Ensayo de adhesión en condiciones de estrés de cizalla para el Estudio de linfocitos T-molécula de adhesión Interacciones

Resumen

Este ensayo de adhesión de flujo proporciona un modelo de impacto simple de la máxima de las interacciones célula-célula epitelial T. Una bomba de jeringa se utiliza para generar la tensión de cizallamiento, y la microscopía confocal captura imágenes para la cuantificación. El objetivo de estos estudios es cuantificar eficazmente la adhesión de células T usando condiciones de flujo.

Resumen

En general, la adhesión de las células T es un componente crítico de la función, contribuyendo a los distintos procesos de reclutamiento celular a los sitios de inflamación y la interacción con las células presentadoras de antígeno (APC) en la formación de sinapsis inmunológicas. Estos dos contextos de adhesión de las células T se diferencian en que las interacciones célula T-APC pueden considerarse estática, mientras que las interacciones de los vasos de la sangre por células T son desafiados por el esfuerzo cortante generada por la circulación en sí. interacciones de células T de APC se clasifican como estática en que los dos socios celulares son estáticos con relación al otro. Por lo general, esta interacción se produce dentro de los ganglios linfáticos. Como una célula T interactúa con la pared del vaso sanguíneo, las células detienen y deben resistir el esfuerzo cortante generado. ^1,2 Estas diferencias ponen de manifiesto la necesidad de comprender mejor adherencia estática y la adherencia en condiciones de flujo como dos procesos distintos reguladores. La regulación de la adhesión de las células T se puede describir sucintamente como concurricán el estado afinidad de la integrina moléculas expresadas en la superficie celular, y regulando de este modo la interacción de las integrinas con los ligandos de moléculas de adhesión expresadas sobre la superficie de la célula que interactúan. Nuestra comprensión actual de la regulación de los estados de afinidad proviene de la integrina menudo simplista en sistemas modelo in vitro. El ensayo de adhesión usando condiciones de flujo descrito aquí permite la visualización y la cuantificación exacta de las interacciones de células de células epiteliales T en tiempo real después de un estímulo. Una adhesión bajo ensayo de flujo se puede aplicar a los estudios de adhesión de señalización dentro de las células T después de tratamiento con sustancias inhibidoras o estimulantes. Además, este ensayo se puede ampliar más allá de la señalización de las células T a cualquier población de leucocitos adhesivo y cualquier par molécula de integrina adherencia.

Introducción

La adhesión de linfocitos T media una serie de procesos diferentes en un sistema inmunológico saludable, ³ juega un papel crítico en el tráfico de células T y la presentación de antígenos. Ya sea durante la vigilancia inmune o una respuesta inmune activa estas dos amplias funciones para la adhesión son críticos. ⁴ Los eventos de señalización fisiológicos de las interacciones de células de células endoteliales T son distintos de células T antígeno que presenta la célula (APC) interacciones, y por lo tanto requieren métodos distintos de estudio para entender mejor las cascadas de señalización implicadas. La adhesión firme de una célula T a una par....

Protocolo

1. Revestimiento las células CHO-ICAM

Nota: El objetivo de este paso es la placa de las células CHO-ICAM en las cámaras de flujo para el crecimiento durante la noche con el objetivo de generar una monocapa confluente.

1. Mantener las células CHO-ICAM en 10 cm tratado de cultivo de tejidos placas de cultivo en 10 ml de medio RPMI suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina (CHO-ICAM medio de cultivo completo) a 37 ° C con 5% CO _2.
2. Para recoger las células, añadir 1 ml 0,5% de tripsina-EDTA y se incuba a temperatura ambiente durante 1 min con agitación suave. Neutralizar la tripsina con 4 ml ....

Resultados

Los resultados representativos se muestran desde el ensayo de adhesión de flujo usando Jurkat y células T CD3 ⁺ humanas primarias, como se indica, se estimularon con SDF-1α. Los controles negativos en todos los experimentos se muestran en las células no estimuladas. Un porcentaje umbral basal adhesión de las células no estimuladas está entre 5 - 10%; Adherencia baja notablemente por encima de este rango indica un experimento problemática y sugiere la población inicial de célul.......

Discusión

Con el fin de analizar adecuadamente la adhesión de células T, el estimulante que se incluirán en el estudio deben ser considerados al momento de elegir un método in vitro. Si bien hay varios ensayos para estudiar las señales que conducen a LFA-1 de activación y ICAM-1 de unión a todos los métodos no son intercambiables. Un ensayo de adhesión estática ¹⁰ es el más adecuado para estudiar las interacciones de las células T de APC; Alternativamente, el método de la tensión de cizallamiento se detalla aq.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Muestras de linfocitos T (línea celular o primario)	ATCC	TIB-152	Células T humanas periféricas
Células CHO-ICAM-1	ATCC	CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat ibidi		80606
Frasco de vidrio de 500 ml	Fisher	FB800500
Botella de vidrio de 250 ml	Fisher
Silicona tubo de 0,8 mm	ibidi	10841
Microscopio confocal con cámara de incubación	Ziess	700	Cualquier microscopio fluorescente de campo amplio
Bomba de jeringa	New Era Pump Systems	NE-300
Jeringa de 60 ml	BD	309653
CFSE	eBioscience	65-0850
SDF-1α	R& D	350-NS-010/CF
RPMI	Lonza	12-702F/12
PBS	Microcentrífuga Lonza	17-516F
	Eppendorf	5424
D-Glucosa	Sigma Aldrich	G8270
PMA	Sigma Aldrich	16561-29-8
Volocity software	Perkin Elmer	Versión 6.2.1
Software	ImageJ	NIH Versión 1.48V
Placas de cultivo tratadas con cultivo de tejidos	Falcon	353003
Trypsin-EDTA (0,25%) Rojo fenol	Gibco	25200114
FBS inactivado por calor	Denville	FB5001-H
Penicilina/Estreptomicina	Fisher BP295950

FB800250