Hemos desarrollado un método de lesión nerviosa para examinar de forma fiable la reinervación muscular y, por tanto, la regeneración de las uniones neuromusculares en ratones. Esta técnica consiste en lesionar el nervio fibular común mediante una cirugía sencilla y altamente reproducible. La reinervación muscular se evaluó mediante el montaje completo del músculo extensor largo de los dedos.
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Artículo de método
El nervio peroneo Método de lesiones: un ensayo fiable para identificar y Factores de prueba de que la reparación neuromusculares uniones
En este artículo
Resumen
Resumen
La unión neuromuscular (UNM) sufre cambios estructurales y funcionales deletéreos como resultado del envejecimiento, lesiones y enfermedades. Por lo tanto, es imprescindible para entender los cambios celulares y moleculares implicados en el mantenimiento y la reparación de NMJs. Para este propósito, hemos desarrollado un método para examinar fiable y consistente regeneración NMJs en ratones. Este método consiste en la lesión del nervio de aplastamiento del nervio peroneo común, ya que pasa por encima de la cabeza lateral del tendón del músculo gemelo cerca de la rodilla. Utilizando viejos ratones hembra de 70 días, se demuestra que los axones motores comienzan a reinervar objetivos postsinápticos anteriores dentro de los 7 días posteriores a aplastamiento. Que reingresen completamente sus áreas sinápticas anteriores por 12 días. Para determinar la fiabilidad de este método de la lesión, se compararon las tasas de reinervación entre 70 días de edad ratones hembras individuales. Se encontró que el número de sitios postsinápticos reinervados fue similar entre los ratones a los 7, 9, y 12 días post-aplastamiento. Para determinar sieste ensayo lesión también se puede utilizar para comparar los cambios moleculares en los músculos, se examinaron los niveles de la subunidad gamma del receptor nicotínico muscular (gamma-AChR) y la cinasa específica de músculo (MuSK). La subunidad gamma-AChR y almizcle que están altamente regulados por incremento tras la denervación y vuelven a los niveles normales después de la reinervación de NMJs. Hemos encontrado una estrecha relación entre los niveles de transcripción de estos genes y el estado de la inervación de los músculos. Creemos que este método se acelerará la comprensión de los cambios celulares y moleculares implicados en la reparación de la NMJ y otras sinapsis.
Introducción
En animales adultos jóvenes y sanos, la unión neuromuscular (NMJ) es una conexión altamente estable entre la presinapsis, la terminación nerviosa de un axón α motor, y la postsinapsis, la región especializada de una fibra muscular extrafusional donde los receptores nicotínicos de acetilcolina (AChRs) se agregan selectivamente1. La aposición casi perfecta de los aparatos pre y postsinápticos es necesaria para la correcta neurotransmisión, la supervivencia de las neuronas motoras α y las fibras musculares y la función motora. Desafortunadamente, la función de la NMJ se ve afectada negativamente por el envejecimiento, enfermedades como la esclerosis lateral ....
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Protocolo
Todos los experimentos se llevaron a cabo bajo las directrices del NIH y los animales protocolos aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Institucional de Virginia Tech.
1. Los animales se preparan para la cirugía
- Anestesiar los ratones con una mezcla de ketamina (90 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) mediante inyección subcutánea inguinal con un 1 ml jeringa de insulina estéril. solución portadora contiene una mezcla de 0,9% de solución salina, 17,4 mg / ml de ketamina, y 2,6 mg / ml de xilazina. Coloque de nuevo los animales en jaulas a la espera de la medicación surta efecto.
NOTA: Si la dosis de carga no proporciona ....
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Resultados
El nervio peroneo común, también llamado nervio peroneo común, surge del nervio ciático por encima de la fosa poplítea, donde se hace pivotar alrededor de la cabeza del peroné a la cara anterior de la pierna (Figura 1A). No se ramifica en los nervios peroneo superficial y profunda, junto suministro de los flexores dorsales del pie y los dedos (tibial anterior, extensor largo de los dedos y corto, y halluces músculos extensores largo del dedo gordo), y los everters del pi.......
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Discusión
El método presentado en este manuscrito ofrece oportunidades únicas para identificar los mecanismos implicados en la reparación de las uniones neuromusculares (NMJ). Este método implica la trituración el nervio peroneo común a medida que pasa sobre el tendón gastrocnemio cerca de la rodilla. Se demuestra que después de sólo 5 segundos de compresión de los nervios con una pinza, una degeneración completa se observó por 4 días después de la lesión. En los ratones adultos jóvenes, los axones alfa-motoras comienzan a reiner.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a los miembros del laboratorio de Valdez por sus aportes intelectuales en los experimentos y comentarios sobre el manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ketamina | VetOne | 501072 | |
| Xilacina | Lloyd Inc. | 003437 | |
| Buprenorfina | Zoopharm | 1Z-73000-150910 | |
| Nair | Nair | ||
| Kim-wipes | Kimtech | 34155 | |
| Maquinilla de afeitar eléctrica | Braintree Scientific | CLP-64800 | |
| 80% EtOH/H20 | |||
| 10% Proviodine | |||
| 1 ml Jeringa | |||
| Tijeras de resorte | Vannas | 91500-09 | |
| No. 15 bisturí | Braintree Scientific | SSS 15 | |
| #5 Pinzas | Dumont | 11252-00 | |
| 6-0 sutura de seda en aguja de corte inverso | Sutura Express | 752B | |
| Almohadilla térmica para roedores | Braintree Scientific | AP-R-18.5 | |
| sondas moleculares | conjugadas alfa-BTX | B35451 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Microscopio estéreo con zoom Olympus | 562037192 | ||
| Olympus Zeiss 700 Microscopio confocal | Zeiss | ||
| Bomba de perfusión peristáltica de caudal variable | Fisher Scientific | 13-876-3 | |
| Aurum ARN Total Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | |
| Bio-Rad iScript RT Supermix | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoFast Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1725200 | |
| Bio-Rad CFX96 | Bio-Rad | 1855196 | |
| Puralube Ungüento | veterinarioPuralube | 1621 | |
| Sinaptotagmina-2 anticuerpo | Anticuerpos-Online | ABIN401605 | |
| Neurofilamento anticuerpo | Anticuerpos-Online | ABIN2475842 |
Referencias
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nat. Rev. Neurosci. 2 (11), 791-805 (2001).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J.
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Reimpresiones y permisos
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