio para controlar su evolución periódicamente a medida que se acercan al dev-256 célulaselopmental etapa (aproximadamente 2,5 HPF).
   Nota: Si es necesario, cambiar los embriones a diferentes temperaturas para garantizar la coincidencia de fase entre los socios parabiotic (por ejemplo, embriones de morfolino-inyectada a menudo desarrollan más lento que sus contrapartes de la ONU con inyección de desplazamiento de los embriones de la ONU-inyectada a RT mientras que los embriones de morfolino-inyectada se colocan. a 28,5 ° C resultará en sus etapas de alineación después de un par de horas de desarrollo).

3. Generación de Parabiotic embriones de pez cebra por fusión quirúrgica de Desarrollar blástulas

1. Como los embriones se acercan a la etapa 256 de células (aproximadamente 2,5 hpf), la transferencia de los embriones de cada fondo genético (es decir, mutante genético, líneas transgénicas y / o la manipulación genética) en placas de agarosa recubiertas de separados (por ejemplo, un plato de morfolino embriones inyectados y un segundo plato para el control de embriones). Por otra parte, la transferencia de los embriones para limpiar, vasos de vidrio libre de arañazos o platos de Petri de vidrio.
   Nota: Evitar el uso de placas de plástico no revestidas como los embriones se adhieren al plástico y dañarse una vez fuera de sus chorions.
2. Decantar los medios de comunicación E3 hasta justo suficiente líquido permanece para cubrir los embriones (aproximadamente 7 - 10 ml). Añadir 200 l de 50 mg / ml de mezcla de proteasas aislados del fluido extracelular de Streptomyces griseus (proteasas). Agitar suavemente los embriones cada par de minutos.
   1. Cuando el 50% de los embriones han salido de sus corion, que por lo general tarda de 5 - 10 minutos, enjuagar tres veces con un volumen generoso (aproximadamente 15 - 20 ml) de medio E3 de embriones frescos.
      1. Dechorionate los embriones restantes en sus chorions dibujando suavemente hacia arriba en la pipeta Pasteur de vidrio modificado y luego suavemente disiparlas. Una vez que los embriones se han dechorionated y lavado, vuelva a colocar los medios de comunicación E3 con una solución de HCR. Como una alternativa a las proteasas, retire los chorions forma manual utilizando una pinza fina. Trate de tener 60 - 100 dechorembriones ionated disponibles para cada condición experimental.
         Nota: Esta es varias veces más que en última instancia ser utilizado, pero muchos embriones son propensos a sufrir daños durante la manipulación o la cirugía para la parabiosis. Una vez que los embriones se dechorionated, mantenerlos sumergidos y no permita que se toquen la superficie del agua, ya que la tensión superficial causará que sean destruidos. Tenga en cuenta que el uso de una dosis más alta de las proteasas permite que los embriones salen de sus chorions más pronto y de una forma más sincronizada. Cuando se utiliza una dosis más baja de las proteasas, los embriones toman más tiempo para salir de sus chorions y lo hacen de una manera síncrona menos, lo que puede resultar en una parte de los embriones ser dañado por la exposición prolongada a proteasas.
3. Descongelar la metilcelulosa (hecho en el paso 1.2 anterior) y se centrifuga en una centrífuga de mesa de la velocidad máxima durante 10 minutos para sedimentar los cristales sin disolver que dañarán los embriones o la ruptura de su yemas.
   1. Después de la centrifugación, utilice la fracción superior clara (aproximadamente 75% del volumen). Transfer 1 - gotas de diámetro 1,5 cm de metil celulosa en una placa Petri recubierta de agarosa 1,5%. Tenga cuidado de evitar la elaboración de cualquiera de los cristales sedimentadas desde el fondo del tubo.
   2. Use un marcador para predeterminar la posición de cada gota en la parte inferior del plato. Coloca 12 - 15 gotas (2 - 3 por valor de alícuotas ') de metil celulosa por 100 mm placa de Petri de diámetro. Preparar tantas placas como sea necesario por experimento.
      Nota: Use cada gota para la fusión de un solo par de blástula. La marca designará la ubicación de cada gotita vez se añade-en el punto de medios de comunicación que las gotas se convierten casi invisible.
4. Preparar uno 40 ml alícuota de solución HCR antibiótico suplementada por placa de agarosa recubiertas de preparado anteriormente en el paso 3.3. A cada 40 ml alícuota de HCR añadir penicilina-estreptomicina a 50 U / ml, ampicilina a 50 U / ml, y kanamicina a 0,5 g/ Ml.
   1. Cuando esté listo para realizar fusiones de blástula, llenar cuidadosamente cada uno de los platos que contienen gotitas de celulosa de metilo con 40 ml de la solución de antibiótico HCR-suplementado. Si se añade la solución HCR demasiado rápido, puede interrumpir las gotas.
5. Una el vidrio modificado pipeta Pasteur (hecho en el paso 1.4 anterior) a una bomba de pipeta 10 ml. En un estereoscopio recoger un embrión dechorionated de cada plano (por ejemplo, un embrión morfolino-inyectado y uno de tipo salvaje embriones).
   1. Antes de dispensar los dos embriones, utilizar la pipeta Pasteur para hacer una pequeña depresión en el medio de la caída de metil celulosa, luego suavemente depositar ambos embriones en la depresión.
      Nota: Durante el proceso de transferencia, gire la pipeta Pasteur ligeramente hacia arriba para que los embriones se depositan en la curva de la pipeta Pasteur a fin de evitar su toma de contacto con la superficie del líquido en la parte superior o inferior de la pipeta (que puede conducir a their ruptura).
6. Inmediatamente después de depositar los embriones en el metilcelulosa, utilizar una aguja burlas leña o con mango de plástico con una punta de pipeta de carga de gel en el extremo (Figura 1 A) para volver a colocar cuidadosamente los embriones dentro de la metilcelulosa tal manera que sus polos animales son directamente tocarse.
   1. Utilizar suaves movimientos de barrido a través de la metilcelulosa cerca de los embriones para cambiar su posición sin tocar directamente. Deje que los embriones se sientan durante 5 minutos por lo que la metilcelulosa se instalará en torno a ellos. Durante este tiempo, cargue el siguiente par en otra gota.
      Nota: Evitar el contacto directo con los embriones y tener especial cuidado de no tocar ninguna parte del saco vitelino, que se romperá fácilmente.
7. Con la herramienta de aguja de vidrio, la herida cuidadosamente cada embrión en su punto de contacto. Con un movimiento suave de costura, las células de la primera embriones pueden introducirse en el segundo embrión y luego de vuelta otra vez.Al final de este movimiento, mantener la aguja en el lugar durante 2 - 3 segundos y después alejarla muy lentamente.
   Nota: Hay un período de aproximadamente 2 a 3 segundos después de los embriones son heridas donde los dos tejidos parecen ser más adhesivo y más probable para unir el uno al otro. Por lo tanto, creemos que la celebración de la aguja en su lugar brevemente después de la herida ayuda a mantener los tejidos heridos de cada embrión en contacto durante el período inicial de tiempo inmediatamente después de la herida.
8. Permitir que estos embriones para sentarse durante 10 - 15 min a TA. Mientras tanto, seguir puntadas nuevos pares en otras gotas de metil celulosa. Después de 10-15 min, evaluar si el primer par se ha mantenido adjunto (Figura 2A).
   Nota: Si los embriones son ya unidos, repetir el proceso de costura durante el tiempo que los embriones son menores de alrededor del escenario epibolia 30%. Normalmente, esto permite hasta tres intentos para coser los embriones juntos. Si los embriones parecen haber mantenido un archivo adjunto pero la cone xión no es sustancial, realizar la costura adicional en el borde de la conexión para reforzarla. Evite agitar o mover los platos durante los períodos de incubación y de cirugía parabiotic.
   Nota: A pesar de su etapa de desarrollo temprano y fragilidad percibido, las masas de células de los embriones pueden tolerar una cantidad sustancial de manipulación (es decir, heridas y la costura), y aún desarrollarse normalmente. La yema de huevo, sin embargo, puede romperse con sólo el más mínimo contacto, causando la muerte del embrión. Cuando coser las dos blástulas con la aguja de vidrio, no para hacer contacto con la superficie de contacto entre la masa celular y la yema de cada embrión.
9. Incubar los embriones O / N a 28,5 ° C en el mismo plato y medios de comunicación (no cambie los medios de comunicación). Por la mañana siguiente, los embriones se han mudado de las gotitas de metil celulosa sobre todo disueltos. Retire cualquier embriones que no fueron fusionadas con éxito. Decantar los medios de comunicación y reemplazar con una fresca 25 ml E3.
   Nota: Si se trabaja con unacepa pigmentada, añadir 500 l feniltiourea 0,15% (50x) (PTU) a una concentración final de 0,003% para bloquear la pigmentación. Los embriones deberán permanecer continuamente en la PTU para mantener la supresión de la pigmentación.

4. Configuración del microscopio, adquisición de imágenes, procesamiento y análisis

1. Preparar agarosa al 0,8% de bajo punto de fusión (LMP): Añadir 0,8 g de agarosa LMP a 100 ml E3 y el calor hasta que esté completamente disuelto. Si bien caliente, alícuota de 1 ml de agarosa LMP en 1,5 ml tubos de microcentrífuga en un bloque de calentamiento de 37 ° C. La agarosa LMP permanecerá fundido a 37 ° C. Añadir 40 l de 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaína a cada alícuota de 1 ml de agarosa LMP a 37 ° C. Nota: Si se trabaja con una cepa pigmentada, se añaden 20 l de 0,15% (50x) PTU a cada alícuota de 1 ml.
   1. Almacenar la agarosa LMP restante durante varios meses en tubos de 50 ml sellados a 4 ° C.
2. Anestesie embriones parabiotic a ser fotografiado mediante la adición de 1 ml de 4 mg / ml (25x), pH 7,0 tricaínaa los 25 ml de E3 que los embriones ya en lo son.
3. Hacer girar suavemente el plato de manera que los embriones pondrán en común en el medio. Luego, utilizando una pipeta de transferencia de plástico con puntas anchas elaborar los embriones en tan poco líquido como sea posible. Girar la pipeta en posición vertical y rebotar suavemente los embriones para que se depositan en el fondo mismo de la pipeta.
   1. Con los embriones en la parte inferior de la pipeta, transferirlos a una alícuota de 1 ml de agarosa LMP tocando ligeramente la punta de pipeta a la superficie de la agarosa. Evitar la transferencia de líquido en exceso ya que esto va a diluir la agarosa.
4. Después de expulsar el exceso de líquido de la pipeta, use la pipeta para mezclar suavemente los embriones dentro de la agarosa, a continuación, utilizar la pipeta para transferir la totalidad de la agarosa y embriones para el bienestar de un fondo de vidrio (Nº 1.5 cubreobjetos), 6- así placa.
   Nota: Asegúrese de desechar la pipeta después de transferir los embriones a la placa de imagen. agarosa residual se establece dentro de la pipeta, rendering ineficaz para su uso posterior. Más bien, utilizar una pipeta nueva cada vez.
5. En virtud de un estereoscopio, utilizar una punta de pipeta de carga de gel fijado en el extremo de una aguja burlas mango de madera para colocar los embriones hacia abajo hacia la cubierta de vidrio (para asegurar que están dentro de la distancia de trabajo del objetivo de microscopio), y en la orientación deseada para formación de imágenes.
   Nota: Vuelva a colocar de forma continua hasta que la agarosa se ha establecido plenamente. Tenga cuidado para montar los embriones parabiotic según la cual el embrión de la pareja es a explorar. Dada la orientación aleatoria de los embriones unidos, para algunos pares puede ser difícil de imagen ambos embriones. En este escenario, la recuperación de los embriones a partir de la agarosa utilizando unas pinzas y una pipeta de transferencia de plástico con puntas anchas y luego volver a montar para obtener imágenes desde una perspectiva diferente.
6. Una vez que la agarosa se ha puesto, cubrir con 2 - 3 ml de E3 suplementado con tricaína (y PTU si es necesario).
7. Imagen los embriones utilizando un campo amplio epi-fluorescencia invertido, lasconfocal de barrido-er, o girando el disco microscopio confocal. Seleccionar el objetivo más apropiada para la formación de imágenes deseado. Para un campo de todo el embrión de vista, utilice un objetivo de 4x. Seleccionar un aumento mayor, tal como un objetivo de 20x, a la imagen un tejido específico ^{16, 19.}
   Nota: Si se utiliza un microscopio vertical, montar en LMP agarosa (similar al anterior) en una hoja de la cubierta de vidrio. Invertir el cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio que tiene un anillo de grasa de vacío lleno con el mismo E3-tricaína-PTU ^{16, 19.}
8. Proceso de las imágenes adquiridas utilizando paquetes de software de análisis de imágenes gratuitas, tales como NIH Image J / FIJI ^{16, 19.}
   Nota: Contar el número de células y cuantificar la dinámica como la migración celular y la división celular utilizando la segmentación y el seguimiento de los algoritmos ^{16, 19.}

Resultados

De acuerdo con estudios publicados previamente ^15, el éxito de la fusión parabiotic de embriones de pez cebra depende de la puesta en escena y la orientación de los dos embriones y la concentración de metilcelulosa. Con tan solo unos simples, herramientas de bajo costo, mediante intervención quirúrgica fusionados blástulas en desarrollo se generaron embriones que se convirtió en parabiotic con circulación compartida. Estas herramientas incluyen una pipeta Pasteur modificado, u...

Discusión

Parabiotic fusión ha sido una herramienta poderosa para investigar las funciones celulares de genes candidatos en modelos murinos adultos y embriones de pollo ^{de 10-14.} Más recientemente, un método de fusión de blástula se ha descrito para la generación de embriones de pez cebra unidos ^15. En el presente protocolo, tutoriales basados ​​en vídeo se utilizan para demostrar y describir la metodología para la creación de embriones de pez cebra parabiotic de diferentes orígenes genéticos con el fin de e...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Metilcelulosa	Sigma	M0387
Componentes individuales para E3/HCR:		Para 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4
sodio)	Sigma-Aldrich	S9888
KCl (Cloruro de potasio)	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2 (Cloruro de calcio dihidratado)	Sigma-Aldrich	223506
MgSO4 (Sulfato de Magnessio heptahidratado)	Sigma-Aldrich	230391
Hepes (1M) solución tampón	ThermoFisher	15630-080
Name	Company	Catálogo Número<
fuerte>Antibióticos:
Pluma/Estreptococo	gibco de Life technologies	15140-120
Sal sódica de ampicilina	Sigma Life Science	A0166
Sulfato de kanamicina de Streptomyces kanamyceticus	Sigma Life Science	K1377
Name	Company	Número de catálogo
50 mg/ml Pronase de Streptomyces griseus	Roche	11459643001
vidrio capilar utilizado para agujas (vidrio capilar & Filamentos)	Instrumento Sutter	ARTÍCULO#: BF 100-50-10
Agujas de burla con mangos de madera	Fisher Scientific	S07894
Pipetas Pasteur de vidrio	Fisherbrand	13-678-20A
Bomba de pipeta de 10 ml (verde) (Pipeta de bomba de pipeta)	Novatech International	F37898-0000
Placas de Petri de plástico de 100 mm de diámetro / 20 mm de profundidad (PLACA DE PETRI, 100/20 MM, PS, TRANSPARENTE, CON REJILLAS DE VENTILACIÓN, DISEÑO PESADO, 15 PIEZAS/BOLSA )	Greiner Bio-one	664102
Dextrano, Azul Cascada, 10.000 MW, Aniónico, Lisina Fijable	ThermoFisher	D-1976
PTU. El stock de trabajo es del 0,003% (50x es 0,15%). por 500 ml, 0,75 g N-Phenylthiourea	Sigma-Aldrich	P7629
Tricaína (polvo) (Tricaína Metanosulfonato, Tricaína-S)	Western Chemical Inc	MS 222
LMP agarosa (Ultrapure LMP agarose)	Invitrogen	16520100 pipeta
transferencia de plástico (creo que solo la de extremo ancho)	Fisherbrand	137115AM
Placas de 6 pocillos con fondo de vidrio utilizadas para la obtención de imágenes	MatTek	P06G1.5-20-F
punta de carga de gel occidental de plástico fijada en el extremo de una aguja de disección con mango de madera (puntas GELoader)	Eppendorf	22351656
se desliza, se desliza y engrasa al vacío si se monta para un microscopio vertical:
Grasa de vacío ( Dow Corning & reg; grasa de silicona de alto vacío incoloro, peso 5.3 oz (tubo) )	Dow Corning	Z273554
Deslizamientos	de cubierta de vidrioCiencias de la vida de Corning	2960-244