Complejo de polielectrolito para la unión a heparina de entrega osteogénico Factor de Crecimiento de dominio

Resumen

Los complejos de polielectrolitos (PEC) autoensamblados fabricados a partir de heparina y protamina se depositaron en perlas de alginato para atrapar y regular la liberación de factores de crecimiento osteogénicos. Esta estrategia de administración permite una reducción de 20 veces de la dosis de BMP-2 en aplicaciones de fusión espinal. Este artículo ilustra los beneficios y la fabricación de PEC.

Resumen

Durante cirugías reconstructivas óseas, cantidades suprafisiológicas de factores de crecimiento se cargan empíricamente en los andamios para promover la fusión ósea exitosa. Se requieren grandes dosis de agentes biológicos altamente potentes debido a la inestabilidad del factor de crecimiento como resultado de la rápida degradación enzimática, así como las ineficiencias de soporte en la localización de cantidades suficientes de factor de crecimiento en los sitios de implante. Por lo tanto, las estrategias que prolonguen la estabilidad de los factores de crecimiento, tales como BMP-2 / NELL-1, y controlan su liberación en realidad podría disminuir su dosis eficaz y, por tanto, reducir la necesidad de dosis mayores durante las futuras cirugías de regeneración ósea. Esto a su vez reducirá los efectos secundarios y costos de los factores de crecimiento. Los PEC autoensambladas se han fabricado para proporcionar un mejor control de la BMP-2 / NELL-1 a través de la entrega de unión a la heparina y el factor de mayor bioactividad crecimiento potencian mediante la mejora de la estabilidad in vivo. Aquí se ilustra la simplicidad de fabricación PEC que ayuda en la delivery de una variedad de factores de crecimiento durante las cirugías óseas reconstructivos.

Introducción

La incidencia de pseudoartrosis se ha reportado que ser tan alta como 10 a 45% en la fusión espinal degenerativa y revisión cirugías de columna ^1. Para reducir la tasa de pseudoartrosis durante la fusión columna vertebral y otras cirugías reconstructivas óseas, se han introducido factores de crecimiento osteogénicos tales como BMP-2, Nell-1 ¹ y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) para promover la osteogénesis de novo. Entre estos, BMP-2 es una opción popular para la fusión espinal ^2. Aunque la potencia de la BMP-2 en la inducción y facilitación de la formación de hueso nuevo ha sido bien establecida ^3; compli....

Protocolo

1. Preparación de la solución de alginato

1. Disolver 200 mg de alginato de sodio (no irradiado) o 400 mg de 8 Mrad irradió alginato de sodio en 10 ml de agua doblemente destilada y agitar durante 1 h para alginato no irradiado y 15 min para alginato irradiado. Almacenar la solución de alginato a 4 ° C durante la noche. Se filtra la solución de alginato con un filtro de jeringa de 0,2 micras estéril antes de la fabricación de microperlas de alginato.

Fabricación 2. El alginato Microbead

1. Desinfectar el generador de cuentas electrostática y la bomba de jeringa con 70% de etanol y colocarlos en una Clase II Gabinete ....

Resultados

En nuestro portador, protamina fue elegido como un sustituto de poli-L-lisina, ya que tiene propiedades químicas similares y está aprobado por la FDA como un antídoto de la heparina. resultados microscopio óptico mostró que las microperlas no irradiados eran de forma esférica con un diámetro de 267 ± 14 micras. (Boquilla de 0,35 mm, velocidad de flujo de 5 ml / hr y 5,8 kV). La mayoría de las microperlas irradiados son de forma de lágrima. El diámetro medido en la parte de vuelta de las .......

Discusión

Este protocolo presenta un método para la preparación de los PEC través de la capa por capa de autoensamblaje. La estructura de capa por capa se visualizó usando análogos fluorescentes de protamina, heparina, BMP-2 y Nell-1 y microscopía confocal. La captación y análisis de liberación muestran que la heparina sobre los PEC media la captación del factor de crecimiento osteogénico y liberación. La eficiencia de absorción del método PEC es: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. El portador PEC tiene una mejor modulación.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ciencias de la Vida Acrodisc 25  mm Filtro de jeringa con 0.2  y micro; m Membrana Supor	PALL	PN4612	Protamina estéril, solución de heparina por ultrafiltración
placa de 24 pocillos	Cell Star	662160
Placa de 96 pocillos Nuclon Delta Surface	Thermo Fisher Scientific	167008
(3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Bmuro de difeniltetrazolio), MTT	Sigma Aldrich	M5655	Medir la citotoxicidad de la acetona PEC-NELL-1
Fisher	Scientific	A/0600/17	Precipitado CF-405 Protamina marcada
Alamar Blue	Invitrogen, Life Technologies	DAL 1025	Medición de la citotoxicidad del kit de ensayo de
ensayo de fosfatasa alcalina (ALP)	Anaspec	AS-72146
Cloruro de amonio	Merck	Art 1145	Reactivo de parada en el marcaje FITC
Vitrogen de dimetilsulfóxido de dimetilo (DMSO) enaguado	, Life Technologies	D12345	Disolvente para isotiocianato I
dimetil sulfóxido fluorescente ( DMSO)	Sigma Aldrich		Disolver  formazan
Autoclave	Hirayama	HU-110	Esterilizar perlas de alginato por vapor
Beta-glicerofosfato	Sigma Aldrich	G9422
BMP-2 (Infusión de Injerto Óseo Kit II II)	Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, EE. UU	. 7510800	Factor de crecimiento osteogénico, se necesita diálisis para eliminar el componente estabilizador que interfiere con el acoplamiento FITC
Carboxibenzoilquinolina-2-carboxaldehído (CBQCA)	Thermo Fisher Scientific	A-6222	Para cuantificar el filtro de células de la proteína NELL-1
(100  y micro; m)	BD Science	352360	Hold PEC para el raspador de células del ensayo ALP
290   mm Ancho de la hoja 20  mm	SPL Life Science	90030	Separe la celda de la placa de 24 pocillos
CF 405S, Succinimidyl Ester	Sigma Aldrich	SCJ4600013	Colorante fluorescente azul para el marcaje de protaminas
CF 594, Hydrazide	Sigma Aldrich	SCJ4600031	Colorante fluorescente rojo intenso para el marcaje de heparina
Centrífuga	Beckman Coulter	Microfuge 22R
Microscopio Confocal	Olimpo	FV1000
Dexametasona	Sigma Aldrich	D4902	Componente del medio de crecimiento osteogénico
Columnas de desalinización de dextrano	Pierce (Thermo Scientific)	43230
DMEM	Gibco	12320
BMP-2 Quantikine ELISA Kit	R& Sistema	D DBP200	Determinar la liberación de BMP-2
Suero fetal bovino FBS	Hyclone	SV30160.03
Isotiociananato de fluoesceaína, isómero I	Sigma Aldrich	F7250	Colorante fluorescente verde para el etiquetado de NELL-1 y BMP-2 Insertos
cultivo celular ThinCert, para placas de 24 pocillos,	Greiner estéril	662630	Evita el lavado de PEC al cambiar el medio osteogénico
Bomba de jeringa Havard Appartus (11 plus)	Havard Apparatus	70-2208
n-Hexane (>99%)	Sigma Aldrich	139386
Heparina	Sigma Aldrich	H3149	Se une con el factor de crecimiento osteogénico con dominio de unión a la heparina
Ácido clorhídrico (37%)	Merck	100317	Incubadora altamente corrosiva
	Binder	C8150
MicroBCA Kit de ensayo de proteínas	Thermoscientific	23235
Lector de microplacas	Tecan	Infinite M200	Para ensayos ALP y microBCA
Encapsulador de células Nisco	Nisco Engineering Inc	Unidad de encapsulación VAR V1
Microscopio fluorescente	Olympus	Andamio IX71
mPCL-TCP (el tamaño de los poros es 1,3  mm)	Osteopore	PCL-TCP 0/90	Hold PEC para estudio in vivo
Penicilina-Estreptomicina 10.000 unidades/ml, 100  ml	Cultivo de células Hyclone	SV30010	antibiótico
10x solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Vivantis	PB0344-1L	10x Solución,
poli-L-lisina de grado ultra puro MW 15,000-30,000	Sigma Aldrich	P2568
Sal de sulfato de protamina	Sigma Aldrich	P4020	de policatión
	Labnet	S2025
Tubo de diálisis de piel de serpiente 3.500 MWCO 22  mm x 35 pies	Thermo Fisher Scientific	68035	Eliminación de FITC no reaccionado por diálisis
Cloruro de sodio	Merck	1.06404.1000
Hidróxido de sodio	Qrec	S5158
Bicarbonato de sodio	US Biological	S4000	Tampón
Carbonato de sodio	Sigma Aldrich	S7795-500G	Tampón
Cloruro de estroncio Hexahydrate	Sigma Aldrich 255521		Reticulante para alginato
Espátula	3dia Jeringa
de 5 ml	Terumo	140425R	El diámetro de la jeringa afecta al caudal
75 cm2 Matraz de cultivo celular Cuello inclinado	Corning	730720
Toluidina Azul	Sigma Aldrich	52040	Ensayo
Tripsina 1x	Hyclone Cell Culture	SH30042.01
Alginato de sodio	Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ)	Pronova UPMVG	Material central de microperlas