Las células epiteliales bronquiales humanas primarias son difíciles de transducir. Este protocolo describe la producción de lentivirus y su concentración, así como las condiciones óptimas de cultivo necesarias para lograr transducciones altamente eficientes en estas células a lo largo de la diferenciación a un epitelio pseudoestratificado.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Lentivirus óptimo de producción y el cultivo celular condiciones necesarias para la transducción de éxito células epiteliales bronquiales humanos primarios
En este artículo
Resumen
Resumen
El cultivo in vitro de células humanas primarias del epitelio bronquial (HBE) usando condiciones de interfaz aire-líquido proporciona un modelo útil para estudiar los procesos de diferenciación celular de las vías respiratorias y la función. En los últimos años, el uso de vectores lentivirales para la entrega transgén se convirtió en una práctica común. Mientras que hay informes de la transducción de las células epiteliales de las vías respiratorias completamente diferenciadas con ciertas lentivirus seudo-tecleado sin infección por VIH, la eficiencia global de transducción es generalmente menos de 15%. El protocolo presentado aquí proporciona un método fiable y eficiente para producir lentivirus y para la transducción de células epiteliales bronquiales humanas primarias. El uso de células epiteliales bronquiales no diferenciadas, la transducción en medio de crecimiento epitelial bronquial, mientras que las células se adhieren, con una multiplicidad de infección de factor de 4 proporciona eficiencias de cerca de 100%. Este protocolo describe, paso a paso, la preparación y la concentración de los vectores de lentivirus de alto título y THproceso de transducción e. Se analizan los experimentos que determinaron las condiciones óptimas de cultivo para lograr la transducción de alta eficiencia de las células epiteliales bronquiales humanas primarias.
Introducción
El desarrollo de los lentivirus, pseudotyped replicación defectuosa (LV) ha proporcionado a los investigadores un método seguro y eficaz para entregar los transgenes in vitro 1. Debido a su expresión a largo plazo, estos LV también podría ser utilizado para la administración de agentes terapéuticos in vivo 2,3. La producción de LV requiere co-transfección de riñón embrionario humano (HEK) células con varios plásmidos: vector de transferencia, de la mordaza de embalaje / pol, rev embalaje, y el sobre vesicular glicoproteína del virus de la estomatitis (VSV-G) plásmidos. Sistemas de envasado de....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Etapa 1: Cultivo de células HEK 293T
- Preparar medios células HEK (referido como medios HEK) mediante la adición de 10% (v / v) de suero bovino fetal (FBS) y 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina al alto nivel de glucosa de Dulbecco Modificado de Eagle Medium (DMEM).
- Escudo una placa de 10 cm de cultivo de tejidos con colágeno I. Se mezclan 30 l de colágeno I en 2 ml de agua destilada. Corre la mezcla en el plato y se incuba durante 2 horas a 37 ° C y 5% de CO2.
- Retire la mezcla y dejar que el plato de seco en una cabina de flujo laminar durante 15 minutos.
- Células de la placa HEK sobre el plato recubierto a u....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La figura 1 representa diferentes pasos clave de la evaluación de las células y las soluciones durante el proceso de transfección. La Figura 1A muestra la confluencia óptima de las células HEK293T antes de la transfección para la producción de virus. Es importante que las células se distribuyen uniformemente por todo el plato. Figura 1b revela el precipitado en una gota de la mezcla de transfección usando la óptica de campo claro y un ob.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El protocolo descrito aquí asegura cerca de 100% de eficiencia de transducción. Sin embargo, hay algunos pasos durante el proceso que son importantes para lograr este objetivo. Por ejemplo, durante el proceso de transfección, la presencia de precipitados en la mezcla de transducción (caída) o en el plato de la días después de la transducción (Figuras 1b y d) son relevantes para una buena transfección. La ausencia de un precipitado o la presencia de aglomerados puede ser debido a una omi.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a la Alianza Agencia de Recuperación de Órganos Vida de la Universidad de Miami para proporcionar pulmones. También agradecemos al Dr. Lisa Künzi para la preparación de ADN utilizado para los experimentos se muestra en la Figura 2B y 3-D, el Dr. Ben Gerovac y Lisa Novak para el virus mCherry utilizado para los experimentos en las Figuras 3A a C. También se agradece a Gabriel Gaidosh desde la instalación de imágenes, Departamento de Oftalmología de la Universidad de Miami.
Este estudio ha sido patrocinado por subvenciones del NIH, la Fundación de FQ y la asistente de vuelo Instituto de Investigación Médica Dr. Matthias Salathe.....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| HEK293T/17 células | ATCC | CRL-11268 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Sigma | 12306C | uso al 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicilina/Estreptomicina (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | uso en 1x |
| Colágeno I | BD Biosciences | 354231 diluir 1:75 en agua destilada | |
| Calphos | Clontech | 631312 | Kit de transfección que contiene 2 M de solución de calcio, 2 soluciones tamponadas (HBS) y H2O estéril |
| Politilenglicol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock de 40% |
| Anfotericina B | Sigma | A9528 | uso en 1x |
| Tripsina | Sigma | T4799 | |
| Inhibidor de tripsina de soja | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12 mm | Corning | 3460 | |
| Colágeno IV | Sigma | C7521 | diluido 1:10 en agua destilada |
| Bromuro de hexadimetrina | Sigma | H9268 | stock de 2 mg/ml |
| Puromicina (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | uso en 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 vector de | expresión lentiviral |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | empaquetamiento ADN |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | empaque ADN |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | empaque ADN |
Referencias
- Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
- Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr Gene thera....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
