Complejo de polielectrolito para la unión a heparina de entrega osteogénico Factor de Crecimiento de dominio

Resumen

Los complejos de polielectrolitos (PEC) autoensamblados fabricados a partir de heparina y protamina se depositaron en perlas de alginato para atrapar y regular la liberación de factores de crecimiento osteogénicos. Esta estrategia de administración permite una reducción de 20 veces de la dosis de BMP-2 en aplicaciones de fusión espinal. Este artículo ilustra los beneficios y la fabricación de PEC.

Resumen

Durante cirugías reconstructivas óseas, cantidades suprafisiológicas de factores de crecimiento se cargan empíricamente en los andamios para promover la fusión ósea exitosa. Se requieren grandes dosis de agentes biológicos altamente potentes debido a la inestabilidad del factor de crecimiento como resultado de la rápida degradación enzimática, así como las ineficiencias de soporte en la localización de cantidades suficientes de factor de crecimiento en los sitios de implante. Por lo tanto, las estrategias que prolonguen la estabilidad de los factores de crecimiento, tales como BMP-2 / NELL-1, y controlan su liberación en realidad podría disminuir su dosis eficaz y, por tanto, reducir la necesidad de dosis mayores durante las futuras cirugías de regeneración ósea. Esto a su vez reducirá los efectos secundarios y costos de los factores de crecimiento. Los PEC autoensambladas se han fabricado para proporcionar un mejor control de la BMP-2 / NELL-1 a través de la entrega de unión a la heparina y el factor de mayor bioactividad crecimiento potencian mediante la mejora de la estabilidad in vivo. Aquí se ilustra la simplicidad de fabricación PEC que ayuda en la delivery de una variedad de factores de crecimiento durante las cirugías óseas reconstructivos.

Introducción

La incidencia de pseudoartrosis se ha reportado que ser tan alta como 10 a 45% en la fusión espinal degenerativa y revisión cirugías de columna ^1. Para reducir la tasa de pseudoartrosis durante la fusión columna vertebral y otras cirugías reconstructivas óseas, se han introducido factores de crecimiento osteogénicos tales como BMP-2, Nell-1 ¹ y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) para promover la osteogénesis de novo. Entre estos, BMP-2 es una opción popular para la fusión espinal ^2. Aunque la potencia de la BMP-2 en la inducción y facilitación de la formación de hueso nuevo ha sido bien establecida ^3; complicaciones clínicamente importantes, tales como la formación de hueso heterotópico, seroma y la formación de hematomas, respuesta inflamatoria, radiculitis, osteolisis cuerpo vertebral, y la eyaculación retrógrada siguen siendo temas de preocupación debido a las cantidades utilizadas supraphysiological ^4,5.

Por lo tanto, la reducción de la dosis de BMP-2 sigue siendo una estrategia relevante en altienta para minimizar los efectos secundarios. Además, se requieren sistemas de portadores eficaces para suprimir la liberación de ráfaga inicial de BMP-2 observada en los sistemas de portadora de esponja de colágeno contemporáneo y mejorar aún más la administración prolongada y localizada de esta potente citoquina. La auto-ensamblaje capa por capa de polielectrolitos catiónicos alterna y aniónicos puede ser empleado como un método sintonizable para construir complejos de polielectrolito en la superficie de matrices de andamio o materiales implantables ^6. A este respecto, la heparina (conocido por tener la densidad de carga negativa más alta de todos los agentes biológicos) ha sido reconocido para unir ávidamente con una variedad de factores de crecimiento a través de los dominios de unión electrostáticas y heparina. De hecho, la heparina se ha demostrado prolongar la vida media y por lo tanto potenciar la bioactividad de varios factores de crecimiento.

Basado en esto, nuestro grupo adaptado un protocolo de auto-ensamblaje capa por capa para fabricar un complejo de polielectrolito a base de heparina (PEC) que cargas y preserva las bioactividades de los factores de crecimiento osteogénicos durante la inmovilización ^7,8. El núcleo de microperlas de alginato se fabricó por entrecruzamiento de residuos de alginato con iones de calcio de cationes divalentes o estroncio α-L-guluronato (G). El núcleo de alginato es una matriz andamio biodegradable; el cual después de la implantación, se reabsorbe en el lecho de fusión que proporciona espacio para el crecimiento óseo. Poli-L-lisina (PLL) o protamina se utiliza como la capa catiónica para entrelazar tanto con la matriz de andamio (en este caso, el núcleo de la portadora de microperlas de alginato) y la heparina cargada negativamente; mientras que las funciones de la capa de heparina aniónicos para estabilizar y localizar los factores de crecimiento cargados. El triple capa PEC se ha demostrado que aumenta la capacidad de carga del factor de crecimiento en un modelo porcino ^9. Recientemente, portadores PEC han demostrado reducir con éxito la dosis efectiva de BMP-2 en al menos 20 veces en la rata ¹⁰ y modelos porcinos de fusión espinal ^8.

ntent "> Aquí, se presenta los métodos de fabricación de los PEC para la entrega mejorada del factor de crecimiento en la fusión espinal y las otras cirugías reconstructivas óseas utilizando BMP-2 como un factor de crecimiento osteogénico modelo.

Protocolo

1. Preparación de la solución de alginato

1. Disolver 200 mg de alginato de sodio (no irradiado) o 400 mg de 8 Mrad irradió alginato de sodio en 10 ml de agua doblemente destilada y agitar durante 1 h para alginato no irradiado y 15 min para alginato irradiado. Almacenar la solución de alginato a 4 ° C durante la noche. Se filtra la solución de alginato con un filtro de jeringa de 0,2 micras estéril antes de la fabricación de microperlas de alginato.

Fabricación 2. El alginato Microbead

1. Desinfectar el generador de cuentas electrostática y la bomba de jeringa con 70% de etanol y colocarlos en una Clase II Gabinete de Seguridad Biológica (Figura 1).
2. Colocar un recipiente de vidrio con una barra de agitación magnética en el interior del generador de grano.
3. Ajuste el brazo del electrodo del generador de talón 9 cm por encima de la cuenca.
4. Conectar el cable del electrodo del generador de cuentas para el tornillo moleteado 2 del electrodo del brazo, y verter 80 ml ​​de solución de _SrCl2 en elcuenca.
5. Carga de 5 ml de 0,2 micras solución de alginato se filtra en el tubo de la jeringa y el caucho. Después de conectar el tubo de goma al electrodo de brazo, encender la bomba de jeringa a 5 ml / h durante 2 min para expulsar el aire dentro de la tubería y entregar la solución de alginato a la punta de la boquilla. Apagar la bomba de jeringa.
6. A continuación, encienda el encapsulador y, a continuación, la bomba de jeringa para comenzar generación microbead. Ajuste el caudal de alginato a 5 ml / hora y la tensión en 5,8 kV en el encapsulador. Desechar las microperlas generados durante los primeros dos minutos (o el iniciales de 0,5 ml de solución de alginato bombeado fuera de la jeringa), ya que estas microperlas tienden a ser irregular tamaño y forma.
7. Recoger microperlas subsiguientes en solución de cloruro de 0,2 M de estroncio. Apague la bomba de jeringa y el encapsulador (en ese orden) después de bombear el volumen de pre-planificado de solución de alginato. Repita este procedimiento para la fabricación de lotes posteriores microbead. Una vez completado, gire def la bomba de jeringa primero, seguido por el encapsulador.
8. Almacenar las microperlas en 20 ml de solución de cloruro de 0,2 M de estroncio a 4 ° C durante la noche para completar la reticulación y estabilizar el gel.

3. Medida del tamaño de las microperlas de alginato

1. Recoger 0,5 ml de microesferas de alginato con una pipeta de plástico y colocarla en un portaobjetos de vidrio. Ver las microperlas bajo un microscopio óptico con un aumento de 10X. Tome diez imágenes de las microperlas con una cámara CCD microscopio. Guardar las imágenes con la barra de escala (500 micras) en formato TIFF con una resolución de 2.048 x 1.536.
2. El uso de las herramientas de longitud en ImageJ, medir el tamaño de las microperlas y la barra de escala (Figura 2). Convertir la longitud microperlas de pixel a micrómetro.
   1. Haga clic en las herramientas de línea y trace una línea a través del centro de la esfera de alginato.
   2. Haga clic en "Analizar" en la barra de menú y seleccione "Medición". Aparecerá una ventana emergente.
   4. Convertir el diámetro de la esfera de alginato a la longitud real usando la fórmula: longitud de la esfera de alginato / longitud de la barra de escala x 500 micras. Por ejemplo, 1.420 (diámetro medido por ImageJ) / 2.657 (escala de longitud de la barra medida por ImageJ) * 500 = 267 micras micras.
3. Considere el tamaño medio de 100 microperlas (media ± desviación estándar) como el tamaño representante de cada lote de microperlas.

4. Esterilización

1. Recoger las microperlas utilizando un filtro de nylon de 100 micras y lavar las perlas con agua doblemente destilada.
2. Usando una espátula, transferir todas las microperlas elaborados a partir de 0,1 ml de solución de alginato en un tubo de microcentrífuga de 2 ml y cubrir con una gasa para evitar que se seque.
3. Finalmente, esterilizar las microperlas en autoclave usando el modo de líquido (115 ° C, 15 min) o de acuerdo con mlas especificaciones del anufacturer. Añadir 1,5 L de agua destilada a la cámara para evitar que los granos de secado.

5. protamina y heparina Coating

1. Dentro de la BSL-2 capó, incubar las microperlas estériles con 1 ml de 2 mg / ml solución de protamina (esterilizada mediante un filtro de jeringa de 0,2 micras) durante 1 hora a temperatura ambiente.
2. Después de la incubación de las microperlas durante 1 hora (Paso 5.1), recoger 150 ml de la solución de protamina para la prueba de micro ácido bicinconınico (de microBCA) (sección 6).
3. Se lavan las microesferas de protamina recubierto dos veces con agua doblemente destilada. Girar hacia abajo usando una centrífuga de mesa a 200 xg durante 3 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, aspirar el agua usando una jeringa.
4. Incubar microperlas recubierta de protamina con 1 ml de 0,5 mg / ml solución de heparina (esterilizada mediante un filtro de jeringa de 0,2 micras) durante 30 minutos para crear complejo polielectrolito (PEC).
5. Después de incubar la recubierto protamina microperlas fo 30 minutos (Paso 5.4), recoge 400 l de la solución de heparina para determinar el contenido de heparina (sección 7).
6. Después de la incubación, lavar la heparina no unido de los PEC lavando dos veces con agua doblemente destilada.

6. El contenido de protamina

1. Realizar la prueba de microBCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, añadir 150 l solución de protamina (recogidos antes y después de la incubación con microperlas) en una placa de 96 pocillos. Añadir 150 l de solución de trabajo de microBCA.
2. Utilice solución de albúmina (0, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 y 200 mg / ml) como estándares de calibración.
3. Incubar la mezcla durante 60 min a 60 ° C. Medir la absorbancia con un espectrofotómetro a 562 nm.
4. Utilice la curva estándar para determinar la concentración de protamina de cada muestra desconocida de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
5. Determinar el contenido de protamina de las microperlas restando la cantidad total de protamina en elsolución de recubrimiento (antes de la incubación con microperlas) a partir de la cantidad de protamina que queda en la solución de revestimiento (después de la incubación con microperlas).

7. La heparina contenido

1. Preparar los 10 ml de solución de trabajo disolviendo 4 mg de azul de toluidina y 20 mg de cloruro de sodio en 0,01 N de ácido clorhídrico.
2. Añadir 400 l de muestra (de la etapa 5.5) a la solución de trabajo en una proporción de 2: 3 y agitar durante 30 seg.
3. Añadir 600 l de n-hexano (volumen equivalente al de la solución de reactivo de trabajo) y agitar la mezcla para extraer el complejo heparina azul de toluidina.
4. Aspirar 200 l de la fase acuosa por la jeringa después de la separación de fases.
5. Medir la cantidad de azul de toluidina un-extraída contenido en la fase acuosa usando un espectrofotómetro a 631 nm.
6. Preparar soluciones estándar de heparina de 0-20 mg / ml.
7. Trazar la lectura de 631 nm de cada estándar de heparina frente a la concentración de heparina en microgramos / ml. Utilice la curva estándar para determinar la concentración de heparina de cada muestra.

8. confocal imagen de la estructura de capa por capa

1. Fabrique protamina, heparina y NELL-1 / BMP-2 análogo fluorescente CF-405 de protamina (azul), CF 594 heparina (rojo) y marcado con FITC NELL-1 / marcado con FITC (verde) BMP-2 + heparina + protamina de acuerdo con el fabricante del ficha técnica.
2. Escudo 100 g microperlas con 300 l de análogo fluorescente (método de recubrimiento como se describe en 5.3 a 5.6) CF-405 de protamina (azul) (2 mg / ml, 1 hr de incubación), CF 594 heparina (rojo) (0,5 mg / ml, 30 min) y FITC etiquetados NELL-1 / marcado con FITC (verde) BMP-2 (1,5 mg / ml, durante la noche). Lavar las microperlas dos veces con agua destilada para eliminar el no unido protamina fluorescente, la heparina y NELL-1 / BMP-2.
3. Observe la estructura de capa por capa (Figura 3) mediante el uso de un microscopio confocal en un aumento de 10X. ⁷

9. BMP-2y Nell-1 toma y liberación

1. Cargar 13,3 l de 1,5 mg / ml de BMP-2 o NELL-1 solución en 100 g de PEC. Incubar PEC a 4 ° C en 30 rpm de remoción durante 10 horas.
2. Sumergir las microperlas en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 ° C con agitación constante (30 rpm).
3. Tomar 1 ml del sobrenadante y reemplazarlo con 1 ml de PBS después de 1, 3, 6, 10 y 14 días.
4. Evaluar la absorción y liberación eficiencia de BMP-2 mediante el método de ELISA de acuerdo con el protocolo del fabricante. Evaluar la absorción y liberación eficiencia de NELL-1 utilizando el método de ensayo de proteínas carboxibenzoil quinolina-2-carboxaldehído (CBQCA) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
5. Determinar la liberación acumulativa en el tiempo (t):
   liberación acumulativa en el tiempo (t) = estreno en el tiempo (t) + versión anterior en el tiempo (t-1).
6. Trazar liberación acumulativa de BMP-2 y Nell-1 contra el tiempo.

10. La bioactividad in vitrode NELL-1

Nota: La bioactividad de NELL-1 liberado de PEC se evaluó midiendo su capacidad para aumentar la expresión de la fosfatasa alcalina (ALP) en células madre de médula ósea de conejo (rBMSC).

1. Semilla 20.000 rBMSCs por pocillo en una placa de 24 pocillos y les permiten crecer durante un día con 1 ml de Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM) + 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C y 5% de _CO2.
2. Después de 24 h, sustituir el medio con 1 ml de un medio osteogénico (DMEM suplementado con 10% FBS, 2% de penicilina estreptomicina, ácido ascórbico 50 mg / ml, 10 mmol / L beta-glicerofosfato, y 10 ^-8 mol / L de dexametasona ) durante 7 días a 37 ° C y 5% de _CO2.
3. Colocar 300 g PEC-NELL-1 (desde el paso 8.2) y PEC dentro de insertos de cultivo celular (inserto TC) para mantener los PEC separado de las células (esto evita el lavado de microesferas de PEC durante el cambio de medio osteogénico). Lugar de inserción de TC en el 24 así plcomió durante 14 días.
4. Una vez cada tres días, aspirado de 1 ml del medio osteogénico mediante la colocación de una aguja de inserción fuera de la TC, y reemplazar con 1 ml de medio osteogénico fresco.
5. Después de 7 y 14 días de incubación, determinar la actividad de ALP con un kit de ensayo de ALP, de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit.
   1. lisar las células con tampón de ensayo que contenía 0,1% Triton X-100 a 4 ° C durante 10 min. Raspar células adheridas utilizando un rascador de células. Incubar suspensión de células a 4 ° C con agitación durante al menos 60 min.
   2. Centrifugar la suspensión celular a 2500 xga 4 ° C durante 10 min. Recoger el sobrenadante para el ensayo de ALP.
   3. Añadir 50 l de solución estándar de fosfatasa alcalina diluido en serie 200-0 ng / ml a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Las cantidades finales de fosfatasa alcalina estándar son de 10, 5, 2,5, 1,2, 0,6, 0,3, 0,15 y 0 ng / pocillo.
   4. Añadir el sobrenadante de la etapa 10.5.2 (50 l / pocillo) y se diluye con dilución bUffer.
   5. Añadir 50 l de solución de fosfato de sustrato (pNPP) p-nitrofenil en cada pocillo. Mezcle los reactivos sacudiendo suavemente la placa durante 30 segundos. Incubar la mezcla durante 30 min en la oscuridad. Se mide la absorbancia a 405 nm mediante un lector de placas.
   6. Calcular la actividad de ALP usando la curva de calibración.
6. Determinar el contenido de proteína usando el kit de ensayo de proteínas de microBCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Normalizar la actividad de la ALP dividiendo la actividad de ALP por el contenido de proteína.

11. La viabilidad de la célula

1. Incubar 200 mg de PEC-NELL-1 con 1 ml de DMEM + 10% FBS a 37 ° C durante 24 h para la 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) ensayo.
2. 2.000 semillas rBMSCs por pocillo (en 100 l de DMEM con FBS al 10%) en una placa de 96 pocillos y se incuban durante 1 día a 37 ° C, 5% de CO _2.
3. Reemplazar DMEM + 10% FBS con 100 l de extracto de PEC-NELL-1 / PEC e incubara 37 ° C, 5% de CO _2.
4. Después de 1 día o 3 días de incubación, se añaden 10 l de solución de MTT 5 mg / ml y se incuba a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 4 horas en la oscuridad.
5. Añadir 100 l solución DMSO a cada pocillo para disolver los cristales de formazán.
6. Determinar la absorbancia a 570 nm utilizando un lector de microplacas.
7. Calcular la tasa de crecimiento relativo:
   

12. Embalaje en Andamios y BMP-2 y NELL-1 Loading

1. Paquete de los PEC en los poros de una policaprolactona grado médico biorreabsorbible - fosfato tricálcico (MPCL-TCP) andamio con una espátula esterilizada dentro de una cámara BSL-2.
2. Añadir 1,5 mg / ml de solución de BMP-2 o NELL-1 al andamio MPCL-TCP lleno de PEC y se incuba durante la noche a 4 ° C.

Resultados

En nuestro portador, protamina fue elegido como un sustituto de poli-L-lisina, ya que tiene propiedades químicas similares y está aprobado por la FDA como un antídoto de la heparina. resultados microscopio óptico mostró que las microperlas no irradiados eran de forma esférica con un diámetro de 267 ± 14 micras. (Boquilla de 0,35 mm, velocidad de flujo de 5 ml / hr y 5,8 kV). La mayoría de las microperlas irradiados son de forma de lágrima. El diámetro medido en la parte de vuelta de las ...

Discusión

Este protocolo presenta un método para la preparación de los PEC través de la capa por capa de autoensamblaje. La estructura de capa por capa se visualizó usando análogos fluorescentes de protamina, heparina, BMP-2 y Nell-1 y microscopía confocal. La captación y análisis de liberación muestran que la heparina sobre los PEC media la captación del factor de crecimiento osteogénico y liberación. La eficiencia de absorción del método PEC es: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. El portador PEC tiene una mejor modulación...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ciencias de la Vida Acrodisc 25  mm Filtro de jeringa con 0.2  y micro; m Membrana Supor	PALL	PN4612	Protamina estéril, solución de heparina por ultrafiltración
placa de 24 pocillos	Cell Star	662160
Placa de 96 pocillos Nuclon Delta Surface	Thermo Fisher Scientific	167008
(3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Bmuro de difeniltetrazolio), MTT	Sigma Aldrich	M5655	Medir la citotoxicidad de la acetona PEC-NELL-1
Fisher	Scientific	A/0600/17	Precipitado CF-405 Protamina marcada
Alamar Blue	Invitrogen, Life Technologies	DAL 1025	Medición de la citotoxicidad del kit de ensayo de
ensayo de fosfatasa alcalina (ALP)	Anaspec	AS-72146
Cloruro de amonio	Merck	Art 1145	Reactivo de parada en el marcaje FITC
Vitrogen de dimetilsulfóxido de dimetilo (DMSO) enaguado	, Life Technologies	D12345	Disolvente para isotiocianato I
dimetil sulfóxido fluorescente ( DMSO)	Sigma Aldrich		Disolver  formazan
Autoclave	Hirayama	HU-110	Esterilizar perlas de alginato por vapor
Beta-glicerofosfato	Sigma Aldrich	G9422
BMP-2 (Infusión de Injerto Óseo Kit II II)	Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, EE. UU	. 7510800	Factor de crecimiento osteogénico, se necesita diálisis para eliminar el componente estabilizador que interfiere con el acoplamiento FITC
Carboxibenzoilquinolina-2-carboxaldehído (CBQCA)	Thermo Fisher Scientific	A-6222	Para cuantificar el filtro de células de la proteína NELL-1
(100  y micro; m)	BD Science	352360	Hold PEC para el raspador de células del ensayo ALP
290   mm Ancho de la hoja 20  mm	SPL Life Science	90030	Separe la celda de la placa de 24 pocillos
CF 405S, Succinimidyl Ester	Sigma Aldrich	SCJ4600013	Colorante fluorescente azul para el marcaje de protaminas
CF 594, Hydrazide	Sigma Aldrich	SCJ4600031	Colorante fluorescente rojo intenso para el marcaje de heparina
Centrífuga	Beckman Coulter	Microfuge 22R
Microscopio Confocal	Olimpo	FV1000
Dexametasona	Sigma Aldrich	D4902	Componente del medio de crecimiento osteogénico
Columnas de desalinización de dextrano	Pierce (Thermo Scientific)	43230
DMEM	Gibco	12320
BMP-2 Quantikine ELISA Kit	R& Sistema	D DBP200	Determinar la liberación de BMP-2
Suero fetal bovino FBS	Hyclone	SV30160.03
Isotiociananato de fluoesceaína, isómero I	Sigma Aldrich	F7250	Colorante fluorescente verde para el etiquetado de NELL-1 y BMP-2 Insertos
cultivo celular ThinCert, para placas de 24 pocillos,	Greiner estéril	662630	Evita el lavado de PEC al cambiar el medio osteogénico
Bomba de jeringa Havard Appartus (11 plus)	Havard Apparatus	70-2208
n-Hexane (>99%)	Sigma Aldrich	139386
Heparina	Sigma Aldrich	H3149	Se une con el factor de crecimiento osteogénico con dominio de unión a la heparina
Ácido clorhídrico (37%)	Merck	100317	Incubadora altamente corrosiva
	Binder	C8150
MicroBCA Kit de ensayo de proteínas	Thermoscientific	23235
Lector de microplacas	Tecan	Infinite M200	Para ensayos ALP y microBCA
Encapsulador de células Nisco	Nisco Engineering Inc	Unidad de encapsulación VAR V1
Microscopio fluorescente	Olympus	Andamio IX71
mPCL-TCP (el tamaño de los poros es 1,3  mm)	Osteopore	PCL-TCP 0/90	Hold PEC para estudio in vivo
Penicilina-Estreptomicina 10.000 unidades/ml, 100  ml	Cultivo de células Hyclone	SV30010	antibiótico
10x solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Vivantis	PB0344-1L	10x Solución,
poli-L-lisina de grado ultra puro MW 15,000-30,000	Sigma Aldrich	P2568
Sal de sulfato de protamina	Sigma Aldrich	P4020	de policatión
	Labnet	S2025
Tubo de diálisis de piel de serpiente 3.500 MWCO 22  mm x 35 pies	Thermo Fisher Scientific	68035	Eliminación de FITC no reaccionado por diálisis
Cloruro de sodio	Merck	1.06404.1000
Hidróxido de sodio	Qrec	S5158
Bicarbonato de sodio	US Biological	S4000	Tampón
Carbonato de sodio	Sigma Aldrich	S7795-500G	Tampón
Cloruro de estroncio Hexahydrate	Sigma Aldrich 255521		Reticulante para alginato
Espátula	3dia Jeringa
de 5 ml	Terumo	140425R	El diámetro de la jeringa afecta al caudal
75 cm2 Matraz de cultivo celular Cuello inclinado	Corning	730720
Toluidina Azul	Sigma Aldrich	52040	Ensayo
Tripsina 1x	Hyclone Cell Culture	SH30042.01
Alginato de sodio	Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ)	Pronova UPMVG	Material central de microperlas