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Summary

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

Abstract

Los macrófagos y células dendríticas (DC) son células inmunes innatas que se encuentran en tejidos y órganos linfoides que juegan un papel clave en la defensa contra los patógenos. Sin embargo, son difíciles de aislar en número suficiente para estudiar en detalle, por lo tanto, los modelos in vitro se han desarrollado. Cultivos in vitro de macrófagos derivados de médula ósea y células dendríticas son valiosos métodos bien establecidos y para estudios inmunológicos. Aquí, se describe un método para el cultivo y la identificación de ambos DCs y macrófagos a partir de un único cultivo de células de médula ósea primaria de ratón utilizando el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos de citoquinas (GM-CSF). Este protocolo se basa en el procedimiento establecido primera desarrollada por Lutz et al. en 1999 para los países en desarrollo derivadas de médula ósea. El cultivo es heterogénea, y MHCII y hialuronano fluoresceinado (FL-HA) se utilizan para distinguir los macrófagos de CD inmaduras y maduras. Estos GM-CSF derivado macrófagos procionar una fuente conveniente de in vitro macrófagos derivados que se parecen mucho macrófagos alveolares tanto en fenotipo y la función.

Introduction

Varios métodos de cultivo in vitro se han descrito para generar macrófagos de médula derivadas de médula (BMDMs) y las DC derivadas de médula ósea (BMDCs) utilizando uno o una combinación de factores de crecimiento. BMDMs se puede generar mediante el cultivo de células de médula ósea usando factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) o GM-CSF ^1,2. Para BMDCs, la adición de ligando FLT3 para el cultivo de médula ósea da lugar a DCs plasmacitoides clásicos y no adherentes (CD11c ^alta MHCII ^alta y CD11c ^lo /, B220 ^+, respectivamente) después de 9 días en cultivo ^3,4. En contraste, las células no adherentes generan después de 7 a 10 días en cultivo con GM-CSF solo ^5,6, GM-CSF e IL-4 ^7, o GM-CSF y FLT3 ligando ^8,9 generan BMDCs se parece más a los países en desarrollo inflamatorias ^(alta CD11c, CD11b ⁺ MHCII ^{alta) 10.} Si bien se utilizan estos cultivos in vitro para generar los macrófagos oLos países en desarrollo, no está claro si cada cultura da lugar a poblaciones puras. Por ejemplo, aunque se describen las células adherentes en los cultivos GM-CSF para ser macrófagos ^5, las células no adherentes de la misma cultura se utilizan como los DC ^6,11-13, con la presunción de que son homogéneos y cualquier variabilidad observada es debido a las diferentes etapas de desarrollo ^14,15. Además, los estudios han encontrado GM-CSF para ser un factor de crecimiento esencial para el desarrollo de los macrófagos alveolares in vivo ^16,17, y se pueden utilizar in vitro para generar los macrófagos alveolares como ^16,17,18.

Aparte de la adhesión, los procedimientos para la generación de los macrófagos y los países en desarrollo de cultivos de médula ósea tratados con GM-CSF son muy similares sugiriendo heterogeneidad puede existir dentro de cultivos de médula ósea de GM-CSF. De hecho, esto parece ser el caso como dos documentos informan de la presencia de BMDMs en la fracción no adherente de las culturas BMDC. En uno de papel, que identified una población de células como CD11c ^+, CD11b ^+, MHCII ^mediados, MerTK ⁺ y CD115 ^+, que expresa una expresión genética que se parecía más estrechamente los macrófagos alveolares y tenía una capacidad reducida para activar las células T ^19. El segundo papel utilizado MHCII y FL-HA para identificar una población de macrófagos alveolares similar (CD11c ^+, MHCII ^{media / baja,} FL-HA ^{de alto)} que era distinta de inmaduros (CD11c ^+, MHCII ^mediados, FL-HA ^baja) y madura DC (CD11c ^+, MHCII ^alta), tanto fenotípicamente y funcionalmente ^18. Estos documentos ilustran que ambos cultivos GM-CSF BMDC son heterogéneos, que contiene tanto los macrófagos y DC poblaciones que indica que se debe tener cuidado al interpretar los datos a partir de cultivos de BMDC.

Este protocolo describe cómo aislar de la médula ósea, células de médula ósea en cultivo GM-CSF, e identificar el alveolar similar a macrófagospoblación de los países en desarrollo inmaduro y maduros en el cultivo de médula ósea mediante citometría de flujo utilizando la unión y la expresión MHCII FL-HA. Este procedimiento se basa en el procedimiento establecido de Lutz et al ⁶ y es capaz de generar. 5 – 10 x 10 ⁶ células no adherentes en el día 7 de un cultivo de 10 ml. El cultivo se puede utilizar desde días 7 a 10 y se obtiene una población heterogénea de macrófagos, células dendríticas inmaduras y maduras, así como algunos progenitores en el día 7. Esto proporciona un método simple para crecer y aislar in vitro macrófagos alveolares-como en grandes cantidades.

Protocol

Los ratones fueron sacrificados de acuerdo con el Consejo Canadiense para el manejo de estos animales para la investigación con animales ética mediante procedimientos aprobados por la Universidad de Cuidado de Animales Columbia Británica. 1. La adquisición de una sola célula de médula ósea de ratón Suspensión de fémur y tibia Cambiar en una cabina de seguridad biológica (BSC) 15 minutos antes de comenzar el procedimiento para purgar el aire del gabinete y permitir la estabilización del flujo de aire, superficie BSC continuación, limpia / el aerosol con un 70% de etanol. Mantener todo lo más estéril posible para la totalidad del protocolo. No cortar los huesos en condiciones no estériles. Preparar herramientas de disección por inmersión en etanol al 70% (1 par de tijeras de disección, 2 pares de pinzas), solución salina equilibrada de Hank con 5% de suero de ternera fetal (HBSS-FCS), placas de Petri estériles (100 mm x 15 mm), 1 jeringas ml, 26½ agujas de calibre, tubos de recogida cónicos (15 ml o 50 ml), y toallas de papel en el BSC. La eutanasia del ratón usandolos protocolos aprobados por el comité de ética de la investigación institucional de animales. Poner en el BSC, colocar en la parte superior de una o dos toallas de papel y rociar el ratón con un 70% de etanol. En el BSC, abra una asépticamente estéril placa de Petri, alícuota de 10 ml de HBSS-FCS a la base y de 1 – 2 ml a la tapa. Coloca el ratón sobre su estómago con la espalda hacia arriba y levantar la piel alrededor de las secciones torácica con los dedos de la mano no dominante. Use las tijeras para hacer una incisión en la piel se tersa. Aferrarse a ambos extremos de la corte, un extremo con cada mano y con cuidado separar la piel alrededor del ratón desde la parte posterior al estómago, continuará tirando hasta dos extremos de la incisión se reúnen en el estómago. Da la vuelta al ratón para el estómago hacia arriba, y con una mano tire de la mitad inferior de la piel hacia abajo hacia la pierna, seguir tirando hacia atrás la piel hasta que las patas están expuestos. Mantenga los pies del ratón hacia arriba y cortar los tendones de Aquiles por encima de la articulación del tobillo ylos ligamentos que conectan los músculos a los pies en el extremo inferior de la tibia con unas tijeras. Esto afloja los pies de los huesos de la pierna. Mientras sostiene la pata por el pie, cortar los músculos y ligamentos con tijeras todo alrededor de la articulación de la rodilla en el extremo inferior del fémur para cortar los músculos del muslo de la pierna inferior. El uso de fórceps para tirar suavemente los músculos aflojados lejos del peroné y superficies femorales. Tenga cuidado de no cortar la arteria femoral para evitar el sangrado abundante. Con una mano se aferra a los pies, prensa tijeras abajo abierto en el extremo superior del fémur en la articulación de la cadera, rotar la pierna y tirar suavemente para separar el fémur de la articulación de la cadera durante el uso de las tijeras para hacer el corte final a la libre la pierna del cuerpo. Desde este punto en adelante, solamente mantener el tejido con pinzas estériles. Aferrarse a la pierna en un extremo y sacar el pie en el otro. NOTA: Esto no debería requerir mucha fuerza, como ligamentos que conectan se cortan en el paso1.9. Alternativamente, cortar la tibia justo por encima del tobillo en el que se fusiona el hueso. Mantenga la pierna por el extremo distal del fémur con un juego de fórceps y el extremo proximal de la tibia y el peroné con otra, doblar cuidadosamente la tibia y el peroné en la dirección opuesta de la articulación de la rodilla para separarlos de fémur y la rótula. El uso de fórceps para tirar hacia abajo los ligamentos y los músculos que quedan todavía unido a los huesos inferiores de la pierna. Aquí, retire el peroné junto con los tejidos conectivos con pinzas, ya que es demasiado pequeño para ser lavado para células de la médula ósea. Coloque la tibia limpiado en la tapa invertida placa de Petri. Mantenga el extremo inferior del fémur con un juego de fórceps y la rótula con otra, doblar la rótula y los tejidos circundantes en la dirección opuesta de la articulación para su eliminación. Después se limpia restante tejidos conectivos del fémur; tirar a la basura con fórceps, y colocarlo en la tapa invertida placa de Petri. Desechar la rótula. repetir 1,7- 1.13 con la otra pierna, si es necesario. La transferencia de los huesos de 1,6 ml tubos de microcentrífuga que contiene 1 ml de HBSS estéril-FCS para el transporte si es necesario. Coloque los huesos en la tapa de la placa Petri invertida, con 1 – 2 ml de HBSS-FCS, el uso de fórceps para limpiar cualquier tejido residual todavía unido a la tibia y el fémur, a continuación, transferir los huesos a la base de placa de Petri que contiene 10 ml de HBSS FCS. Alternativamente, limpiar los huesos y eliminar el tejido muscular unida mediante un tejido empapado de etanol al 70%. Cortar cada uno de los huesos por la mitad con unas tijeras. Parcialmente proteger la placa de Petri con una tapa estéril durante el corte para asegurar que los huesos se mantengan en el plato. Alternativamente, cortar el extremo de cada hueso que permite la purga en la siguiente etapa. Una el 26½ aguja G en la jeringa de 1 ml, y elaborar 1 ml de HBSS-FCS de la placa de Petri. Inserte la punta de la aguja en el extremo de un trozo de hueso y eliminar las células de la médula ósea (tejido rojo suave dentro de los huesos). Insertar la aguja en la cabezadel hueso y el extremo abierto, hasta que se quite toda la médula de color rojo. Observar los huesos de color blanco. Pasar los grumos visibles de la médula ósea a través de la jeringa un par de veces para formar una sola suspensión celular. Desechar los huesos enrojecidas. Usar una pipeta de 10 ml para mezclar la suspensión de células bien y transferir al tubo de recogida. Enjuagar la placa de Petri una vez con 5 ml de HBSS-FCS para recoger las células residuales en el plato. Colocar las células en hielo. NOTA: La suspensión de células de médula ósea es todavía viable si se almacena por 2 – 3 horas a 4 ° C. 2. Chapado y cultivo de células de médula ósea (BMC) Preparar los siguientes reactivos y materiales de construcción. Preparar tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) haciendo cloruro de amonio 0,84% en una solución final de 2 mM Tris pH 7,2, y luego esterilizar por filtración a través de un filtro de 0,2 micras. Preparar medios BMC mediante la adición de 10% de FCS, HEPES 20 mM, 1x aminoácido no esencial, 55 y #181; M 2-mercaptoetanol, 50 U / ml de penicilina y estreptomicina, piruvato de sodio 1 mM, y 2 mM L-glutamina al medio RPMI 1640. Obtener disponible comercialmente GM-CSF recombinante o usar GM-CSF que contiene sobrenadante de células de mieloma AG8.653 transfectadas con el gen de GM-CSF 20. Determinar la concentración de GM-CSF en el sobrenadante por ELISA y añadir el equivalente a 20 ng / ml a los medios de BMC. Centrifugar las células de médula ósea a 314 xg durante 5 min. El sedimento es rojo, debido a los glóbulos rojos. En el BSC, aspirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio estéril unida a la succión del vacío, afloje el sedimento tocando, a continuación, añadir 10 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos. Vortex para resuspender las células y se incuba en tampón de lisis RBC a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir 10 ml de HBSS-FCS a continuación, girar las células a 314 xg durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Observe el sedimento celular como el color blanco. Resuspender las células en volumen deseado de los medios de BMC. Contar el resuspended células utilizando un hemocitómetro después de teñir las células muertas con 0,4% de azul de tripano. NOTA: Si se utiliza la médula ósea de una pierna (solo la tibia y el fémur), se vuelve a suspender en 5 ml de medio de BMC, tomar 10 l de suspensión celular y se diluye con 70 l de 0,4% azul de tripano, mezclar bien y la transferencia de 10 l de la dilución 1/8 de células a la cámara de hemocitómetro. Contar las células viables en cuatro cuadrantes: el promedio de los cuatro cargos cuadrante x factor de dilución x 10 4 = número de células por ml. Un fémur y una tibia de una pierna lo general, resultados aproximadamente de 2 – 4 x 10 7 células después de la lisis de glóbulos rojos. Estimar el número de 10 ml platos de cultivos de médula ósea necesarias para los experimentos de aguas abajo basado en el número total de células necesarias para los experimentos en el final del cultivo. NOTA: Cada plato requiere 2 x 10 6 células de médula ósea de siembra inicial y los rendimientos de 5 – 10 x 10 6 células en el día 7. Aliquot el número total de células para el recubrimiento en un nuevo tubo, girar hacia abajo a 314 xg durante 5 min, aspirar el sobrenadante, y resuspender las células en 4 x 10 6 células / ml en medio BMC. Prepare un nuevo 100 mm estéril x 15 mm placa de Petri con 9,5 ml de medio de BMC que contiene 200 ng de GM-CSF (recombinante o de GM-CSF que contiene sobrenadante). Añadir 500 l de las células de médula ósea 4 x 10 6 células / ml en el centro de la placa de Petri para la concentración final de 2 x 10 5 células / ml en 10 ml. NOTA: Es importante no utilizar una placa de Petri estéril de una placa de cultivo de tejidos. Además, cuando la adición de las células, las células garantizar siguen concentradas en el centro y minimizar las molestias a los platos después de la siembra y durante los cambios de los medios de comunicación. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2. Este es el día 0 en la cultura. El día 3, se añaden 10 ml de medio fresco que contenía BMC 200 ng de GM-CSF a cada placa de células. Tener cuidado para minimizar la perturbación of las células concentradas en suspensión. Volumen total de cultivo celular es ahora de 20 ml. Observar las células bajo el microscopio óptico con un aumento de 100X. Observar numerosas células no adherentes (redondos) y unas pocas células adherentes (planas). Las células en grupos de tres o cuatro pétalos que se asemejan de una flor se puede ver, lo que indica proliferación. En el día 6 realizar un cambio de la mitad de los medios de comunicación. Retirar con cuidado 10 ml de medio en un tubo cónico de 50 ml estéril, centrifugar a 314 xg durante 5 minutos, aspirar y descartar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en 10 ml de medio BMC frescas que contienen 20 ng / ml de GM-CSF, suavemente vórtice y añadir a la placa de cultivo celular original para un volumen total de 20 ml. Observar las células bajo el microscopio. NOTA: El día 7 de cultivo debe ser al 70% o mayor en la confluencia con células adherentes planas y densas nubes de células no adherentes redondas. 3. Recolección y Preparación BMDC y BMDMs por Citometría de Flujo <li> Mantenga todos los tampones a 4 ° C. Recoger las células de día 7 al día 10. Para cosechar las células, primera transferencia de 10 ml del sobrenadante del cultivo a un tubo de recogida cónico de 50 ml, a continuación, inclinar el plato vertical en aproximadamente 30 grados y se lava el plato pipeteando los restantes 10 ml de la cultura de la parte superior del plato. Repita este lavado 5 veces, cada vez rotación de la placa por tercera. La transferencia de los restantes 10 ml de células con el mismo tubo de recogida y desechar la placa y las células adherentes. NOTA: Los lavados se eliminar las células no adherentes y de baja adherencia; las células adherentes planas son resistentes a los lavados. Por lo general, entre 5 – Se espera que 10 x 10 6 células no adherentes de una placa en el día 7 y 2 – 5 x 10 6 células en el día 10, aunque Lutz et al. reportadas 10 x 10 6 células en el día 10. No se toman normalmente las células adherentes. Sin embargo, si estas células tienen que ser en comparación con las células no adherentes, Que se puede quitar de la siguiente manera. Añadir 5 ml de EDTA 0,7 mM en 1 x PBS, pH 7,4 a la placa después se retiran las células no adherentes, se incuba a 37 ° C durante 5 min, la pipeta hacia arriba y abajo para eliminar las células adherentes y recoger en un tubo separado. Centrifugar las células recogidas en 314 xg durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Volver a suspender en 5 ml de medio BMC estériles a 4 ° C y agitar suavemente para mezclar, y contar usando azul tripán y un hemocitómetro. NOTA: Cada plato rendirá 5 – 10 x 10 6 células no adherentes de un cultivo de 7 días. A partir de ahora, realizar todos los pasos a 4 ° C. Para el análisis de citometría de flujo, la transferencia de 2 x 10 5 células para cada muestra en 5 ml de poliestireno tubos de fondo redondo, añadir 300 l de tampón de FACS a 4 ° C (1x salina tamponada con fosfato, EDTA 2 mM y 2% de suero de albúmina bovina) a cada muestra. Girar las células hacia abajo a 314 xg durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Observar un sedimento blanco opaco visible en la parteparte inferior del tubo. Resuspender las células en 100 l de receptor Fc no marcado Ab para bloquear los receptores Fc de unión (Uso décimo sobrenadante de 2.4G2 producir la línea celular de mieloma) y se incuba durante 20 min a 4 ° C. A continuación, añadir 300 l de tampón de FACS a cada muestra, suavemente vórtice, a continuación, girar las células hacia abajo a 314 xg durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 100 l de CD11c-PeCy7 en 0.2 g / ml, azul Gr1-Pacífico en 0.25 g / ml, MHCII-APC en 0.05 g / ml, y FL-HA en aproximadamente 2 mg / ml para identificar los macrófagos y las DC. NOTA: FL-HA fue preparado en casa usando fluoresceína y sal sódica del ácido hialurónico cresta de gallo como se describió previamente 21. Incubar durante 20 min a 4 ° C para permitir la unión a la superficie celular. Añadir 300 l de tampón de FACS a cada muestra, suavemente vórtice, a continuación, girar las células hacia abajo a 314 xg durante 5 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante. NOTA: Si biotinylated anticuerpos se utilizan en 3.8, 3.8 repetir – 9 con fluorescente-estreptavidina. Lavar las células con otra 300 l de tampón de FACS, suavemente vórtice para mezclar y centrifugar las células a 314 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 200 l de tampón FACS que contiene 0,1 a 0,2 g por ml de yoduro de propidio o DAPI para marcar las células no viables. Las células están ahora listas para el análisis de citometría de flujo 22. NOTA: Ver resultados y la Figura 3 para más detalles de las poblaciones y cómo fueron con acceso a las células.

Representative Results

Un diagrama de flujo que resume los principales pasos de este método se muestra en la Figura 1. La densidad y morfología del cultivo de médula ósea en diferentes momentos del cultivo se muestra en la Figura 2. En el día 1, las células son pequeñas y escaso pero por día 3, hay más células, algunas son más grandes y algunos han comenzado a adherirse. Por día 6 hay un adherente definido y la fracción no adherente (Figura 2A). E…

Discussion

En este manuscrito, se proporciona un método para la generación de los macrófagos y las CD GM-CSF derivados de una sola cultivo de médula ósea de ratón que está adaptado de Lutz et al. ^6. MHCII expresión y FL-HA distingue entre países en desarrollo inmaduro y macrófagos vinculante en esta cultura (ver Figura 3C), que previamente ha sido difícil. Esto, junto con otro informe de Helft et al. ^19, demuestra la heterogeneidad dentro de las culturas BMDC indu…

Materials

Flow Cytometer	BD	LSR-II
Automated Inverted Microscope	Leica	DMI4000 B
Centrifuge	Thermo Fisher	ST-40R
Biosafety Cabinet	Nuaire	NU-425-600
Syringe 1 ml	BD	309659
26 1/2 Gauge Needle	BD	305111
50 ml Conical Tube	Corning	357070	*Falcon brand
Eppendorf tubes (1.5 ml)	Corning	MCT-150-C
5 ml polystyrene round bottomed tubes	Corning	352052
Dissection Tools	Fine Science Tools	*Various	*Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep
Hemocytometer	Richert	1490
Sterile 100 x 15 mm Petri Dish	Corning	351029	*Falcon brand
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher	21985-023
Ammonium Chloride	BDH	BDH0208-500G
Bovine Serum Albumin	Fisher Bioreagents	BP1600-1
Brefeldin A	Sigma	B7651-5MG
EDTA	Sigma	E5134-1KG	Ethylenediaminetetraacetic acid
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	16000-044
Hank's Balanced Salt Solution	Thermo Fisher	14175-095
HEPES	Thermo Fisher	15630-080	4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
L-Glutamine	Sigma	G8540-100G
LPS Ultrapure	Invivogen	tlrl-3pelps
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Thermo Fisher	11140-050
Penicillin/Streptomycin 100x	Thermo Fisher	15140-122
Potassium Phosphate Monobasic	BDH	BDH0268-500G
Potassium Chloride	BDH	BDH9258-500G
Recombinant GM-CSF	Peprotech	315-03-A
Rooster Comb Sodium Hyaluronate	Sigma	H5388-1G	*Used to make fluoresceinated hyaluronan
RPMI-1640	Thermo Fisher	21870-076	No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37oC before using.
Sodium Chloride	Fisher	5271-10
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	50876-1Kg
Sodium Pyruvate	Sigma	P5290-100G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Fisher Bioreagents	BP152-5
Trypan Blue	Sigma	T8154
Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant	N/A	N/A	Clone: 2.4G2
Anti-CD11c PeCy7	eBioscience	25-0114-82	Clone: N418
Anti-Gr-1 efluor450	eBioscience	48-5931-82	Clone: RB6-8C5
Anti-MHCII APC	eBioscience	17-5321-82	Clone: M5/114.15.2
Biotinylated Anti-MerTK	Abcam	BAF591	Goat polyclonal IgG
Streptavidin PE	eBioscience	12-4317-87
Propidium Iodide	Sigma	P4170-25MG
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Sigma	D9542-5MG