Como estudiar membrana basal para la rigidez como un disparador de Biofísica en el cáncer de próstata y otras patologías relacionadas con la edad o enfermedades metabólicas

Resumen

Aquí se explica un protocolo para modelar el microambiente biofísico donde la reticulación y el aumento de la rigidez de la membrana basal (BM) inducida por productos finales de glicación avanzada (AGEs) tiene relevancia patológica.

Resumen

Aquí se describe un protocolo que se puede utilizar para estudiar el microambiente biofísica relacionada con un aumento del grosor y la rigidez de la membrana basal (BM) durante patologías relacionadas con la edad y trastornos metabólicos (por ejemplo, cáncer, diabetes, enfermedad microvascular, retinopatía, nefropatía y neuropatía) . La premisa de este modelo es la reticulación no enzimática de la matriz BM reconstituido (GBR) por tratamiento con glicolaldehıdo (GLA) para promover el producto final de glicación avanzada generación (AGE) a través de la reacción de Maillard. Ejemplos de técnicas de laboratorio que se pueden utilizar para confirmar la generación de AGE, la reticulación no enzimática y mayor rigidez en GLA tratados RBM se describen. Estos incluyen la preparación de la GBR nativa (tratado con solución salina tamponada con fosfato, PBS) y rígido RBM (tratados con GLA) para la determinación de: su contenido de AGE por análisis fotométrico y microscopía de inmunofluorescencia, su no-enzimática por reticulación de sodio poliacrilamida dodecilsulfatoelectroforesis en gel (SDS PAGE), así como la microscopía confocal, y su aumento de la rigidez usando reometría. El procedimiento descrito aquí se puede utilizar para aumentar la rigidez (módulos de elasticidad, E) de la GBR hasta 3,2 veces, de acuerdo con las mediciones realizadas en sanos frente a tejido de la próstata humano enfermo. Para recrear el microambiente biofísica asociada con el envejecimiento y la glándula próstata enferma tres tipos de células de la próstata se introdujeron en la GBR nativa y rígido RBM: RWPE-1, las células epiteliales de la próstata (PEC) derivada de una glándula de la próstata normal; BPH-1, los PEC derivados de una glándula de la próstata afectados por hiperplasia prostática benigna (BPH); y PC3, células metastásicas derivan de un tumor óseo secundario procedente de cáncer de próstata. Múltiples parámetros pueden ser medidos, incluyendo el tamaño, forma y características invasoras de los acinos glandulares 3D formado por RWPE-1 y la HBP-1 sobre los nativos frente rígida RBM, y la longitud de celda promedio, la velocidad migratoria y la persistencia del movimiento de las células de spher 3Doids formados por células PC3 en las mismas condiciones. vías y la localización subcelular de las proteínas de señalización celular también se puede evaluar.

Introducción

La membrana basal (BM) es una lámina de matriz extracelular (MEC) especializada que mantiene estables los bordes del tejido separando las capas de células epiteliales del estroma¹. La reticulación covalente entre hélices triples adyacentes de colágeno IV en el BM estabiliza su asociación lateral mediante el establecimiento de una red irregular de hélices superretorcidas². Estas redes de colágeno IV actúan como un andamio para su interacción con la laminina y otros componentes de BM¹. La disposición estructural del BM le proporciona la resistencia mecánica y la rigidez necesarias para el desarrollo normal del epitelio glandular³.

Durante el envejecimiento y la enfermedad, el BM se engrosa y endurece progresivamente^3,4. Por ejemplo, entre los 50 y los 80 años se produce un aumento de 3 veces en el módulo elástico (E) de la MO ocular en la población normal, y este endurecimiento se exacerba aún más en trastornos metabólicos como la diabetes⁵. Los cambios estructurales y biomecánicos en el BM que dan lugar a su mayor rigidez se producen cuando sus componentes de la ECM, el colágeno IV y la laminina, se entrecruzan de forma no enzimática tras su exposición a productos finales de glicación avanzada (AGE).

El propósito del método descrito aquí fue establecer un modelo para la investigación de cómo la rigidez de la MO, debido a la exposición a AGE, promueve la invasividad de las células epiteliales de próstata (PEC) y de las células tumorales de próstata (PTC) en el contexto del cambio al cáncer de próstata metastásico (CaP). Para ello, se adaptó un método previo utilizado para generar acinos glandulares 3D a partir de células epiteliales mamarias (MEC) en geles rBM reconstituidos⁶ para incluir un paso adicional en el que los geles rBM se pretratan con glicolaldehído (GLA). Se describen varias técnicas para evaluar la reticulación y el endurecimiento inducidos por GLA de geles rBM pretratados, incluido el análisis fotométrico, la electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS PAGE), la microscopía confocal y el análisis reométrico. Los tipos de células prostáticas seleccionadas para el cultivo en el rBM preendurecido incluyen: RWPE-1, PEC derivadas de una glándula prostática normal⁷; HPB-1, PECs derivadas de una glándula prostática afectada por HPB⁸; y PC3, PTCs metastásicos derivados de un tumor secundario localizado en el hueso vertebral de un paciente con cáncer de próstata (CaP)⁹.

Además de avanzar en el estudio de la patología de la glándula prostática, el protocolo para el endurecimiento de los geles de rBM mediante su tratamiento con GLA se puede adaptar para investigar cómo la rigidez de la BM contribuye a otras patologías relacionadas con la edad y trastornos metabólicos. Por ejemplo, el modelo se puede aplicar directamente para investigar cómo el cáncer metastásico es inducido por la rigidez de la BM en órganos como la mama, el colon, el ovario y el páncreas mediante la incorporación de tipos de células apropiados. Además, el protocolo se puede adaptar para investigar cómo la BM rígida promueve los mecanismos biomecánicos de la progresión de la enfermedad en la enfermedad microvascular relacionada con la diabetes, la retinopatía, la nefropatía y la neuropatía.

Protocolo

1. La inducción de la BM Rigidez inducida por el tratamiento GLA (reticulación no enzimática)

1. Descongelar un vial congelado de la matriz BM (10 ml) mediante la incubación a 4 ° C (de pie sobre el hielo en un cuarto frío o un refrigerador) de líquido hasta que el contenido del vial se han convertido en (8-16 hr).
   Precaución: Si no se utiliza una habitación / refrigerador frío, cubrir toda la botella con hielo. Esto evitará que la solución madre de BM se solidifique.
2. Para futuros experimentos y para evitar los ciclos de congelación y descongelación repetidas, preparar 25 x 0,4 ml alícuotas de cada nuevo vial de 10 ml de la matriz BM. Guarde los viales a -80 ° C hasta la fecha de caducidad indicada por el fabricante. Cuando sea necesario, descongelar los viales a 4 ° C se colocan en hielo durante 2 horas.
3. Preparar una superficie uniforme de hielo. Colocar un portaobjetos de vidrio cámara de 8 pocillos en la parte superior del hielo para mantener una temperatura de 4 ° C durante el procedimiento de recubrimiento. Descongelar un vial de matriz BM a 4 ° C.
   Nota: Un 0,4 ml vial de matriz BM es suficiente para coat toda una diapositiva de la cámara 1 x 8 pocillos. Mantener el vial cubierto de hielo durante la manipulación para evitar que la matriz BM se solidifique.
4. Cortar el extremo de dispensación de una punta de pipeta de 200 l con unas tijeras. Se enfría la punta de la pipeta 200 l de extremos romos a 4 ° C y colocarlo en un auxiliar de pipeteado capacidad de 200 l. Tomar hasta 40 l de la solución fría matriz BM en la punta de la pipeta y la transfiere en un pozo en el frío de 8 pocillos portaobjetos de vidrio de cámara.
   Nota: 40 l de solución de BM es suficiente para cubrir un área superficial de 0,8 cm ^2. Mantenga puntas de pipeta refrigerados durante el procedimiento de recubrimiento para evitar la solidificación de la solución de BM. No introducir burbujas de aire en la solución de matriz de BM y asegurar el pozo se reviste de manera uniforme sin la formación de un menisco visible en los bordes.
5. Repita el paso 1.4 de acuerdo con el número de pozos y cámaras requeridos.
6. Después del recubrimiento, colocar la corredera cámara de 8 pocillos a 37 ° C durante 30 min para promover la polimerizacióndel BM. Cierre la puerta de la incubadora con mucho cuidado para evitar la perturbación no deseada de la RBM líquido. No exceda el tiempo de incubación de 30 minutos para evitar la deshidratación del gel de RBM.
   Nota: El gel resultante es el BM nativa reconstituida (RBM). La etapa C de incubación 37 ° no requiere 5% de CO _2. Sin embargo, por conveniencia realizar este paso en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C y 5% de CO ₂ (con humidificación).
7. Preparar glicolaldehído 50 mM (GLA) diluido en tampón de fosfato 0,2 M (pH 7,8). Esterilizar la solución pasándola a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras utilizando una jeringa de 50 ml.
   1. Para una reacción de reticulación en un volumen final de 250 l de GLA 50 mM, añadir 25 l de cianoborohidruro de sodio 0,5 M o 2,5 M de aminoguanidina a 125 l de mM GLA 100 (2x Stock) y 100 l de tampón de fosfato 0,2 M (pH 7,8 ). Esterilizar las soluciones madre pasándolos a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras utilizando una jeringa de 50 ml.
      Precaución: Manipular cianoborohidruro de sodio que llevaba una bata de laboratorio, guantes, protector para la cara y el respirador mientras se trabaja en una campana de humos.
8. Añadir 250 l de solución de GLA para cubrir el gel polimerizado RBM y se incuba a 37 ° C durante 6 horas para producir un gel RBM semi-rígido o 14 horas para producir un gel rígido RBM.
   Nota: El volumen de GLA añadir debe cubrir el gel polimerizado RBM y debe ajustarse en consecuencia. Si se utilizan diferentes tiempos de incubación GLA, los geles de gestión por resultados deben ser analizados para determinar el pliegue aumento de la rigidez RBM (véase el paso 2.4).
   1. Preparar un control negativo mediante la incubación de un gel nativo en la GBR 250 l de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) durante 14 horas a 37 ° C.
   2. Preparar dos controles adicionales en las que se inhiben la formación de base de Schiff o Amadori reordenamiento aducto durante la reacción de reticulación, por la adición de cianoborohidruro de sodio 50 mM o aminoguanidina 250 mM.
9. Preparar 1 M de glicina correoéster Thyl (GEE) diluido en PBS. Esterilizar la solución pasándola a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras utilizando una jeringa de 50 ml.
10. Después de que el tiempo de incubación indicado, retire con cuidado la solución de GLA a partir de los geles reticulados RBM, GLA solución que contiene inhibidores de los geles de control y gestión por resultados PBS de control de los geles nativos RBM. Añadir 250 l de solución de GEE a todos los geles de la GBR y se incuba a 37 ° C durante 1 hr.
    Nota: Este paso apaga la reacción de reticulación.
11. Lavar todos los geles RBM 10 veces en 500 l de PBS para eliminar todos los rastros de GLA y GEE. Incubar los geles RBM durante la noche a 37 ° C en 400 l de PBS para evitar su deshidratación.
    1. Analizar los geles de gestión por resultados para la acumulación de AGE, reticulación no enzimática y propiedades viscoelásticas (Pasos 2.1-2.4). Para el análisis reométrico de sus propiedades viscoelásticas preparar los geles GBR en anillos de clonación (paso 2.4).
    2. Para el cultivo celular, enjuague geles RBM 2 veces con 500 l de cultivo mídia antes de sembrar las células (pasos 5 y 6). Realizar lavados suavemente sin la punta de pipeta tocando la superficie del gel.

2. Cuantificación de no enzimática La reticulación y la rigidez de la GBR tratados con GLA

1. Análisis fotométrico
   1. Medir la acumulación de AGE en tratados con GLA y controlar geles RBM usando análisis fotométrico para determinar la extensión de la reacción de Maillard.
      1. Después del paso 1.11, retire la PBS a partir de geles de gestión por resultados en los 8 pocillos cámara de diapositivas y añadir 250 l de agua doblemente destilada enfriada con hielo. Se incuba a 4 ° C durante 16 a 24 horas para asegurar que la matriz completa licuación.
         Nota: Los péptidos GBR en esta solución contienen AGE con propiedades auto-fluorescente.
      2. Transferir la solución BM licuado a un tubo de 1,5 ml y medir la emisión fluorescente de la solución usando un espectrofotómetro (longitud de onda de excitación = 370 nm; longitud de onda de emisión = 440 nm).
2. SDS-PAGE análisis de bromuro de cianógeno péptidos
   1. Resolver los geles tratados con GLA y la GBR de control en un gel de poliacrilamida para confirmar que GLA ha inducido la reticulación y la formación de macro-fibras.
      1. Centrifugar la solución BM licuado recogido en el paso 2.1.1.2 a 10.000 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
      2. Preparar una solución madre que contiene 2 g / ml de bromuro de cianógeno diluido en acetonitrilo.
         Precaución: Siempre manipule bromuro de cianógeno en una campana de humos mientras llevaba una bata de laboratorio, guantes, protector para la cara y el respirador.
      3. Eliminar el sobrenadante, volver a suspender el sedimento en gel BM en 500 l de 20 mg / ml de bromuro de cianógeno + 70% v / v de ácido fórmico y se incuba durante la noche a temperatura ambiente.
      4. Usar una jeringa desechable de 1 ml para transferir el sedimento resuspendido en gel de BM en un casete de diálisis con un corte de peso molecular 3,5 kDa.
      5. Sumergir el casete en un vaso de precipitados de vidrio de 500 ml que contiene 500 ml de agua doblemente destilada y una barra de agitación magnética.Coloque esto sobre un agitador magnético y se dializa durante una noche (16 horas) a 4 ° C (en un cuarto frío) para eliminar todas las trazas de bromuro de cianógeno y ácido fórmico.
      6. Usar una jeringa desechable de 1 ml para transferir la solución dializada BM de la casete en un tubo de 1,5 ml.
      7. Analizar 25 l de cada muestra de la BM en un gel de poliacrilamida v / v 12% ^10,11. Después de SDS-PAGE, llevar a cabo la tinción con plata del gel de poliacrilamida ¹² para visualizar el patrón electroforético de péptidos de bromuro de ^{cianógeno-13} de matriz.
3. El análisis de inmunofluorescencia microscopía
   1. Realizar la tinción de inmunofluorescencia de GLA tratar y controlar geles RBM con anti-AGE / pentosidine, anti-colágeno IV y anticuerpos anti-laminina seguido por microscopía confocal para visualizar los AGE acumulados y colágeno IV / reorganizaciones estructurales de fibra de laminina en el reticulado RBM geles ^13.
      Nota: Utilice siempre un volumen suficiente para cubrir la entire gel de RBM durante las incubaciones y lavados sin tocar la superficie RBM con la punta de la pipeta. Para los detalles de analizar las culturas acinos 3D mediante inmunofluorescencia véase la referencia ⁶ y para microscopía confocal de acinos 3D véase la referencia ^14.
      1. Wash GLA tratada y geles de control GBR en portaobjetos de cámara de 8 pocillos 2 veces con 300 l de PBS + (PBS que contiene 0,1 mM CaCl ₂ y 0,5 mM MgCl ₂₎ durante 5 min a RT.
      2. Retire la PBS + a continuación, añadir 300 l de 4% w / v paraformaldehído (PFA) diluido en PBS + para cubrir cada gel RBM. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente para fijar los componentes de gestión por resultados.
      3. Retire el 4% w / v solución de PFA. Añadir añadir 300 l de solución 75 mM _NH4Cl + 0,5 mM MgCl ₂ y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente (repetir 5x) para extinguir la fijación.
      4. Prepare el buffer de inmunofluorescencia (IF buffer) al hacer la siguiente solución en agua estéril: NaCl 130 mM, 7 mM Na ₂ HPO _4, 3,5 mM NaH₂ PO _4, NaN 7,7 mM _3, 0.1% w / v albúmina de suero bovino, 0,5% v / v de polietileno glicol terc-octilfenil éter y 0,05% v / v de polietileno glicol monolaurato de sorbitán.
      5. Preparar tampón de bloqueo SI SI completándolo tampón con 20% de suero de cabra v / v.
      6. Eliminar la solución de enfriamiento y añadir 300 l de tampón de bloqueo SI a los geles de RBM para evitar reacciones no específicas. Se incuba 2 horas a temperatura ambiente en una plataforma de agitación.
      7. Retire el amortiguador de bloqueo SI e incubar los geles GBR para 16 horas a 4 ° C con 300 l de anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo SI (1: 500 de ratón anti-pentosidine mAb; 1/250 de conejo anti-colágeno IV pAb; 1 / 250 de conejo anti-laminina A / C pAB).
         Nota: Las incubaciones durante más de 20 horas a 4 ° C puede licuar la RBM.
      8. Retire el anticuerpo primario y lavar 3 veces (10 min cada una) con 300 l de tampón IF a temperatura ambiente en una plataforma de agitación.
      9. Eliminar el tampón IF yañadir 300 l de anticuerpo secundario (de cabra anti-conejo o anti-IgG de ratón [H + L]) conjugado con un fluorocromo diluido 1: 500 en tampón de bloqueo SI. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente en una plataforma de agitación.
      10. Eliminar el anticuerpo secundario e incubar en 300 l de tampón de IF de 10 min a temperatura ambiente. Retire el tampón IF y lavar 3 x 10 min en 300 l de PBS + a temperatura ambiente.
      11. Fijar y apagar una segunda vez, como se describió anteriormente (Pasos 2.3.1.2 y 2.3.1.3).
      12. Montar geles teñidos RBM en los medios de montaje y analizar la formación de densos paquetes de componentes principales utilizando epifluorescente o microscopía confocal.
          Nota: Para más detalles sobre el análisis de las culturas acinos 3D mediante inmunofluorescencia, véase la referencia ⁶ y para epifluorescencia y microscopía confocal de acinos 3D, véase la referencia ^14.
4. Análisis reológico
   1. Realizar análisis reométrico de GLA tratar y controlar geles RBM para medir su viscoelasticity (rigidez).
      1. Configurar geles de gestión por resultados que son de 1 mm de espesor en un molde circular con un diámetro de 8 mm. Para ello, colocar un anillo de clonación (8 mm de diámetro) dentro de un pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos y añadir BM solución matriz preparada como se describe en los pasos 1.3-1.6.
         Nota: Para la recapitulación exacta de los geles RBM utilizados para los experimentos, los geles RBM preparados para el análisis reométrico necesario tener la misma área de superficie y grosor que los geles RBM establecidos en las cámaras de 8 pocillos. Los geles RBM analizadas en la Figura 3 fueron de 1 mm de espesor y 8 mm de diámetro.
      2. El tratamiento de los geles de gestión por resultados establecidos en los anillos de clonación con PBS, GLA durante 6 horas y GLA durante 14 horas como se describió anteriormente (Pasos 1.8 a 1.11).
      3. Mida el módulo elástico (E) de los 8 mm de diámetro geles RBM en un reómetro con un 8 mm de placas paralelas geometría dentada, en un rango de 1 a 3% de deformación, a una oscilación de frecuencia fija de 1 Hz y una temperatura de 21 ° C. Para detalles adicionales sobre elanálisis reométrico de los geles de ECM ver referencias ver ^13,15,16 referencia.
         Nota: E se determina a partir del módulo de almacenamiento de cizallamiento resultante (G ') a través del uso de la siguiente ecuación E = 2 * G' * (1 + v) donde v es la relación de 0,5 de Poisson, como se describe en referencia ^{13,15 , 16.}

3. Cultura y manejo de la línea normal PEC, RWPE-1

1. Se cultivan las células en medio libre de suero de queratinocitos (KSFM) suplementado con 5 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 50 mg / ml de extracto de pituitaria bovina (BPE) y 50 U / ml de penicilina con 50 mg / ml de estreptomicina 1 RWPE-( completar KSFM).
   Nota: Para evitar la inducción de la transición epitelio-mesenquimal (EMT) -al igual que la transición no exponga células RWPE-1 al suero. Permitir completa KSFM para llegar a la temperatura ambiente durante 30 minutos después de la eliminación del almacenamiento a 4 ° C y no lo caliente en un baño de agua a 37 ° ya que esto inactivar el EGF y BPE.
2. Aspirar la completaKSFM de una placa de ² cm confluente de las células 10 RWPE-1, enjuague con 5 ml de PBS precalentado y añadir 5 ml de 0,05% v / v de tripsina de asegurar que todas las células están cubiertas con la solución.
   1. Colocar las células en un incubador de cultivo de tejido fijado en condiciones estándar de 37 ° C y 5% de CO ₂ (con humidificación) durante 5 a 10 min. Comprobar el grado de tripsina después de 5 minutos y golpear suavemente la placa de cultivo para separar las células.
      Nota: Las celdas RWPE-1 no toleran largos períodos de tratamiento con tripsina por lo que se aconseja no manejar más de dos platos al mismo tiempo. También es importante para disociar todas las células de la placa para evitar la selección clonal.
3. Cuando todas las células RWPE-1 han disociado, añadir 5 ml de PBS caliente que contienen 2% v v de suero / ternera fetal (FCS) para inactivar la tripsina. pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo para romper los agregados de células antes de transferir las células a un tubo de centrífuga.
4. Centrifugar las células disociadas a 125-150 xg durante 5 min a 25 ° C, desechar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento de células en 5 ml de completa KSFM hasta que se obtiene una suspensión de células individuales.
5. Transferir 1 ml de las células resuspendidas en un nuevo tubo y añadir 9 ml de completa KSFM para propagar las células a una dilución 1: paso 5 para uso experimental posterior. Contar el resto de las células utilizando un hemocitómetro para la creación de acinos (véase la Sección 5.1).
   NOTA: NO cultivo células RWPE-1 durante más de 10 pasajes desde después de períodos prolongados de la cultura, no formen acinos con la arquitectura correcta.
6. Cambiar los medios de cultivo cada 48 horas para asegurar el EGF y BPE permanecen activos.
   Nota: Integrar este cambio de medio de cualquier tratamiento que se extienden más allá de 48 horas.

4. Cultura y manejo de la línea celular HPB, HPB-1

1. células de cultivo de la HBP-1 en medio RPMI 1640 complementado con 5% v / v de FCS, 50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina. Se calienta lamedios de cultivo, PBS y 0,25% w / v solución de tripsina-EDTA 0,53 M a 37 ° C antes de su uso.
   Nota: Las células también pueden ser cultivadas en medios con 2,5% v / v FCS ^8.
2. Aspirar los medios de cultivo de una placa confluente cm ² 10 de las células HPB-1 y se lavan las células 2 x con 3 ml de PBS para eliminar todos los rastros de medios de cultivo con suero que pueden inactivar la reacción tripsina.
3. Aspirar el PBS y añadir 3 ml de solución de tripsina-EDTA para cubrir las células. Colocar la placa en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO ₂ (con humidificación) durante 5 min. Eliminar la solución de tripsina-EDTA cuando las células son redondas, pero permanecen unidos al plato. Lavar las células con 5 ml de PBS.
4. Después de eliminar el PBS, añadir 5 ml de medio de cultivo y suavemente la pipeta hacia arriba y abajo para producir una suspensión de células individuales. Transferir las células a un tubo de 15 ml.
5. Tomar 2 ml de la suspensión celular en un nuevo tubo de centrífuga con 8 ml de medio completo y la placa de las células HPB-1 ONTOA 10 cm ² placa de cultivo a una dilución 1: paso 5 para uso experimental posterior. Contar el resto de las células utilizando un hemocitómetro para la creación de acinos (ver sección 5.2).
   Nota: Mantenga un registro del número de pases, ya que las células más viejas HPB-1 no forman acinos con una arquitectura adecuada. no se desea un número de pases más de 10.
6. Cambiar los medios de cultivo cada 72 horas.

5. Cultura 3D de Próstata Acini sobre la GBR nativo y rígido

1. Si se utilizan células RWPE-1 para formar acinos, diluir 5.000 células preparados en la etapa 3.5 en 300 l de completa KSFM suplementado con 2% v / v de la solución de BM.
2. Si se utilizan células HPB-1 para formar acinos, diluir 2.500 células preparadas en el paso 4.5 en 300 l de RPMI 1640 medio de cultivo suplementado con 2% v / v de la solución de BM.
   Nota: Las celdas de la HBP-1 son más grandes que las células RWPE-1 para un menor número de células de HPB-1 se utilizan para obtener una distribución similar de los acinos después de 6 días de cultura.
3. Semilla suavemente las células sobre la RBM nativa y AGE-rígido y con cuidado colocar las culturas en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO ₂ (con humidificación) para asegurar una distribución uniforme de crecimiento acinos en el pozo y que cada célula se divide para producir un acina.
4. Cada 2 días sustituyen a los medios de cultivo con medio de cultivo fresco que contenía solución v / v BM 2% para asegurar que las células han requerido de los factores de crecimiento para acina normales homeostasis.
5. Monitorear la morfología acinares en cultivos en crecimiento mediante microscopía de campo claro ^13.
   Nota: Después de 3 días en cultivo las células individuales formarán un grupo de> 3 células y después de 1 semana acinos glándula de la próstata con un diámetro de ~ serán observado 50 micras.
6. Siga protocolo descrito en 2.3 para realizar inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos para marcadores de adherencias célula-matriz, adherencias célula-célula, polaridad apico-basal y la invasividad ^13.
   1. Utilice un medio de montaje con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) o incluir un paso adicional (después de 2.3.12) para teñir los núcleos celulares por incubación con DAPI durante 5 minutos y lavar 2 x 5 minutos con PBS +.

6. Cultura 3D de próstata Los agregados de células tumorales en la GBR nativo y rígido

1. células de cultivo de PC3 en RPMI 1640 que contiene 10% v / v de FCS y 50 U / ml de penicilina con 50 mg / ml de estreptomicina. Calentar los medios de cultivo, PBS y 0,25% w / v solución de tripsina-EDTA 0,53 M a 37 ° C antes de su uso.
2. Aspirar el medio de cultivo de una placa de cultivo confluente 10 cm ² de células PC3 y se lavan las células 2 veces con 3 ml de PBS para eliminar todos los rastros de FCS que pueden interrumpir la reacción tripsina.
3. Aspirar el PBS y añadir 3 ml de solución de tripsina-EDTA para cubrir las células y se incuba durante 1 min.
4. Cuando las células se redondean, pero permanecer unidos a los plato, aspirar cuidadosamente la solución de tripsina-EDTA y se lava con 3 ml de PBS aeliminar todo rastro de tripsina.
5. Después de eliminar el PBS, añadir 5 ml de medio de cultivo y suavemente la pipeta hacia arriba y abajo para producir una suspensión de células individuales. Transferir las células a un tubo de 15 ml.
6. Tomar 1 ml de la suspensión de células PC3 en un nuevo tubo de centrífuga y añadir 9 ml de medio de cultivo. Placa de las células en una placa de 10 cm ² de cultivo (dilución 1:10) para uso experimental posterior. Contar las células restantes utilizando un hemocitómetro.
7. Diluir 2.500 células PC3 preparados en la etapa 6.6 en 300 l de RPMI 1640 medio de cultivo suplementado con 2% v / v de la solución de BM para permitir la formación de un gel de gradiente en el cultivo.
8. Sembrar suavemente las células sobre la RBM nativa y AGE-rígido y se coloca cuidadosamente la cultura en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO ₂ (con humidificación) para asegurar una distribución uniforme de la creciente esferoides en el pozo.
9. Cambiar los medios de cultivo cada 72 horas.
10. Para estudiar el efecto de la GBR (EDAD-rica) rígidosobre la migración de las células tumorales de próstata, células PC3 de imagen utilizando microscopía de campo claro de vídeo de lapso de tiempo utilizando la temperatura / _CO2 de control y una cámara húmeda ^17.
    Nota: Las células PC3 crecen en mechones sobre la GBR nativa y no formen acinos con un lumen, pero si se deja de crecer más de 72 horas sobre la GBR nativa van a formar esferoides 3D.
11. Después de la adquisición de datos, seguimiento manual de las células PC3 y calcular su velocidad de migración, la forma (relación de alargamiento) y la persistencia de la migración ^17-19.
    Nota: Persistencia = relación D / T, D = distancia desde el principio hasta el final de la trayectoria celular, T = longitud total de la trayectoria de la célula.

Resultados

3D de próstata cultivadas en Acini rígido RBM

Después de 6 días de cultivo, los PEC derivadas de tejido normal de la próstata (RWPE-1) (Figura 1A) y tejido de BPH (HPB-1) (Figura 1B) forma acinos en nativo (tratados con PBS) RBM que se organiza en esferoides uniformes de epitelio Células. Estos acinos también tienen las características de los PEC altamente organizados con el espacio-apical-basal de polaridad y una luminal visibles ^13,20.

El acinos formado por los PEC derivados de tejido de la próstata normal (RWPE-1) (Figura 1A) y el tejido BPH (BPH-1) (Figura 1B) en rigidizadas RBM (-AGE rico) (tratado con GLA) tener una arquitectura interrumpido (desplazando desde esferoidal de forma poligonal y las células que sobresale / migración de los acinos a la era rica en RBM) (Figura 1A). Estas acinos se caracterizan también por los PEC altamente desorganizado que han perdido su polaridad apical-to basal con una pequeña o inexistente espacio luminal ^13.

Figura 1:. Próstata células epiteliales cultivadas como 3D glandular Acini en la membrana reconstituido sótano nativo y rígido (GBR) (A) Imágenes de campo claro de células RWPE-1 se cultivaron durante 12 horas hasta 6 días en geles de RBM tratados con PBS (nativo) o glicolaldehıdo 50 mM durante 14 horas (AGE-rica; rígida); Barra de escala = 50 micras. (B) células de HPB-1, que se cultiva como se describe en el panel A; Barras de escala = 50 m; los datos son representativos de 3 experimentos independientes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Tabla 1:. Características de próstata epitelial RWPE-1 acinos Cultivado en las Nativo, semi-rígido y rígido membrana reconstituido sótano (RBM) RWPE-1 acinos se cultivaron en RBM pre-tratados con PBS durante 14 horas (nativo), glicolaldehıdo (GLA ) durante 6 horas (semi-rígido) o GLA durante 14 horas (rígida). Por forma acinar, el porcentaje (%) ± desviación estándar (SD) de vuelta, acinos semi-poligonal y poligonal se calcularon a partir de 5 experimentos independientes (50 acinos cuantificaron por condición). acinar tamaño relativo se calculó (RBM nativa = 100%) de 3 experimentos independientes. Para invasividad,% ± SD acinos con una o más células que sobresalen se calcula a partir de 3 experimentos independientes. factor de cambio se calcula dividiendo el valor medio obtenido en condiciones semi-rígidas o rígidas por el valor correspondiente para condiciones nativas. Los valores de p calculados utilizando la prueba t de Student (α = 0,05).

ontenido "fo: keep-together.within-page =" 1 "> dependen de la edad mayor rigidez RBM promueve la migración de células tumorales de próstata PC3

Células PC3 cultivadas en RBM nativa migran al mantener contacto célula-célula continua, mientras que las células PC3 cultivadas en AGE-rica (rígida) RBM se mueven independientemente uno del otro (Figura 2A). Después de 72 horas en cultivo de células PC3 formar focos (esferoides) el nativo (tratados con PBS) GBR, mientras que las células PC3 sobre rígida RBM (EDAD-rica) No de esferoides y migrar de forma independiente (Figura 2B). Células PC3 sobre la RBM (EDAD-rica) rígidas son más alargada que las células PC3 cultivadas en RBM nativa (Figura 2C). En células PC3 rígida RBM migran más rápidamente que las células PC3 cultivadas en RBM nativa (Figura 2D). En células PC3 rígida RBM muestran una disminución de la persistencia en comparación con las células PC3 cultivadas en RBM nativa (Figura 2E).

Figura 2:. La migración de próstata de células tumorales en la membrana reconstituido sótano nativo y rígido (GBR) (A) Imágenes de campo claro de células PC3 cultivadas en geles de RBM tratados con PBS (nativo) o glicolaldehıdo 50 mM durante 14 horas (AGE-rica, rígido) . Las células fueron imágenes utilizando un microscopio de campo claro (objetivo 10X) y una tasa de adquisición de imagen 1 por hora durante 12 horas seguido de la célula de seguimiento para generar trayectorias. Imágenes mostrados corresponden a los puntos de tiempo después de 0, 3, 6, 9 y 12 hr. Trayectorias de células individuales se muestran para el punto de tiempo 12 horas. Barra de escala = 100 micras. Células (B) PC3 cultivadas en RBM nativa o rígido durante 72 horas, y la imagen como se describe en el panel (A). Barra de escala = 100 micras. Detalle muestra el área asignada a la ampliación de 2x. (C) Media ± SD longitud de la célula (m); diferencia significativa entre la GBR nativa y rígido RBM (p = 1,2 x 10 ^-23). ( (E) Media ± SD persistencia del movimiento de las células (relación D / T, donde D = distancia desde el principio hasta el final de la trayectoria celular, T = longitud total de la trayectoria celular); diferencia significativa entre la GBR nativa y rígido RBM (p = 0,0007). Para los paneles se analizaron CE> 10 células, los datos son representativos de 3 experimentos independientes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Un protocolo para la generación de 3D ​​acinos glandulares de MECs en geles de RBM puros ⁶ fue modificada en un estudio previo de la adición de 4 mg tipo / ml de colágeno I a la matriz de la GBR. La adición de colágeno resultó en el módulo de elasticidad del gel RBM pasando de 175 ± 37 a 1589 ± 380 Pascales. Este aumento de 9,1 veces en la rigidez modula el crecimiento, la supervivencia, migración y diferenciación de MEC ^21. El protocolo fue modificado de nuevo mediante la inclusión de una etapa de tratamiento con D - (-) - ribosa para promover la reticulación no enzimática del colágeno tipo I que se había añadido al gel de la GBR. Se encontró que el aumento de 15 veces resultante en la rigidez a cooperar con la transformación oncogénica de MECs para promover su comportamiento invasivo ^22. El enfoque experimental de tipo adición de colágeno I a geles RBM facilita la interacción directa de MECs con fibras de colágeno, que sólo se produce en el tejido humano después de la barrera física entre el estromay el epitelio proporcionada por el BM se somete a la degradación proteolítica. Mediante la generación de los acinos glandulares 3D a partir de los PEC en geles de RBM puros pre-tratados con GLA, el protocolo actual abre el camino para estudiar cómo BM rigidez per se puede desencadenar su comportamiento invasivo (Figura 3). Los niveles de rigidez BM inducidas en este protocolo tienen relevancia fisiológica. La incubación con GLA 50 mM durante 6 hr y 14 hr aumentó, respectivamente, los módulos de elasticidad del gel RBM puro a 175 ± 90 y 322 ± 160 en comparación con 122 ± 55 Pascales en geles de RBM tratados con PBS (Tabla 1). Este aumento de 1,7 a 3,2 en la GBR rigidez recapitula el aumento de 2,5 a 3,4 veces en la rigidez observada en comparación con maligna de la próstata normal o tejido de BPH ^23-26. Como se describe en una publicación reciente ¹³ los cambios morfológicos inducidos por la acumulación de AGE y la rigidez de gestión por resultados en el PEC acinos se puede cuantificar por un cambio estadísticamente significativo del arundada de forma poligonal, disminución de células que migran desde la que sobresalen en el acina-AGE rica RBM (Figura 3) luminal / área total de los acinos e. Inmunotransferencia también se puede utilizar para evaluar los marcadores de EMT (por ejemplo, pérdida de E-cadherina ¹³⁾ y el comportamiento contráctil (por ejemplo ligera de la miosina fosforilada cadena-2, pMLC2 ¹³⁾ en los PEC cultivadas en normal frente rígida RBM (Figura 3). La evaluación adicional utilizando la tinción de inmunofluorescencia y microscopía confocal se puede aplicar a visualizar el BM (por ejemplo, laminina, colágeno IV y la acumulación de AGE ^13), celular polaridad apical a-basal (por ejemplo, la localización apical de EEA1: antígeno endosomal temprano 1; y GM130: 130 kDa marcador de Golgi ^cis-13) y los patrones celulares de moléculas de adhesión (por ejemplo, e-cadherina localización de uniones célula-célula ¹³⁾ (Figura 3).

Figura 3:. Visión general de los diferentes protocolos que aquí se presenta el diagrama describe cómo preparar y endurecer la membrana basal reconstituida (RBM) con glicolaldehıdo (reacción de Maillard), la forma de sembrar las células a la rigidez de gestión por resultados, la forma de analizar la rigidez RBM ( extensión de la reacción de Maillard) y los procedimientos que se pueden utilizar para analizar los cambios celulares y moleculares inducidos por la GBR-AGE rico. AGE, productos finales de glicación avanzada; BM, la membrana basal; DAPI, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol; EEA1, antígeno temprano endosomal 1; GAPDH, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; GLA, glicolaldehıdo; GEE, éster etílico de glicina; GM130, 130 kDa marcadores cis-Golgi; p-MLC2 (Thr18 / Ser19), miosina de cadena ligera 2 fosforilada en sitios de treonina y serina 18 19; RBM, membrana basal reconstituida; SDS-PAGE, dodecil sulfato de electroforesis en gel de poliacrilamida de sodio. Para la barra RWPE1 acinos de escala = 10 micras; para las células tumorales PC3Barra de escala = 100 micras esferoides. Esta cifra ha sido modificado de referencia ^13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

pasos para solucionar problemas serán necesarias si D - (-) - ribosa es elegido como el agente de reticulación de la GBR. Durante el desarrollo del protocolo se encontró que el tratamiento con 1 M D - (-) - ribosa durante 72 horas, como se describe anteriormente para los geles de la GBR / colágeno ^22, dio lugar a la deshidratación y la contracción de los geles de la GBR. La evaluación de las concentraciones más bajas de D - (-) - ribosa y los tiempos de tratamiento más cortos puede ayudar a superar esta limitación.

Una limitación potencial en futuras aplicaciones del protocolo se podría encontrar en aplicaciones que requieren niveles más altos de la GBR rigidez. Si se utilizan tiempos de incubación más largos y concentraciones más altas de GLA para inducir niveles más altos de la GBR rigidez gel será necesario evaluar si estas condiciones de tratamiento tienen un impacto sobre la supervivencia y la proliferación celular, como se ha descrito previamente ^13. También hay que señalar que la incubación de células RWPE-1 con suero induce una transición EMT-como fenotípica y la exposición a suero o materiales que contienen suero debe ser evitado. Por ejemplo, si los experimentos implican la transfección de interferir corta de ARN oligonucleótidos (siRNA), el procedimiento debe ser optimizado utilizando células RWPE-1 cultivadas en KSFM, sin cambiar las células a los medios bajo transfección suero. Este inconveniente podría comprometer el nivel de silenciamiento génico logra al utilizar siRNA transitoria se acerca en el modelo. Para algunas dianas proteicas se le recomienda emplear shRNA vectores inducibles para el silenciamiento de genes sintonizable y la disminución en los niveles de proteína deseada. Las adaptaciones que incorporan reticulación enzimática por células estromales o células tumorales lisil oxidasa asociada (LOX) ¹⁷ también se podrían incorporar en los modelos futuros.

jove_content "> Este protocolo facilitará el estudio futuro de los mecanismos pro-invasivas provocadas por la edad que dependen rigidez BM en los PEC (RWPE-1, HPB-1) y la evaluación de los objetivos anti-metastásicos en los PTC invasivos (PC3). Teniendo en cuenta que la HPB se considera que es un trastorno metabólico ^27, este protocolo también allana el camino hacia nuestra mejor comprensión de la relación entre los trastornos metabólicos y aumento del riesgo de cáncer de próstata. Teniendo en cuenta que la rigidez BM inducida por su exposición a los AGE puede ser un desencadenante de invasividad en otro tipo de cáncer tipos, que serán de interés para utilizar el protocolo para establecer modelos similares que incorporan células epiteliales normales y células tumorales de otros órganos (por ejemplo, mama, colon, ovarios, páncreas).

Los pasos críticos en el protocolo, junto con sus tiempos, se resumen en la Figura 4. Durante la etapa inicial, es esencial para mantener la solución madre de la GBR a 4 ° C, mientras que se descongele para evitar su polymerization. Puntas de pipeta no se deben colocar en la solución de stock rM hasta que se hayan enfriado a 4 ° C. Para el siguiente paso también es importante para asegurar que los portaobjetos de cámara se hayan equilibrado a 4 ° C antes de que se recubren con la solución de la GBR. Tan pronto como la temperatura de la solución se incrementa por encima de la GBR 4 ° C que sufrirá polimerización irreversible para formar un gel. Es esencial que la gestión por resultados no se altera durante la etapa de polimerización para asegurar que forma una superficie plana adecuada para el cultivo de células y análisis microscópico. La duración de la incubación con GLA con o sin inhibidores de la reacción Maillard (cianoborohidruro de sodio y amingoguanidine) determinará la rigidez del gel se convierte en la GBR. Se recomienda el uso de una incubación de 6 h con GLA si se requieren condiciones semi-rígidos, y la incubación 14 h si se requieren condiciones severas (Tabla 1). tiempos de incubación alternativos o concentraciones de GLA se pueden utilizar si diferentes nivelesde la rigidez de los deseados. En este caso el análisis reológico de los geles de RBM ser necesario incorporar como un paso esencial. Después de la etapa de enfriamiento rápido de la reacción de Maillard por incubación con GEE y las etapas de lavado subsiguientes con PBS, los geles RBM se pueden utilizar inmediatamente o se almacenaron a 4 ° C durante un máximo de 48 horas antes de su uso para el cultivo celular. Una vez los cultivos celulares se establecen es importante para cambiar el medio de cultivo (incluyendo cualquier tratamientos) cada dos días. Se recomienda mantener los cultivos de células 3D por 3-12 días de acuerdo con los parámetros objeto de investigación. Para 3D PEC acinos se recomienda analizar los cultivos después de 6 días, y para 3D de PTC esferoides análisis se recomienda después de 3 días de cultivo en la primera instancia.

Figura 4:. Descripción simple del Protocolo con etapas críticas y sincronizaciones indicado la flow diagrama representa cómo preparar y endurecer la membrana basal reconstituida (RBM) con glicolaldehıdo (reacción de Maillard) con pasos críticos y los tiempos indicados. Puntos en los que el protocolo se puede detener, y geles RBM almacena, también se indican. RBM, membrana basal reconstituida; GLA, glicolaldehıdo; GEE, éster etílico de glicina; ON, durante la noche; PBS, solución salina tamponada con fosfato; RT, la temperatura ambiente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
I - Material para cultivo monocapa
BPH-1 Base de datos de	líneas celulares CaP	PCaCL-132	Contacto: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu
Medios completos sin suero de queratinocitos	ThermoFisher Scientific	17005-075	No calentar a 37 º C antes de usar
Suero fetal para terneros	First Link UK Ltd	02-00-850	Tienda en -20 º C en alícuotas
PC3	Colección de cultivos tipo americano	CRL-1435
Penicilina/estreptomicina	ThermoFisher Scientific	15070-063
Tampón de fosfato solución salina (Dulbecco A) comprimidos Oxoid		BR0014G
RPMI 1640 medio	Sigma-Aldrich	R5886	cálido en 37 º C baño de agua antes
de usar RWPE-1	Colección de cultivos tipo americano	CRL-11609
Solución de tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
Name	Company	Número de catálogo	Comments
>II - Material para la cultura 3D
Acetonitrilo	Sigma-Aldrich	271004
Clorhidrato de aminoguanidina	Sigma-Aldrich	396494	Irritante para los ojos, el sistema respiratorio y la piel
Portaobjetos de cámara, 8 pocillos	Thermo Scientific Nunc Lab-Tek	TKT-210-816M
Matriz de cultivo membrana basal reconstituida (rBM) extracto de factor de crecimiento reducido	AMS Biotechnology	3445-005-01	Tienda Membrana basal (BM) en -80 º C en alícuotas Bromuro de
cianógeno	Sigma-Aldrich	C91492	Tóxico por contacto, piel e inhalación
Ácido fórmico	Sigma-Aldrich	695076
Clorhidrato de éster etílico de glicina (GEE)	Sigma-Aldrich	50060	Irritante para los ojos
Dímero de glicoalaldehído (GLA)	Sigma-Aldrich	G6805
Cianoborohidruro de sodio	Sigma-Aldrich	71435	Altamente inflamable; Tóxico por contacto, piel e inhalación
Filtro de jeringa 0,22 micras	Appleton Woods	BC680
Name	Company	Número de catálogo	Comments
>III - Material para cuantificar la reacción de Maillard
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	ThemoFisher Scientific	D3571	sensible a la luz y almacenar a -20 º C en alícuotas
Cilindros de clonación	Sigma-Aldrich	C1059
Cabra anti-ratón IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugado	ThemoFisher Scientific	A-11001	sensible a la luz
Cabra anti-conejo IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugado	ThemoFisher Scientific	A-11034	suero de cabra sensible a la luz
	Abcam	ab7481	Almacenar en -20 º C en alícuotas medios de
montaje Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
clon de ratón anti-pentosidina PEN-12 mAb	TransGenic Inc	KH012
Paraformaldehído (PFA)	Sigma-Aldrich	F8775	Tienda en -20 º C en alícuotas
Anticuerpo policlonal anti-colágeno humano IV de conejo	Tienda de anticuerpos Acris	R1041	en -20 º C en alícuotas
Conejo anti-laminina A/C pAb	Santa Cruz Biotechnology Inc	sc-7292	Tienda en -20 º C en alícuotas Éter
de terc-octilfenilo de polietilenglicol (Triton-X100)	Sigma-Aldrich	T9284
Monolaurato de sorbitán de polietilenglicol (Tween-20)	Sigma-Aldrich	P1379
Casete de diálisis Slide-A-Lyzer	ThemoFisher Scientific	66333
Name	Company	< strong>Número de catálogo	Comments
IV - Equipo
ARG2 reómetro rotacional de deformación controlada	T.A. Instruments
Microscopio Axiovert S100 (aumento de 20X)	Zeiss
microscopio Zeiss Axio S100	Microscopio Solent Scientific
Confocal Axiovert 200M (40X, 63X aumento) Microscopio	Zeiss
Olympus LH50A equipado con una cámara digital con contraste de fase	Olimpo
Espectrofotómetro lector de placas PHERAstar Plus	BMG Labtech
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
V - Software
Image J 1.47v	Instituto Nacional de Salud, Vicios