Hemos desarrollado un método de lesión nerviosa para examinar de forma fiable la reinervación muscular y, por tanto, la regeneración de las uniones neuromusculares en ratones. Esta técnica consiste en lesionar el nervio fibular común mediante una cirugía sencilla y altamente reproducible. La reinervación muscular se evaluó mediante el montaje completo del músculo extensor largo de los dedos.
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Artículo de método
El nervio peroneo Método de lesiones: un ensayo fiable para identificar y Factores de prueba de que la reparación neuromusculares uniones
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Resumen
Resumen
La unión neuromuscular (UNM) sufre cambios estructurales y funcionales deletéreos como resultado del envejecimiento, lesiones y enfermedades. Por lo tanto, es imprescindible para entender los cambios celulares y moleculares implicados en el mantenimiento y la reparación de NMJs. Para este propósito, hemos desarrollado un método para examinar fiable y consistente regeneración NMJs en ratones. Este método consiste en la lesión del nervio de aplastamiento del nervio peroneo común, ya que pasa por encima de la cabeza lateral del tendón del músculo gemelo cerca de la rodilla. Utilizando viejos ratones hembra de 70 días, se demuestra que los axones motores comienzan a reinervar objetivos postsinápticos anteriores dentro de los 7 días posteriores a aplastamiento. Que reingresen completamente sus áreas sinápticas anteriores por 12 días. Para determinar la fiabilidad de este método de la lesión, se compararon las tasas de reinervación entre 70 días de edad ratones hembras individuales. Se encontró que el número de sitios postsinápticos reinervados fue similar entre los ratones a los 7, 9, y 12 días post-aplastamiento. Para determinar sieste ensayo lesión también se puede utilizar para comparar los cambios moleculares en los músculos, se examinaron los niveles de la subunidad gamma del receptor nicotínico muscular (gamma-AChR) y la cinasa específica de músculo (MuSK). La subunidad gamma-AChR y almizcle que están altamente regulados por incremento tras la denervación y vuelven a los niveles normales después de la reinervación de NMJs. Hemos encontrado una estrecha relación entre los niveles de transcripción de estos genes y el estado de la inervación de los músculos. Creemos que este método se acelerará la comprensión de los cambios celulares y moleculares implicados en la reparación de la NMJ y otras sinapsis.
Introducción
En animales adultos jóvenes y sanos, la unión neuromuscular (NMJ) es una conexión altamente estable entre la presinapsis, la terminación nerviosa de un axón α motor, y la postsinapsis, la región especializada de una fibra muscular extrafusional donde los receptores nicotínicos de acetilcolina (AChRs) se agregan selectivamente1. La aposición casi perfecta de los aparatos pre y postsinápticos es necesaria para la correcta neurotransmisión, la supervivencia de las neuronas motoras α y las fibras musculares y la función motora. Desafortunadamente, la función de la NMJ se ve afectada negativamente por el envejecimiento, enfermedades como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedades autoinmunes y lesiones musculares y nerviosas periféricas2-5. Estas agresiones a menudo resultan en la degeneración de las terminaciones nerviosas presinápticas, dejando los músculos denervados y alterando significativamente las habilidades motoras. Por esta razón, la identificación de moléculas que funcionan para mantener y reparar la NMJ se ha convertido en una prioridad. Debido a que los nervios periféricos se regeneran y reinervan los objetivos, se han utilizado modelos de lesión de nervios periféricos para identificar los cambios moleculares asociados con la regeneración de las NMJ.
Los modelos de lesiones nerviosas periféricas a menudo implican cortar o triturar completamente ramas nerviosas específicas6. Después de un corte, el tubo endoneural tiene que ser reformado, retrasando la regeneración axonal y la reinervación de las células y tejidos diana. La gravedad de este tipo de lesión también hace que los axones se alejen de su trayectoria original, lo que hace que no alcancen los objetivos originales. Esto contrasta con los nervios lesionados por aplastamiento, donde el endoneuro permanece contiguo, proporcionando un camino para el recrecimiento eficiente y adecuado de los axones en regeneración. También permite que los axones encuentren y reivivan a sus socios originales de fibras musculares. Independientemente del modelo de lesión, hay una serie de cambios celulares y moleculares que deben ocurrir para que los axones se regeneren y reivivan los objetivos. Después de una lesión, el segmento nervioso proximal al objetivo se rompe y se extirpa a través de un proceso denominado degeneración walleriana7. Este proceso implica la reprogramación y desdiferenciación de las células de Schwann en células no mielinizantes que secretan factores regenerativos, eliminan la mielina y reclutan macrófagos en el sitio dela lesión. Los macrófagos, a su vez, completan la eliminación de la mielina y los restos axonales, que de otro modo impedirían el crecimiento del axón en regeneración9. Paralelamente, las neuronas motoras y sensoriales activan los mecanismos necesarios para promover la regeneración de sus axones cortados. Una vez que el axón en regeneración llega al objetivo, debe transformarse de un cono de crecimiento a una terminación nerviosa capaz de transmitir adecuadamente (en el caso de los axones motores) o recibir (en el caso de los axones sensoriales)información 10. En este sentido, los axones alfa-motores experimentan una serie de cambios bien orquestados que culminan en la diferenciación de su cono de crecimiento en una terminación nerviosa presináptica completamente funcional que se opone casi perfectamente al sitio postsináptico en la fibra muscular diana11.
Los nervios ciático, tibial y accesorio han sido las principales opciones para estudiar la regeneración axonal y NMJ12-14. Sin embargo, existen una serie de inconvenientes cuando se utilizan estos modelos para examinar los cambios celulares y moleculares asociados con la regeneración de NMJ entre animales y en diferentes condiciones. En primer lugar, el nervio ciático inerva la mayoría de los músculos de la extremidad trasera, y las lesiones limitan significativamente tanto el movimiento como la sensibilidad. Por lo tanto, no es posible utilizar este método para estudiar el impacto del ejercicio solo o en combinación con otros factores. Además, el nervio ciático es una estructura bastante gruesa y, por lo tanto, requiere una gran cantidad de fuerza de compresión para lesionar completamente todos los axones. Esto, a su vez, puede resultar en la transección completa de los axones más superficiales mientras se deja intacto el tubo endoneural de los axones más profundos, introduciendo una variabilidad significativa en la tasa y fidelidad de regeneración entre estos axones. La transección completa de este nervio es aún menos deseable dado que muchos axones no lograrán volver a conectarse con las mismas fibras musculares. Para complicar las cosas, el nervio ciático posee una variabilidad anatómica intrínseca, tanto en el número como en el sitio de origen de sus ramas nerviosas terminales. Por lo tanto, es muy difícil lesionar el mismo sitio. Si bien el nervio tibial es más pequeño y más susceptible a las lesiones por aplastamiento, tampoco hay un punto de referencia fácilmente disponible que sirva como sitio de lesión para esta rama nerviosa.
La rama del nervio accesorio (parte del nervio craneal XI) que irriga el músculo esternocleidomastoideo también se ha utilizado para estudiar la regeneración de las NMJs15. Este nervio es particularmente atractivo porque las NMJ en el músculo esternocleidomastoideo se pueden visualizar más fácilmente en animales vivos en comparación con las NMJ en otros músculos. Pero al igual que los nervios ciático y tibial, no existe un punto de referencia específico que pueda usarse para lesionar este nervio en el mismo lugar, lo que lo limita como modelo para comparar la regeneración de NMJ entre animales individuales de una cohorte experimental. Un sitio de lesión inconsistente introduce variabilidad en las tasas de reinervación de la NMJ. Debido a estas deficiencias, el procedimiento presentado aquí utiliza la lesión de una rama nerviosa periférica diferente para examinar la regeneración de las NMJ.
El nervio peroneo común, también llamado nervio peroneo común, contiene muchas características que lo convierten en un nervio confiable para examinar la regeneración de NMJs entre animales y a través de diferentes tratamientos. El nervio fibular común tiene un curso anatómico predecible, ya que recorre el tendón de la cabeza lateral del músculo gastrocnemio en la rodilla, y la intersección sirve como un punto de referencia estable para las lesiones. Se accede al nervio a través de una incisión pequeña y mínimamente invasiva cerca de los músculos de interés, pero anatómicamente segregada de ellos. Los hallazgos presentados aquí demuestran que los axones motores en regeneración comienzan a reformar los NMJ en el músculo extensor largo de los dedos (EDL) 8 días después de aplastar el nervio peroné en ratones hembra adultos jóvenes de 70 días de edad. Es importante destacar que el patrón y la tasa de reinervación son consistentes entre animales de la misma edad y sexo y, por lo tanto, proporcionan un modelo de lesión confiable que acelerará significativamente nuestra comprensión de los cambios celulares y moleculares necesarios para mantener y reparar las NMJ.
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Protocolo
Todos los experimentos se llevaron a cabo bajo las directrices del NIH y los animales protocolos aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Institucional de Virginia Tech.
1. Los animales se preparan para la cirugía
- Anestesiar los ratones con una mezcla de ketamina (90 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) mediante inyección subcutánea inguinal con un 1 ml jeringa de insulina estéril. solución portadora contiene una mezcla de 0,9% de solución salina, 17,4 mg / ml de ketamina, y 2,6 mg / ml de xilazina. Coloque de nuevo los animales en jaulas a la espera de la medicación surta efecto.
NOTA: Si la dosis de carga no proporciona anestesia suficientes para la duración del procedimiento, un 25% adicional de la dosis de carga se puede inyectar. - Seguir los animales después de la inyección para comprobar la frecuencia respiratoria y la depresión constante adecuada de los niveles de excitación. Comprobar el nivel de excitación con una pizca pata trasera, lo que debería provocar ninguna respuesta cuando anestesiado suficientemente.
NOTA: Esto suele tardar 3-5min para un ratón adulto joven con un promedio de 25 a 30 g. Si el animal es todavía sensible después de la inyección posterior 10 min, un 25% adicional de la dosis de carga anestésico se puede inyectar. - Aplicar vaselina y aceite mineral ligero pomada oftálmica a los ojos del animal para evitar la sequedad. Retirar los animales de la jaula y el lugar sobre una superficie limpia y plana. Afeitar el miembro posterior deseada del pie a la pelvis usando un cortador de pelo eléctrico, exponiendo sólo el aspecto lateral de la extremidad.
- Aplique un removedor de pelo química al sitio afeitado durante 1 min. quitar manualmente el cabello utilizando toallitas de laboratorio. Limpiar la zona depilada con el laboratorio trapo empapado en etanol.
2. Procedimiento Quirúrgico
- Esterilizar instrumentos quirúrgicos a través de autoclave u otro método apropiado. Limpiar la zona quirúrgica y tabla quirúrgica con un 80% de etanol / H 2 0. Desinfectar el sitio quirúrgico con proviodine. Coloque el ratón a bordo quirúrgica y se alinean con las restricciones de las extremidades. Guardarla extremidad posterior de destino en una posición anatómicamente natural con la articulación de la rodilla ligeramente extendida sin rotación interna o externa.
- Lugar de los animales y la tabla bajo el microscopio quirúrgico. Orientar al sitio de la incisión adecuada mediante palpación de puntos superficiales, específicamente la articulación de la rodilla y de la cresta ósea entre los músculos gemelos y tibial anterior.
- Hacer una incisión de aproximadamente 3 cm a través de la piel con un bisturí o tijeras de primavera, mientras que el uso de fórceps generales para el agarre. Hacer la incisión perpendicular al supuesto subyacente del nervio peroneo común.
- Continuar la incisión a través de la fascia superficial, exponiendo el bíceps femoral y los músculos vasto lateral. Separar estos músculos mediante el corte a través de la fascia profunda conexión. Un 1-2 cm de corte debe ser suficiente.
- Repliegue del músculo bíceps femoral caudal utilizando retractores mecánicos, dejando al descubierto el nervio peroneo común.
- Trace el nervio proximal hasta su intersección con el tendón de la cabeza lateral del músculo gastrocnemio se encuentra. Nota: La exposición puede requerir la manipulación adicional de la piel y el músculo retraído. Esta intersección se usa como punto de referencia estable para la lesión del nervio.
- Agarre el nervio con unas pinzas finas, alineando la punta de un modo paralelo al borde lateral del tendón del gastrocnemio. Aplastar el nervio peroneo común mediante la aplicación de presión constante, dura durante 5 segundos.
- Corroborar completo aplastamiento del nervio mediante inspección visual a través del ámbito quirúrgico. Se aparecerá translúcida en el sitio de la lesión. Si el uso de ratones que expresan proteínas de fluorescencia en los axones periféricos, la fluorescencia desaparece del lugar de la lesión.
- Retire retractores y realinear los músculos en sus posiciones anatómicas. Cerrar el sitio de la incisión con suturas de seda 6-0. 1-3 suturas interrumpidas simples son suficientes. Coloque recuperación del ratón sobre una almohadilla térmica en una jaula limpia.
- Supervisión de todos los animales de 2 horas después de la óperación para comprobar la respiración y cualquier reacción adversa a la anestesia. Administrar una dosis inicial de buprenorfina 0,05-0,10 mg / kg mediante inyección subcutánea inguinal inmediatamente después de la recuperación de la cirugía. Dar a 3 dosis adicionales cada 12 h durante las siguientes 48 horas. Después de la recuperación total, los ratones regresar a las instalaciones de cuidado de animales.
3. El aislamiento y la tinción de extensor largo de los dedos (EDL) Músculos
- Sacrificar animales utilizando isoflurano. Coloque 0.5 ml isoflurano líquido en un tubo de 50 ml lleno de labwipes absorbentes. Se coloca el tubo destapado con el animal en una cámara de 2.500 cm 3 sellada. Al menos 4 min de exposición es suficiente. Prueba para la pérdida de palpebral bilateral, dedo del pie para los dedos, y los reflejos de estricción de rabo para asegurar que cada animal está inconsciente antes de proceder con la perfusión.
- Transcardially perfundir 16 animales primero con 10 ml 0,1 M PBS, a continuación, 25 ml de paraformaldehído al 4% en PBS 0,1 M (pH 7,4). Heparina (30 unidades / 20g de peso del animal) se puede añadir con PBS (10 unidades / ml) para prevenir la coagulación de la sangre en pequeños lechos capilares, mejorar los resultados de perfusión.
- Retire la piel que cubre extremidades traseras mediante el uso de tijeras para cortar transversalmente a través de la piel alrededor de la circunferencia del abdomen. Pelar abajo la piel más allá de las extremidades traseras y los pies con unas pinzas.
- Retire la fascia superficial de las extremidades traseras agarrando y se pela con un fórceps. Si el uso de ratones que expresan proteínas de fluorescencia en los axones periféricos, posterior a solucionar los ratones toda la noche en PFA al 4% en tubos de 50 ml. Enjuague tres veces con PBS.
NOTA: Se ha corregido los ratones pueden ser almacenados en PBS a 4 ° C. Si no es así, omita este paso y vaya al paso 3.6 y sin animales de arreglo de correos. - Diseccionar los músculos EDL 18 de las patas traseras del ratón, asegurándose de mantener proximal y distal tendones lo más intacta posible.
- Incubar músculos EDL en tampón de bloqueo (1x PBS que contenía 0,5% de Triton X-100, 3% de BSA y suero de cabra al 5%) durante al menos 1 hr.
- Para visualizar los axones motores y sus terminales nerviosas, lugar músculos en tubos que contienen neurofilamentos (1: 1000) y sinaptotagmina-2 (1: 250) anticuerpos diluidos en tampón de bloqueo durante 3 días. Lavar los músculos tres veces con PBS 1x y 10 minutos cada vez. Nota: omitir este paso si el uso de ratones que expresan proteínas de fluorescencia (XFP) en los axones periféricos.
- Manchar el contralateral ileso EDL como un control positivo para la completa inervación NMJ. Los controles negativos deben incluir un EDL obtenida a los 4 días después de la lesión, un punto de tiempo en el que el NMJ es completamente denervado, así como un EDL se tiñeron con anticuerpo secundario solamente.
- Incubar los músculos con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia apropiados para detectar los neurofilamentos y sinaptotagmina-2 por 1 día. Lavar los músculos tres veces con PBS 1x y 10 minutos cada vez. Nota: Este paso puede llevarse a cabo en conjunto con el paso 3,10. Omitir este paso si el uso de ratones que expresan proteínas de fluorescencia en los axones periféricos.
- Para visualizar el postsyregión Naptic de la NMJ, incubar músculos con 5 mg / ml Alexa-555 conjugado de alfa-bungarotoxina diluido en tampón de bloqueo durante al menos 2 hr. Lavar los músculos tres veces con PBS 1x y 10 minutos cada vez.
- Para montar músculos enteros en portaobjetos de vidrio cargados positivamente, colocar el músculo directamente en la diapositiva, añadir unas gotas de glicerina basado en la diapositiva medio de montaje y cubrir con un cubreobjetos. Pulse el cubreobjetos contra la corredera para aplanar el músculo. Empapa del medio de montaje desde el perímetro de la diapositiva y cubreobjetos utilizando toallitas de laboratorio. Aplicar esmalte de uñas para sellar los bordes entre el cubreobjetos y portaobjetos.
4. Análisis de los datos de imagen y
- Para analizar la estructura de NMJs, la imagen del músculo EDL utilizando un microscopio láser confocal de barrido equipado para excitar a 488, 555 y 633 nm de luz y capturar la luz emitida con 20X y 40X.
- Para visualizar NMJs conjunto, crear imágenes de proyección de intensidad máxima de seg ópticaciones espaciadas 1 a 2 micras se extiende aparte de los más bajos a regiones más altas visibles de la UNM. Crear proyecciones de máxima intensidad utilizando software de imagen disponible en el mercado.
- Para determinar las tasas de reinervación, clasificar NMJs como: 1) completamente denervado = sitio postsináptica está completamente desprovisto de contacto con axón, a menos de 5% colocalización entre el axón y AChR. 2) parcialmente inervado = el axón se solapa parcialmente el postsynapse, 5-95% colocalización entre el axón y AChR. 3) inervación completa = casi perfecta aposición entre el pre y post-sinapsis, más de un 95% colocalización entre el axón y AChR. Excluir NMJs que se encuentran perpendiculares al plano de la imagen o no se visualizan totalmente en la imagen. Nota: En todos estos experimentos, al menos 3 animales y 50 NMJs por animal fueron examinados. Los resultados se consideraron significativos utilizando un test t de Student con un valor de p menor de 0,05.
- Para cegar el operador, los individuos pueden realizar por separadola cirugía y análisis de imágenes. Sin el conocimiento de los grupos de tratamiento, el analizador puede ser objetivo con NMJ de puntuación. Alternativamente, las imágenes pueden ser asignados al azar y se presentan al operador para el análisis sin el conocimiento del animal fuente.
5. PCR cuantitativa
- Sacrificar los animales, utilizando isoflurano y dislocación cervical. Retire la piel y fascia superficial que cubre músculos de la pierna según la etapa 3.3. Diseccionar músculos EDL según la etapa 3.4 tibial anterior y.
- Flash congelar todo el tibial anterior y los músculos EDL en un tubo de 1,5 ml de nitrógeno líquido. Extraer tejido del tubo y colocar en un mortero previamente enfriado parcialmente sumergido en nitrógeno líquido. Moler músculo congelado en un polvo fino usando un mortero y mano de mortero.
- Disuelva el polvo músculo congelado en un reactivo de extracción de ARN comercialmente disponible y realizar la extracción de ARN y la extracción de ADN genómico con un kit disponible comercialmente de acuerdo con i del fabricanterecauciones.
- Realizar la transcripción inversa con una mezcla de transcriptasa inversa disponible en el mercado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Realizar qPCR utilizando un kit disponible comercialmente usando genes de limpieza adecuados (véase el cuadro de materiales). Use un termociclador de PCR cuantitativa disponible en el mercado para llevar a cabo la PCR (véase la tabla de materiales).
- Ajuste la temperatura de recocido a 58 ° C. Ajustar parámetros de los ciclos adicionales en las especificaciones del fabricante de la mezcla verde taq polimerasa / SYBR. Incluir un paso final curva de fusión en el programa de termociclador que consiste en 0,5 ° C aumentos incrementales de 65 ° C a 95 ° C para probar la especificidad del cebador y el cebador formación de dímeros.
- Determinar los niveles de expresión del ARNm de la 2 - método ΔΔCT 21 usando ARN 18S como gen de control.
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Resultados
El nervio peroneo común, también llamado nervio peroneo común, surge del nervio ciático por encima de la fosa poplítea, donde se hace pivotar alrededor de la cabeza del peroné a la cara anterior de la pierna (Figura 1A). No se ramifica en los nervios peroneo superficial y profunda, junto suministro de los flexores dorsales del pie y los dedos (tibial anterior, extensor largo de los dedos y corto, y halluces músculos extensores largo del dedo gordo), y los everters del pi...
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Discusión
El método presentado en este manuscrito ofrece oportunidades únicas para identificar los mecanismos implicados en la reparación de las uniones neuromusculares (NMJ). Este método implica la trituración el nervio peroneo común a medida que pasa sobre el tendón gastrocnemio cerca de la rodilla. Se demuestra que después de sólo 5 segundos de compresión de los nervios con una pinza, una degeneración completa se observó por 4 días después de la lesión. En los ratones adultos jóvenes, los axones alfa-motoras comienzan a reiner...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a los miembros del laboratorio de Valdez por sus aportes intelectuales en los experimentos y comentarios sobre el manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ketamina | VetOne | 501072 | |
| Xilacina | Lloyd Inc. | 003437 | |
| Buprenorfina | Zoopharm | 1Z-73000-150910 | |
| Nair | Nair | ||
| Kim-wipes | Kimtech | 34155 | |
| Maquinilla de afeitar eléctrica | Braintree Scientific | CLP-64800 | |
| 80% EtOH/H20 | |||
| 10% Proviodine | |||
| 1 ml Jeringa | |||
| Tijeras de resorte | Vannas | 91500-09 | |
| No. 15 bisturí | Braintree Scientific | SSS 15 | |
| #5 Pinzas | Dumont | 11252-00 | |
| 6-0 sutura de seda en aguja de corte inverso | Sutura Express | 752B | |
| Almohadilla térmica para roedores | Braintree Scientific | AP-R-18.5 | |
| sondas moleculares | conjugadas alfa-BTX | B35451 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Microscopio estéreo con zoom Olympus | 562037192 | ||
| Olympus Zeiss 700 Microscopio confocal | Zeiss | ||
| Bomba de perfusión peristáltica de caudal variable | Fisher Scientific | 13-876-3 | |
| Aurum ARN Total Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | |
| Bio-Rad iScript RT Supermix | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoFast Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1725200 | |
| Bio-Rad CFX96 | Bio-Rad | 1855196 | |
| Puralube Ungüento | veterinarioPuralube | 1621 | |
| Sinaptotagmina-2 anticuerpo | Anticuerpos-Online | ABIN401605 | |
| Neurofilamento anticuerpo | Anticuerpos-Online | ABIN2475842 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
